Method Article

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/56464

⸱

November 26th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Protein Aggregation and Aging, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Graduate School of Cellular and Molecular Neuroscience, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prevalentie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), is in de laatste decennia gegroeid. Deze leeftijd-geassocieerde aandoeningen worden gekenmerkt door het verschijnen van eiwit-aggregaten met fibrillary structuur in de hersenen van deze patiënten. Precies de reden waarom normaal oplosbare eiwitten ondergaan blijft een aggregatie proces slecht begrepen. De ontdekking dat de aggregatie van eiwitten niet beperkt tot ziekteprocessen is en deel van het normale verouderingsproces schakelt alleen de studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, regelen zonder het gebruik van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten. Hier beschrijven we methoden te onderzoeken die inherent zijn aan eiwit aggregatie in Caenorhabditis elegans door complementaire benaderingen. Ten eerste, we onderzoeken hoe om te groeien van grote aantallen van leeftijd-gesynchroniseerde C. elegans om leeftijd dieren en presenteren we de biochemische procedures voor het isoleren van hoogst-onoplosbare-grote aggregaten. In combinatie met een gerichte genetische knockdown, is het mogelijk om te ontleden de rol van een gen van belang in de bevordering van of voorkomen van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie met behulp van een uitgebreide analyse met kwantitatieve massaspectrometrie of een kandidaat-gebaseerde analyse met antilichamen. Deze bevindingen worden vervolgens bevestigd door in vivo analyse met transgene dieren uiting van TL-gelabeld aggregatie-naar voren gebogen eiwitten. Deze methoden moeten helpen uitleggen waarom bepaalde eiwitten zijn gevoelig voor aggregaat met de leeftijd en uiteindelijk hoe deze eiwitten volledig functioneel te houden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit misfolding en aggregatie worden herkend als een stempel van verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals AD, PD, Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Frontotemporale dementie (FTD) en vele anderen. Bijvoorbeeld, α-synuclein assemblages in amyloïde fibrillen die zich ophopen als Lewy organen met name in de substantia nigra van PD-patiënten, terwijl in ALS patiënten TDP-43 of FUS misfold naar formulier cytoplasmatische aggregaten in degenererende motorische neuronen. In elk van deze neurodegeneratieve aandoeningen mislukken mechanismen onderhoud eiwit homeostase of proteostasis om te voorkomen dat de accumulatie van misfolded eiwitten, daarom leiden tot ziekte.

Proteostasis is van cruciaal belang om ervoor te zorgen de cellulaire functies en onder normale omstandigheden deze regulerende mechanismen strak controle over het tempo van de eiwitsynthese, vouwen en afbraak. Verschillende studies tonen aan dat met de vergrijzing, de mogelijkheid van vele cellen en organen voor het behoud van eiwit homeostase geleidelijk in het gedrang komt en de fysiologische verslechtering van de netwerken van de proteostasis met de leeftijd is een belangrijke verzwarende factor voor neurodegeneratieve ziekten (herzien in verwijzingen1,2,3). Het feit dat de controle van de kwaliteit van het eiwit en de cellulaire reactie op stress ongevouwen eiwitten in gevaar met de leeftijd komen suggereert dat eiwit misfolding en aggregatie zou een algemene gevolg van veroudering. Inderdaad, wij en anderen hebben aangetoond dat eiwitten aggregatie beperkt zich niet tot ziekte en in plaats daarvan deel van het proteoom zeer wasmiddel-onoplosbaar in leeftijd dieren4,5,6,7 wordt ,8,9,10. Rekentijd en in vivo onderzoek bleek dat deze fysiologische leeftijdsgebonden aggregaten lijken op ziekte aggregaten in verschillende aspecten5. De ontdekking van endogene, leeftijd-afhankelijke eiwitten aggregatie geeft ons de mogelijkheid om te ontleden van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, zonder gebruik te maken van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten reguleren. Op dit moment bestaat slechts beperkte informatie over de regulering van de wijdverbreide eiwit oplosbaarheid en over de gevolgen van deze disregulatie voor de gezondheid van het organisme.

De nematode C. elegans is een van de meest uitgebreid bestudeerde modelorganismen in onderzoek veroudering en deze dieren hebben een relatief korte levensduur vele karakteristieke veroudering eigenschappen waargenomen in hogere organismen tonen. De effecten van veroudering op de oplosbaarheid van eiwitten zijn bestudeerd in C. elegans door sequentiële biochemische fractionering gebaseerd op differentiële oplosbaarheid, die veel gebruikt wordt om uit te pakken van ziekte aggregaten op het gebied van neurodegeneratie onderzoek11 . Door kwantitatieve massaspectrometrie, werden verscheidene honderden eiwitten tot aggregatie-naar voren gebogen in C. elegans in de afwezigheid van ziekte5getoond. Hier beschrijven we in detail het protocol om te groeien van grote aantallen wormen in vloeibare cultuur en de sequentiële winning isoleren geaggregeerde eiwitten voor kwantificering massaspectrometrie en analyse door westelijke vlek. Omdat misfolded en aggregatie-naar voren gebogen eiwitten zich in leeftijd ophopen C. elegans gonaden en maskers veranderingen in andere somatische weefsels5,12,13, gebruiken we een mutant gonaden-minder te richten de analyse op eiwit oplosbaarheid in niet-reproductieve weefsels. De methode gepresenteerd maakt de analyse van zeer onoplosbare, grote aggregaten die onoplosbaar in 0,5% SDS en Ingehuld door relatief lage centrifugaal snelheid. U kunt ook een minder strenge extractie-protocol verzamelen ook kleinere en meer oplosbare aggregaten is gepubliceerd elders10. Daarnaast beschrijven we de methode gebruikt om te beoordelen aggregatie in vivo in C. elegans.

Over het algemeen kunnen deze methoden in combinatie met RNA-interferentie (RNAi) de rol van een gen van belang bij het moduleren van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie evalueren. Hiervoor beschrijven we de analyse van de fragmenten van jonge en oude wormen met en zonder knockdown van een specifieke proteïne van belang met behulp van RNAi. Deze methoden moeten een krachtig hulpmiddel om te bepalen welke onderdelen van het netwerk proteostasis reguleren eiwit oplosbaarheid. Verschillende interventies zoals verminderd insuline/insuline-achtige groei factor (IGF) 1 signalering (IIS) is gebleken dat C. elegans veroudering14dramatisch te vertragen. Levensduur trajecten veroorzaken vaak eiwit-kwaliteit controlemechanismen en dus deze trajecten kunnen worden actief beïnvloeden het tarief van aggregatie van eiwitten. Als voorbeeld tonen we verminderde inherente eiwit aggregatie in langlevende dieren op remming van het traject van IIS7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: Voor een beter begrip van de procedure, een schematische voorstelling van de werkstroom (Figuur 1) is gehecht.

1. de groei van de grote getallen voor jong en ouder C. elegans onderworpen aan het RNAi richten een gen van belang

Opmerking: Gebruik C. elegans temperatuur-geïnduceerde steriele gon-2(q388) mutanten (CF2253) te verkrijgen van grote populaties van de leeftijd-gesynchroniseerd. Tijdens alle stappen is het belangrijk om te werken onder semi-steriele omstandigheden met een open vlam en om te controleren dat er geen verontreinigingen (bijvoorbeeld met schimmels of bacteriën) aanwezig zijn. Voer de stappen (ook centrifugations) bij kamertemperatuur, indien de temperatuur wordt niet beschreven.

  1. Bereiding van C. elegans gon-2(-) mutanten te verkrijgen gonaden-minder dieren
    Opmerking: Voor het verkrijgen van steriele dieren gonaden ontbreekt, de verlies-of-function mutatie moet worden geïnduceerd in de moederdieren door verschuift deze bij de laatste larvale stadium (L4) tot 25 ° C om te voorkomen dat de bijdrage van de moeders.
    1. Eerste uitbreiding van de gon-2(-) dieren te verzamelen van ouderlijke generatie voor temperatuur verschuiving
      1. Streak Escherichia coli OP50 stam op een bord lysogenie Bouillon (LB) en het 's nachts Incubeer bij 37 ° C.
      2. De volgende dag beënten 200 mL LB medium met een kloon van de OP50 en het 's nachts Incubeer bij 37 ° C.
      3. De volgende dag zaad 15 hoge groei (HG) middellange platen (diameter 9 cm) met 0,5 mL OP50 en OP50 te verspreiden met een spatel. Houd de platen bij kamertemperatuur voor twee dagen.
      4. Gon-2(-) dieren (niet uitgehongerd voor de laatste twee generaties) stuk op middellange borden 15 HG bezaaid met OP50 en handhaven bij 20 ° C tot de platen confluente met volwassenen worden en sommige OP50 nog steeds beschikbaar is.
      5. In de tussentijd zaad 60 HG middellange platen met OP50 zoals beschreven in stap 1.1.1.3 en houden de platen bij kamertemperatuur. Voorzichtig: Geplaatste platen moeten niet worden gehouden voor meer dan een week als de agar bij kamertemperatuur kraken zullen.
      6. De confluente platen bleekmiddel zodra de meeste volwassenen starten om eieren te leggen als eerder beschreven15. Verzamelen van eieren in twee 15 mL-buizen en plaats op een nutating mixer's nachts bij 20 ° C.
      7. De volgende dag wassen uitgebroed L1s met M9 buffer (85 mM NaCl, 42 mM nb2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4): centrifuge op 3000 x g voor 30 s, negeren het supernatant en vul tot de maatstreep aan 15 mL met M9. Centrifugeer, verwijder het supernatant en herhaal de stap 1.1.1.6. Vul de buizen met de resulterende worm pellets tot de maatstreep aan 15 mL met M9.
      8. Het totale aantal L1s met een dissectie Microscoop evalueren door het tellen van de L1s aanwezig in 2 µL druppels op niet-geplaatste agar platen geplaatst. Het gemiddelde van de getallen verkregen ten minste negen druppels.
      9. Het toevoegen van 6.500 L1s per geplaatste HG plaat en laat die de wormen groeien bij 20 ° C tot L4 fase.
    2. Tweede uitbreiding van gon-2(-) dieren te verkrijgen gonaden-minder dieren voor experiment
      1. L4 stadium, verschuiving van de wormen uit stap 1.1.1.9 tot 25 ° C tot ze beginnen om eieren te leggen en L1s zijn broedeieren.
      2. Verzameling van eieren en L1s door sedimentatie
        Opmerking: Na de verschuiving van de temperatuur tot 25 ° C is het beter gebruiken van sedimentatie als een zachte techniek om te scheiden van de kwetsbare eieren en L1s van de volwassenen.
        1. De platen met M9 wassen met behulp van 5 mL M9 per vijf platen. Breng de wormen in 50 mL tubes.
        2. Vul alle buizen tot de maatstreep aan 45 mL met M9, laat het sediment volwassenen voor ongeveer 10 min, verzamelen van elke bovendrijvende substantie in een tube van 50 mL en herhaal deze stap met de pellet. Centrifugeer het supernatant waarin eieren en L1s bij 3000 x g gedurende 1 minuut, laat het sediment L1s gedurende ongeveer 10 minuten en verwijder het supernatant tot 15 mL zitten.
          Opmerking: Dit is een cruciale stap. Verwijder de bovendrijvende substantie te vroeg, niet voor het verzamelen van zo veel L1s mogelijk.
        3. Plaatsen van de buizen met eieren en L1s op een nutating mixer's nachts bij 25 ° C.
  2. Vloeibare cultuur van gonaden-minder dieren te verzamelen van jonge en oude dieren onderworpen aan RNAi gericht op een gen van belang
    Opmerking: De reactie van sommige genen op RNAi kunnen temperatuur afhankelijk als eerder beschreven16. Als alternatief voor RNAi, kan een gemuteerde gen in de achtergrond gon-2(-) worden opgenomen.
    1. Voorbereiding van bacteriën van vloeibaar cultuur
      1. OP50 en RNAi bacteriën (bacteriën produceren van de gewenste dsRNA en bacteriën met de lege vector als besturingselement) voor te bereiden door het enten van 4 L LB medium met 12 mL van de respectieve bacteriecultuur (Voeg een eindconcentratie van 50 µg Mo/mL carbenicillin en 1 mM IPTG aan de RNAi bacteriële culturen) en hen Incubeer bij 37 ° C's nachts bij 180 t/min.
      2. De volgende dag oogst de culturen bij 6.700 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 60 mL ijskoud S basale media (100 mM NaCl, 50 mM kalium fosfaat pH 6, gehouden op ijs). Houden van de drie geresuspendeerde pellets (OP50, controle van RNAi bacteriën en RNAi bacteriën voor het gen van belang) bij 4 ° C tot stap 1.2.2 of 1.2.3.
        Opmerking: Wormen kunnen worden gekweekt op RNAi vanaf L1 stadium (zie stap 1.2.3) of om te voorkomen dat ontwikkelings defecten van de laatste larvale stadium L4 (zie stap 1.2.2).
    2. Vloeibare cultuur voor behandeling met RNAi beginnen eindelijk larvale stadium L4
      1. Voeg 200 mL S basale media in een maatkolf van Fernbach cultuur (capaciteit 2800 mL). Voor een definitieve cultuur volume van 300 mL (zie 1.2.2.4), voeg van 10 mM kaliumcitraat, pH 6, 3 mL Trace metalen oplossing (5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 2.5 mM FeSO4,2MnCl 1 mM, 1 mM ZnSO4, 0.1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL carbendazim en 5 µg Mn/mL cholesterol). Sluit de kolf of fles met een schroefdop membraan. Zie tabel 1 voor recepten van buffers.
      2. De L1s uit de 25 ° C (stap 1.1.2.2.3) nemen en deze overbrengen naar 15 mL tubes. Centrifugeer bij 1.900 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en tellen de L1s per 2 µL zoals in stap 1.1.1.8. Voeg 500.000 L1s in de Fernbach cultuur kolf bereid in de vorige stap.
      3. OP50 (uit stap 1.2.1) evenredig aan het aantal wormen toevoegen. Bijvoorbeeld voor 500.000 wormen Voeg 60 mL OP50.
      4. Volledige worm cultuur met S basale toe zodat het totale volume 300 mL. Incubeer de worm cultuur tot L4 fase bij 25 ° C in een schudden incubator met 150 t/min.
      5. De volgende dag, moet de wormen de grootte van de wild-type L4s. U kunt overschakelen OP50 naar RNAi bacteriën, verzamelen van dieren in zes 50 mL-buizen, laten sediment en verwijder het supernatant. Wassen van de L4s met M9 te verwijderen van de resterende OP50 bacteriën: Centrifugeer bij 1900 x g gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en breng alle L4s in een 50 mL-buis. Tellen de L4s per 5 µL (ten minste negen keer). Twee keer 50.000 L4s zijn nodig voor de jonge worm collectie en twee keer 100.000 L4s nodig zijn voor de leeftijd worm-collectie.
      6. Bereiden vier Fernbach cultuur kolven zoals beschreven in 1.2.2.1. Ook een eindconcentratie van 50 µg/mL Carbenicillin en 1 mM IPTG Voeg aan elke maatkolf toe.
      7. Besturingselement RNAi toevoegen bacteriën en RNAi bacteriën voor het gen van belang (uit stap 1.2.1) proportioneel met het aantal wormen: Voeg 7 mL van de respectieve bacteriën per kolf voor jonge wormen en 14 mL per kolf gedurende de leeftijd wormen.
      8. 50.000 wormen per kolf gedurende de jonge worm collectie en 100.000 wormen per kolf gedurende de leeftijd worm-collectie toevoegen en vult u de culturen met S basale te vullen tot 300 mL. Incubeer de worm culturen (vier in totaal) bij 25 ° C en 150 rpm.
    3. Vloeibare cultuur voor behandeling met RNAi basisgewicht van L1 fase
      1. Bereiden van vier Fernbach cultuur kolven zoals beschreven in 1.2.2.1 en voeg een eindconcentratie van 50 µg Mo/mL carbenicillin en 1 mM IPTG.
      2. Doorgaan met de voorbereiding van de L1s zoals beschreven in 1.2.2.2. In totaal zijn 300.000 wormen nodig om ze opsplitsen in vier kolven.
      3. Besturingselement RNAi toevoegen bacteriën en RNAi bacteriën voor het gen van belang (uit stap 1.2.1) evenredig aan het aantal wormen zoals beschreven in stap 1.2.2.7 en houd ook rekening met de groeifase tussen de fase L1 en L4: Voeg 13 mL van de respectieve bacteriën per kolf voor jonge w ORMULIEREN en 26 mL per kolf gedurende de leeftijd wormen.
      4. Ga verder als beschreven in stap 1.2.2.8.
    4. Onderhoud van C. elegans vloeibare culturen
      1. Regelmatig verzamelen een aliquoot gedeelte van elke vloeibare cultuur en plaats op een glasplaatje (u kunt ook op een agarplaat) om te controleren of er geen verontreinigingen. De sterkte van het bacteriële voedsel in de cultuur met behulp van een Microscoop dissectie, controleren met name tijdens de groeifase. Bereiden 2 L culturen van besturingselement RNAi bacteriën en RNAi bacteriën voor het gen van belang zoals beschreven in stap 1.2.1. Voeg deze aan C. elegans vloeibare culturen indien nodig en houden de rest bij 4 ° C.
      2. Periodiek controleren dat de dieren steriel zijn. De meeste dieren zullen een gonaden niet hebben. Afhankelijk van de doordringendheid van de gon-2 mutatie, sommige kunnen hebben afgebroken gonadale structuren maar geen dieren met eieren moeten worden geobserveerd.
  3. Collectie van jonge en oude wormen onderworpen aan RNAi in vloeibare cultuur
    Opmerking: Alle van de volgende stappen uit voor een vloeibare cultuur kolf maar beide culturen van leeftijdgenoten met controle en RNAi bacteriën voor het gen van belang samen moeten worden verwerkt.
    1. Jonge wormen op dag 2, dag 3 basale niveaus van proteïne oplosbaarheid of verzamelen. Leeftijd wormen moeten worden verzameld (uiterlijk) wanneer de helft van de bevolking is overleden. Om te bepalen dit, worden dood en levend wormen meegeteld in enkele druppels vloeibare cultuur geplaatst op een agarplaat. Ratio's zijn met gemiddeld ten minste negen druppels.
    2. Voorbereiding van de volgende reagentia: 1 L M9, 1 L M9 met 0,01% Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9), en 40 mL 60 gewichtspercenten sacharose in ddH2O. houden de reagentia op ijs.
    3. Giet de wormen uit één kolf in een scheitrechter en laat het sediment wormen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Open de afsluiter en de wormen in een tube van 50 mL te druppelen.
    4. De worm pellet gesplitst in twee 15 mL-buizen samen en centrifugeer bij 1.900 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de wormen, verwijder het supernatant en vullen tot 15 mL met M9. Herhaal het centrifugeren. Tot slot de wormen overbrengen in twee 50 mL tubes en vullen opwaarts naar de totaal volume 20 mL met ijskoude M9.
    5. Voor het verwijderen van bacteriën en dode wormen, voegen de twee 20 mL verdund worm pellets twee 50 mL-buizen gevuld met 20 mL ijskoud 60 gewichtspercenten sacharose. Snel centrifugeren bij 2700 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, 9 versnelling en vertraging 7. Verwijder voorzichtig de bovenste worm laag met een grote pipet (25 mL). Neem maximaal 15 mL (maar minder als er zijn natuurlijk een heleboel dode wormen). Dit direct in 37 mL M9 + Octoxynol-9 zetten (3 buizen per sacharose buis) voorbereid op het ijs. Centrifugeer bij 2700 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, versnelling 9 en vertraging 7.
      Opmerking: Beide moeten ijskoude; de scheiding zal anders niet werken. Meng geen! Omdat sucrose giftig voor de wormen is is het belangrijk snel voor de volgende stap.
    6. Verdeel de pellet in vier 15 mL-buizen en spoel tweemaal met ijskoude M9 + Octoxynol-9: Centrifugeer bij 1.900 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Verwijder de bovendrijvende substantie, opvullen tot 15 mL maatstreep met ijskoude M9 + Octoxynol-9 en herhaal de procedure.
    7. Een keer wassen met ijskoude M9 en combineren de vier buizen twee buizen. Opvullen met M9 bij kamertemperatuur tot een totaal volume van 4 mL in de 15 mL-buizen en draaien op een nutating mixer bij 25 ° C gedurende 40 minuten.
      Opmerking: Dit helpt de wormen te verteren alle resterende bacteriën in de darm. Controleer de wormen onder de Microscoop om te zien dat er geen doden ones.
    8. Wassen de wormen tweemaal met ijskoude M9 + Octoxynol-9, zoals beschreven in 1.3.5. Spoel tweemaal met de M9 en de wormen overbrengen in een buis.
    9. De wormen keer wassen in de buffer van de hoge-zout winning Reassembly (RAB) zonder remmers (0,1 M 4-morpholineethanesulfonic zuur (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic zuur (EGTA), 0.1 mM EDTA, 0.5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl, 0,02 M Natriumfluoride (NaF)) voor de collectie. Verwijder het supernatant zolang er geen geen vloeistof op de top van de worm-pellet.
      Opmerking: Deze stap en de volgende moeten gebeuren snel om te voorkomen dat artefacten in de wormen die veroorzaakt door de hoge zoutconcentratie in de buffer.
    10. Schatten van de omvang van de worm pellet en voeg een gelijk volume van RAB met remmers (2 x Protease Inhibitor Cocktail). Met behulp van een pipet van Pasteur, stellen de wormen en langzaam druppelen in een tube van 50 mL, die de helft gevuld met vloeibare stikstof geplaatst in droog ijs. Laat de vloeibare stikstof verdampen en de bevroren wormen bij-80 ° C worden opgeslagen totdat zij worden verwerkt.
      Let op: Vloeibare stikstof is bij een zeer lage temperatuur; Draag passende bescherming.

2. onoplosbare eiwit extractie met jonge en oude dieren onderworpen aan RNAi gericht op een gen van belang

  1. Verstoring van dieren verzameld in stap 1.3
    Opmerking: Het is belangrijk te voorkomen dat eventuele ontdooien van de monsters van de worm. De mortel met vloeibare stikstof afkoelen en het uitvoeren van de volledige procedure op droog ijs.
    Let op: Vloeibare stikstof is bij een zeer lage temperatuur; Draag passende bescherming.
    1. De bevroren wormen overbrengen in het vooraf gekoelde cement en grind voor 2,5 min.
      Opmerking: Wees voorzichtig tijdens het slijpen: aan het begin, de bevroren wormen zijn in kleine opsommingstekens en het is gemakkelijk om ze te verliezen.
    2. Vloeibare stikstof (ongeveer 100 mL) toevoegen aan het poeder te koelen het opnieuw en slijpen voor een ander 2.5 min. Check met de Microscoop dat de worm lichamen gebroken zijn. Breng het poeder in 2 mL buizen en bewaar ze bij-80 ° C.
  2. Snelle onoplosbaar eiwit extractie voor westelijke vlekkenanalyse
    Opmerking: Gebruik deze methode om het vergelijken van het totale eiwitniveaus voor inhoud en onoplosbare eiwitten tussen de verschillende dagen met en zonder RNAi gericht op het gen van belang. Voer alle stappen uit tot stap 2.2.3 op ijs!
    1. Solubilize 50 mg grond wormen uit stap 2.1 met 150 µL Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% natrium dodecyl sulfaat (SDS), 0,5% natrium deoxycholate (SDO), 1% nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 x Protease Inhibitor Cocktail). Meng de schorsing met behulp van een injectiespuit 1 mL met grijze naald (27 G x ½", 0.4 mm x 13 mm); opstellen van de opschorting 10 keer.
    2. Centrifugeer bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof te verzamelen.
    3. Resuspendeer de pellet in 100 µL RIPA buffer en centrifuge bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, spin kort, en wees voorzichtig te verwijderen van overgebleven bezinken.
    4. Als u wilt solubilize de zeer slecht oplosbaar eiwitten, resuspendeer de pellet in 75 µL ureum/SDS buffer (8 M ureum, 2% SDS, 50 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Voor het analyseren van het totale eiwitgehalte, door de eerste RIPA supernatant uit stap 2.2.2 en het ureum/SDS pellet resuspensie te combineren. Om te verklaren welke volumes zijn opgebruikt voor de winning, moet de totale breuk bevatten tweederde van RIPA supernatant en eenderde van ureum/SDS pellet breuk. Op een kleine 4-12% helling gel, de sterkte van onoplosbare eiwitten door het laden van 9 µL van het ureum/SDS breuk en 4 µL totale gecombineerde eiwit te controleren. Uitvoeren van een totale proteïne vlek kleuring voor het controleren van eiwitniveaus. Door Western blotting met behulp van specifieke antilichamen, controleren of wijzigingen in oplosbaarheid voor afzonderlijke proteïnen gekwantificeerd door massaspectrometrie (zie paragraaf 3).
  3. Onoplosbaar eiwit extractie te isoleren van SDS onoplosbare eiwitten voor massaspectrometrie
    Opmerking: Alle stappen op het ijs.
    1. Weeg er twee keer op droog ijs 350 mg grond wormen per tijdstip en per RNAi bacteriën (jonge en oude wormen, controle RNAi bacteriën en RNAi bacteriën voor gen van belang) in 2 mL buizen.
    2. Toevoegen als u wilt verwijderen de oplosbare eiwitten van hoge-zout, twee volumes van RAB per gewicht (700 µL) met remmers, 1 mM PMSF, 200 U/mL DNase ik, 100 µg/mL RNase A aan elk buis en solubilize van het poeder op het ijs. Opstellen van de schorsing in een spuit van 1 mL (grijze naald, 27 G x ½", 0.4 mm x 13 mm) 15 keer en het uit te broeden op ijs voor 10 min. Centrifuge bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Ga via de vetlaag en verzamelen van het supernatans dat hoge-zout oplosbare eiwitten bevattende diervoeders in een tube van 2 mL per voorwaarde (vier buizen in totaal). Verwijder het vet en verwerpen. Aliquot high-zout oplosbare eiwitten te bevriezen bij-80 ° C.
    3. Als u wilt negeren lipiden, solubilize de pellet met 700 µL RAB met remmers met 1 M sacharose (zonder DNase ik en RNase A). Opstellen van de schorsing in een injectiespuit 10 keer en het uit te broeden op ijs voor 5 min. Centrifuge bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Wees voorzichtig te verwijderen alle supernatant en lipiden en zich ontdoen van hen.
    4. Als u wilt verwijderen van SDS-oplosbare eiwitten, solubilize de pellet met 700 µL RIPA buffer. Opstellen van de schorsing in een injectiespuit 10 keer en Incubeer het 10 min op ijs. Centrifugeer bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Verzamelen van de bovendrijvende substantie met SDS-oplosbare eiwitten en aliquot voor bevriezing bij-80 ° C.
    5. Zwembad twee monsters van elke voorwaarde samen na elke pellet met 500 µL RIPA buffer solubilizing. Opstellen van de schorsing in een injectiespuit 10 keer. Centrifugeer bij 18,400 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Wees voorzichtig om alle bovendrijvende vloeistof verwijderen en verwijderen.
      Opmerking: Het doel van de extractie is te scheiden van de oplosbare eiwitten van de onoplosbare eiwitten. Daarom is het belangrijk om te verwijderen van alle resterende RIPA supernatant alvorens toe te voegen mierenzuur in de volgende stap.
    6. Solubilize van de laatste pellet die zeer slecht oplosbaar eiwitten bevatten met 400 µL 70% mierenzuur en stelt de schorsing in een injectiespuit 20 keer. Incubeer gedurende 20 min op ijs. Centrifugeer bij 50.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C, 3 versnelling en vertraging 5, te verwijderen van de worm cuticula puin. Verzamelen van de bovendrijvende substantie die zeer slecht oplosbaar eiwitten bevat en bevriezen bij-80 ° C.
    7. Dialyse van onoplosbare eiwitfracties voor massaspectrometrie
      Opmerking: Dialyze bij 4 ° C.
      1. Bereiden van 8 L dialyse buffer (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, pH 7.5) en verdeel het om acht 1 L bekers. Plaats van drie membranen (membraanfilters = 0,025 µM) op het oppervlak van de buffer voor elk bekerglas van 1 L.
      2. Per membraan, zorgvuldig laden 65 µL van onoplosbare eiwitten ontbindend in mierenzuur in stap 2.3.6 verkregen. Elke voorwaarde bestaat op zes membranen.
      3. Controleer de pH van een steekproef door het verwijderen van 5 µL en het op een pH-strip toe te voegen. Als de pH-waarde tussen 7 en 8 (ongeveer na 2 h), het monster verzameld door pipetteren zachtjes op en neer. Gebruik ten slotte 10 µL dialyse buffer te wassen van de neerslag uit elk membraan. Bevriezen van de monsters bij-80 ° C.

3. uitgebreide identificatie en kwantificering van veranderingen in de eiwitten oplosbaarheid met leeftijd geïnduceerd door RNAi gericht op een gen van belang

  1. Voorbereiding voor massaspectrometrie analyse
    1. Evalueren de hoeveelheid onoplosbare eiwitten in de dialyzed monsters door het laden van een aliquoot gedeelte op een 4-12% helling gel samen met een referentiemonster van bekende concentratie. Het uitvoeren van een totale proteïne gel kleuring en kwantificeren van het bedrag van de eiwitten met de software van de analyse van een afbeelding. Deze stap is noodzakelijk om te schatten hoeveel trypsine nodig voor de vertering (stap 3.1.4).
    2. Concentreer je de monsters met behulp van een centrifugale verdamper en solubilize de onoplosbare eiwitten in een eindconcentratie van 8 M ureum.
    3. Alkylatie en vermindering
      1. Toevoegen Tris(2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride (TCEP) om een eindconcentratie van 4 mM tot de monsters. Incubeer gedurende 1 uur bij 57 ° C met 300 rpm. Zet de monsters tot op kamertemperatuur.
      2. Iodoacetamide toevoegen aan een eindconcentratie van 8.4 mM. Incubeer het 45 min (kan worden ge¨ uncubeerd 2 h) in het donker bij kamertemperatuur.
      3. Verdun de monsters in 150 mM Ammoniumbicarbonaat te verkrijgen van een eindconcentratie van de 2 M-ureum.
    4. Digest eiwitten met 5% w/w bewerkt trypsine 's nachts bij 37 ° C en 400 rpm.
    5. Laden van een steekproef van de verteerd eiwitten op een 12% SDS gel en het uitvoeren van een totale proteïne gel vlekken om te analyseren als de spijsvertering gewerkt. Als er nog steeds sommige bands aanwezig, herhaal stap 3.1.4 en 3.1.5.
    6. Peptiden vanaf jonge leeftijd controle en en RNAi behandeld C. elegans worden aangeduid met isobaar tags voor relatieve en absolute kwantificatie na instructies van de fabrikant.
      Opmerking: U kunt ook andere methoden voor het labelen van de peptiden of eiwitten kon worden gebruikt voor kwantificering zoals tandem massa codes.
      Opmerking: Massa spectrometrie analyse: Verklein monster complexiteit en peptiden moeten worden gescheiden door sterke cation exchange chromatografie in verschillende fracties voor spectrometrische analyse5. Verschillende massaspectrometers kunnen analyseren isobaar tags voor relatieve en absolute kwantificatie zoals elders beschreven17. De verkregen gegevens moeten worden verwerkt met de juiste software. Over het algemeen kan deze analyse de identificatie van zeer slecht oplosbaar eiwitten en hun wijzigingen op leeftijd en op proteostasis modulatie.

4. in Vivo evaluatie van de invloed van een gen van belang op de aggregatie-patroon tijdens veroudering

  1. Uit de analyse van de Spectrometrie van de massa in sectie 3, selecteer een leeftijd-afhankelijke aggregatie-naar voren gebogen eiwit dat zich in verschillende mate in de dieren onderworpen aan RNAi ophoopt. Genereren van transgene C. elegans lijnen uiting van dit eiwit tagged met een fluorescente proteïne en onder de controle van de respectieve promotor of een weefsel-specifieke promotor (Zie bespreking bij de keuze van een geschikte promotor). Het handhaven van de spanning bij 15 ° C door standaardtechnieken op Nematode groei (NG) platen met OP50 agarvoedingsbodem. Bijvoorbeeld, kozen we voor een worm stam uiting van polyadenylate-bindend-proteïne (PAB-1) gesmolten in de N-terminus aan tagRFP onder de controle van de promotor faryngaal spier pmyo-2.
  2. In vivo beoordeling van wijzigingen in de samenvoeging met de leeftijd op remming van het gen van belang
    1. Één tot twee dagen van tevoren, voorbereiding NG/carbenicillin (Carb) / IPTG platen met een besturingselement (lege RNAi vector L4440) bacteriën en RNAi bacteriën voor de remming van het gen van belang. (Zie voor een gedetailleerde protocol over RNAi in C. elegans JoVE Science Education Database. Essentials van biologie 1: gist, Drosophila en C. elegans. RNAi in C. elegans. JoVE, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
    2. Voor de behandeling van RNAi van L1 scheiden plaats ei leggen wormen op verscheidene kleine NG/Carb/IPTG (6 cm diameter) platen bezaaid met besturingselement RNAi of RNAi bacteriën voor het gen van belang bij 20 ° C. Verwijderen van de volwassenen na 2U, houden de nakomelingen bij 20 ° C. Voorkom developmental gebreken, mag RNAi behandelingen na het larvale stadium van L4 worden begonnen.
    3. Zodra de nakomelingen het larvale stadium van L4 bereikt, breng deze L4s op nieuwe NG/Carb/IPTG platen bezaaid met besturingselement RNAi of RNAi bacteriën voor het gen van belang. Negen platen met 15 transgenics voor beide voorwaarden instellen en houd ze bij 20 ° C. De veroudering wormen moeten worden overgebracht uit de buurt van hun nakomelingen aan nieuwe platen elke tweede dag tot het einde van hun reproductieve periode te kunnen om ze te onderscheiden van hun nakomelingen.
    4. Evalueren van veranderingen in de verdeling van de aggregatie-naar voren gebogen proteïne aangeduid met een fluorescerende tag onder een fluorescente stereomicroscoop met 24 x vergroting tijdens volwassenheid, om de andere dag.
      Opmerking: De accumulatie van de leeftijd-afhankelijk van de aggregatie-naar voren gebogen proteïne in heldere puncta wordt gebruikt als een uitlezing voor aggregatie. Deze puncta moet zeer immobiele structuren worden gekarakteriseerd als aggregaten. Dit moet worden bepaald door het herstel van de fluorescentie na photobleaching (FRAP) met behulp van de confocal microscopie. Voor geaggregeerde eiwit, moet geen herstel worden nageleefd in de gebleekte regio na ten minste 4 min5,18. Om te kwantificeren van de veranderingen met de leeftijd, we de distributiepatronen scoorde in de leeftijd-gesynchroniseerde wormen PAB-1 overexpressing op dag 7 van volwassenheid als de volgende dag 2 en dag 5: lage niveaus van aggregatie (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta in achterste faryngaal lamp), middellange aggregatie niveaus (meer dan 10 puncta in de achterste faryngaal bol), en hoge aggregatie niveaus (meer dan 10 puncta in de voorste faryngaal bol).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We gebruikten de methoden die hier gepresenteerd om te evalueren hoe langlevende dieren met een verminderde IIS moduleren leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie. Door Western blot (zie stap 2.2, snel onoplosbaar eiwit extractie voor westelijke vlekkenanalyse), we geanalyseerd het totaal en het onoplosbare eiwitgehalte van jonge (dag 3 van volwassenheid) en leeftijd (dag 18 van volwassenheid) wormen op controle RNAi en op RNAi gericht op de insuline / IGF-1-like receptor- daf-2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij rapporteren hier een methodologie te isoleren van hoogst-onoplosbaar eiwit-aggregaten van veroudering C. elegans onderworpen aan RNAi voor analyse van de Spectrometrie van de massa en het westelijke bevlekken. We laten zien dat verbetering van de proteostasis doordat IIS sterk leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie voorkomt. Door het selecteren van specifieke aggregatie-naar voren gebogen eiwitten aan overexpress in C. elegans, is het mogelijk om te ontleden verder de mechanismen modulerende inh...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de DZNE en een Marie Curie internationale reïntegratietoelage (322120 naar D.C.D.)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fernbach kweekfles Corning4425-2XLPyrex, Inhoud 2.800 ml, met 3 bufferingsindelingen
Schroefdop met membraan Schott1088655GL45
Roterende mixerVWR444-0148
TrechterNalgene4300-1000Inhoud 1.000 ml
1 ml spuit BD Plastipak300013
Grijze naald, 27 G x ½ ", 0,4 mm x 13 mmBD Microlance 3300635
Membraanfilters 0,025 µMMilliporeVSWP04700
pH-strookMachery-Nagel92110pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor CocktailRoche4693132001Complete Mini EDTA-vrije tabletten 
Octoxynol-9 ApplichemA1388Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichM1317
NonylfenylpolyethyleenglycolApplichemA1694Nonidet P40 (NP40)
DNaseIRoche04716728001recombinant, RNase vrij
RNaseAPromegaA7973oplossing
Totale eiwitblotkleuringThermofisherS11791Sypro Ruby eiwitblotkleuring
Totale eiwitgelkleuringThermofisherS12001Sypro Ruby eiwitgelkleuring
TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride)Serva36970
IodoacetamideServa26710
AmmoniumbicarbonaatSigma-Aldrich09830
Sequencing Grade Gemodificeerde TrypsinePromegaV5111
Isobare tags voor relatieve en absolute kwantificeringSciex4352135iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XPBeckmann Coulter393126
Ultracentrifuge Optima Max-XPBeckmann Coulter393315
Centrifuge 5424REppendorf5404000413
Centrifuge 5702Eppendorf5702000329
Centrifuge Megafuge 40RThermo Scientific75004518
Concentrator PlusEppendorf5305000304Centrifugale verdamper
Fluorescente stereo-microscoop M165 FC LeicaMet Planapo 2,0x objectief
DissectiemicroscoopLeica Leica S6E
Microscoop met hoge vergroting Zeiss Axio Observer Z1ZeissMet PlanAPOCHROMAT 20x objectief en Zeiss Axio Cam MRm
Software
Beeldanalyse softwareImageJ
Analyse van massaspectrometrie dataProtein Prospectorhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm
E.coli stam
OP50CGC
RNAi bacteriën
L4440Julie Ahringer RNAi bibliotheek
C. elegans mutanten
CF2253CGC, stamnaam: EJ1158 Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenen
DCD214Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215Della David's lab at DZNE TübingenGenotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247(2012).
  3. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  4. Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
  5. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450(2010).
  6. Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
  7. Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
  8. Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
  9. Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311(2016).
  10. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
  11. Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
  12. Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
  13. Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725(2015).
  14. Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).
  15. Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  16. Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
  17. Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
  20. Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
  21. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
  22. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964(2014).
  23. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
  24. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
  25. Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295(2008).
  26. Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
  27. Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639(2009).
  28. Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).
  29. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
  30. Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
  31. Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregationCaenorhabditis elegansAge Synchronized WormsHighly Insoluble AggregatesGenetic KnockdownQuantitative Mass SpectrometryFluorescent Tagged ProteinsRAB Extraction BufferUltracentrifugationFormic Acid Solubilization

Related Articles