Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De prevalentie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), is in de laatste decennia gegroeid. Deze leeftijd-geassocieerde aandoeningen worden gekenmerkt door het verschijnen van eiwit-aggregaten met fibrillary structuur in de hersenen van deze patiënten. Precies de reden waarom normaal oplosbare eiwitten ondergaan blijft een aggregatie proces slecht begrepen. De ontdekking dat de aggregatie van eiwitten niet beperkt tot ziekteprocessen is en deel van het normale verouderingsproces schakelt alleen de studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, regelen zonder het gebruik van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten. Hier beschrijven we methoden te onderzoeken die inherent zijn aan eiwit aggregatie in Caenorhabditis elegans door complementaire benaderingen. Ten eerste, we onderzoeken hoe om te groeien van grote aantallen van leeftijd-gesynchroniseerde C. elegans om leeftijd dieren en presenteren we de biochemische procedures voor het isoleren van hoogst-onoplosbare-grote aggregaten. In combinatie met een gerichte genetische knockdown, is het mogelijk om te ontleden de rol van een gen van belang in de bevordering van of voorkomen van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie met behulp van een uitgebreide analyse met kwantitatieve massaspectrometrie of een kandidaat-gebaseerde analyse met antilichamen. Deze bevindingen worden vervolgens bevestigd door in vivo analyse met transgene dieren uiting van TL-gelabeld aggregatie-naar voren gebogen eiwitten. Deze methoden moeten helpen uitleggen waarom bepaalde eiwitten zijn gevoelig voor aggregaat met de leeftijd en uiteindelijk hoe deze eiwitten volledig functioneel te houden.
Inleiding
Eiwit misfolding en aggregatie worden herkend als een stempel van verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals AD, PD, Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Frontotemporale dementie (FTD) en vele anderen. Bijvoorbeeld, α-synuclein assemblages in amyloïde fibrillen die zich ophopen als Lewy organen met name in de substantia nigra van PD-patiënten, terwijl in ALS patiënten TDP-43 of FUS misfold naar formulier cytoplasmatische aggregaten in degenererende motorische neuronen. In elk van deze neurodegeneratieve aandoeningen mislukken mechanismen onderhoud eiwit homeostase of proteostasis om te voorkomen dat de accumulatie van misfolded eiwitten, daarom leiden tot ziekte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Voor een beter begrip van de procedure, een schematische voorstelling van de werkstroom (Figuur 1) is gehecht.
1. de groei van de grote getallen voor jong en ouder C. elegans onderworpen aan het RNAi richten een gen van belang
Opmerking: Gebruik C. elegans temperatuur-geïnduceerde steriele gon-2(q388) mutanten (CF2253) te verkrijgen van grote populaties van de leeftijd-gesynchroniseerd. Tijdens alle stappen is het belangrijk om te werken onder semi-steriele omstandigheden met een open vlam en om te controleren dat er geen verontreinigingen (bijvoor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We gebruikten de methoden die hier gepresenteerd om te evalueren hoe langlevende dieren met een verminderde IIS moduleren leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie. Door Western blot (zie stap 2.2, snel onoplosbaar eiwit extractie voor westelijke vlekkenanalyse), we geanalyseerd het totaal en het onoplosbare eiwitgehalte van jonge (dag 3 van volwassenheid) en leeftijd (dag 18 van volwassenheid) wormen op controle RNAi en op RNAi gericht op de insuline / IGF-1-like receptor- daf-2
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij rapporteren hier een methodologie te isoleren van hoogst-onoplosbaar eiwit-aggregaten van veroudering C. elegans onderworpen aan RNAi voor analyse van de Spectrometrie van de massa en het westelijke bevlekken. We laten zien dat verbetering van de proteostasis doordat IIS sterk leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie voorkomt. Door het selecteren van specifieke aggregatie-naar voren gebogen eiwitten aan overexpress in C. elegans, is het mogelijk om te ontleden verder de mechanismen modulerende inh.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de DZNE en een Marie Curie internationale reïntegratietoelage (322120 naar D.C.D.)
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fernbach kweekfles | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Inhoud 2.800 ml, met 3 bufferingsindelingen |
| Schroefdop met membraan | Schott | 1088655 | GL45 |
| Roterende mixer | VWR | 444-0148 | |
| Trechter | Nalgene | 4300-1000 | Inhoud 1.000 ml |
| 1 ml spuit | BD Plastipak | 300013 | |
| Grijze naald, 27 G x ½ ", 0,4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membraanfilters 0,025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH-strook | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-vrije tabletten |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylfenylpolyethyleenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase vrij |
| RNaseA | Promega | A7973 | oplossing |
| Totale eiwitblotkleuring | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby eiwitblotkleuring |
| Totale eiwitgelkleuring | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby eiwitgelkleuring |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonaat | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Gemodificeerde Trypsine | Promega | V5111 | |
| Isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugale verdamper |
| Fluorescente stereo-microscoop M165 FC | Leica | Met Planapo 2,0x objectief | |
| Dissectiemicroscoop | Leica | Leica S6E | |
| Microscoop met hoge vergroting Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | Met PlanAPOCHROMAT 20x objectief en Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Beeldanalyse software | ImageJ | ||
| Analyse van massaspectrometrie data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli stam | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteriën | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi bibliotheek | ||
| C. elegans mutanten | |||
| CF2253 | CGC, stamnaam: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenen | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
Referenties
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247(2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
