Methodenartikel

Subcellular fractionering voor ERK activering op een mitochondriale afkomstige Peptide behandeling

7.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56496

⸱

25 september 2017

 ,  ,  , 
1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol wordt beschreven hoe stimuleren van cellen met mitochondriale afkomstige peptiden en beoordelen van de signalering cascade en lokalisatie voor fosfoproteïne.

Samenvatting

Mitochondriale afkomstige peptiden (MDP's) zijn een nieuwe klasse van peptiden die zijn gecodeerd door kleine open lezing frames binnen andere bekende genen van het mitochondriaal genoom. MDP's hebben een breed scala aan biologische effecten zoals neuronen beschermt tegen apoptosis, verbetering van de metabole markeringen en bescherming van cellen tegen chemotherapie. Humanin was de eerste MDP om ontdekt te worden en is de meest bestudeerde peptide onder het MDP-familie. De membraan-receptoren en de stroomafwaartse signaalroutes van humanin zorgvuldig gekenmerkt. Extra MDP's zoals MOTS-c en SHLP1-6 hebben meer recentelijk ontdekt en de signalering mechanismen nog moeten worden opgehelderd. Hier beschrijven we een cel cultuur gebaseerde methode om te bepalen van de functie van deze peptiden. In het bijzonder, toestaan cel fractionering technieken in combinatie met het westelijke bevlekken voor de kwantitatieve bepaling van activering en translocatie van belangrijke signalering molecuul. Hoewel er andere methoden van cel fractionering, is de hier beschreven een gemakkelijke en eenvoudige methode. Deze methoden kunnen verder het ophelderen van het werkingsmechanisme van deze peptides en andere therapeutische agenten worden gebruikt.

Inleiding

Nieuwe studies tonen aan dat mitochondriale afkomstige peptiden (MDP's) spelen een belangrijke rol in cytoprotection en metabolisme1,2,3. Inzicht in het signaaltransductie traject in aanwezigheid van MDP's geeft ons inzicht in het mechanisme waarmee MDP's verschillende functies moduleren. De eerste geïdentificeerde MDP, humanin, heeft aangetoond dat het verhogen van extracellulaire signaal-gereglementeerde kinase 1/2 (ERK1/2) fosforylering door haar receptor binden4,5. De downstream effect van ERK1/2 activering is echter nog steeds underexplored.

De ERK1/2 cascade fungeert als een essentiële bemiddelaar in een verscheidenheid van cellulaire processen zoals proliferatie, cel migratie, cellulaire metabolisme, overleving en apoptosis6,7,8. Om te orkestreren van al zijn deze verschillende cellulaire processen, de activiteit en subcellular localisatie van ERK1/2 strak geregeld phosphatases en steiger eiwitten9,10. Naast posttranslationele modificatie regelt de dynamische pendelen van ERK1/2 ook haar signalering functie, activiteit en specificiteit11,12. ERK1/2 is vooral gelokaliseerd in het cytosol13. Een set van verankering en steiger eiwitten helpen behouden ERK1/2 in cytoskeletal elementen, op de oppervlakte van organellen of diffuus in het cytoplasma13. Bij stimulatie, ERK1/2 is phosphorylated en wordt losgekoppeld van de verankerende eiwitten, waardoor de translocatie van ERK1/2 om andere subcellular compartimenten, met inbegrip van de celkern, mitochondriën, Golgi, en lysosomen14, 15 , 16.

Hoewel humanin is bekend dat de ERK1/2 traject signalering activeren, wordt de activering van ERK1/2 alleen waargenomen in de cel Totaal lysates. Zoals eerder beschreven aangezien ERK1/2 subcellular localisatie een cruciale rol in de downstream effecten, de analyse van zowel de subcellular localisatie en de totale hoeveelheid speelt is gefosforyleerd ERK1/2 nodig om een grondig inzicht van humanin-geïnduceerde ERK1/2 activering en het activeren van downstream doelstellingen.

Om te begrijpen de organellen van de doelstelling van geactiveerde ERK1/2, werd subcellular fractionering, gevolgd door het westelijke bevlekken voor gefosforyleerd ERK1/2 uitgevoerd. Deze methode kan gemakkelijk worden uitgevoerd, zoals het maakt gebruik van Standaard laboratoriumapparatuur en reagentia. De geïsoleerde subcellular compartimenten zijn van hoge zuiverheid, waardoor de resultaten ronduit worden geïnterpreteerd. Immunokleuring van ERK1/2 kan vergelijkbare resultaten geven. Bepaalde subcellular compartimenten zijn echter relatief moeilijk te visualiseren en vereisen speciale fixatie en permeabilization methoden. ERK1/2 niveaus variëren in subcellular compartimenten, en deze variatie kan valse positieve en valse negatieve signalen wanneer we kijken naar hele cel lysates. Daarom geeft een immunoblot met behulp van geïsoleerde subcellular compartimenten ons een beter begrip van ERK1/2 lokalisatie.

De veelzijdigheid van de methode maakt het mogelijk wijzigingen van het protocol bij het onderzoeken van de effecten van andere stimulerende middelen met inbegrip van andere MDP's of translocatie van andere signalering moleculen zoals STAT3. Onlangs worden ontdekte kleine humanin-achtige peptiden (SHLPs) gecodeerd uit 16S rRNA regio waar humanin is gecodeerd, en ze hebben vergelijkbare, maar verschillende eigenschappen vergeleken met HN17. Bijvoorbeeld, SHLP2 en SHLP3 activeren ERK1/2 na 8u hoewel humanin ERK1/2 binnen 5 min. onderzoeken subcellular localisatie van ERK1/2 reactie op verschillende peptiden activeert ons een beter begrip van de biologie van deze peptiden geeft. Opkomende bewijsmateriaal bleek dat de subcellular localisatie van signalering van moleculen een cruciale rol in de downstream effecten speelt. Bijvoorbeeld, STAT3 traditioneel bekend is vooral gelokaliseerd in het cytosol in rustende cellen, en vervolgens het translocates in de kern te activeren van genexpressie in reactie op de cytokines18. STAT3 ook translocates naar de mitochondriën en regelt de TCA cyclus en de ATP productie19. Met betrekking tot autophagy verordening moduleert verschillende subcellular localisatie van STAT3 autophagy in verschillende manieren20. Bijvoorbeeld, nucleaire STAT3 transcriptionally regelt autophagy-gerelateerde genen en fungeert als een autophagy modulator. Autophagy remt cytoplasmatische STAT3 constitutively door interactie met autophagy signalering van moleculen. Mitochondriale STAT3 remt en voorkomt mitophagy door het onderdrukken van oxidatieve stress geïnduceerde autophagy. Daarom is deze methode van de isolatie subcellular compartiment is cruciaal voor het begrip van de rol van andere signalering moleculen, alsmede ERK1/2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. peptide behandeling naar cellen

  1. plaat twee miljoen SH-SY5Y of HEK293 cellen (2 x 10 6) in een 10 cm schotel en groeien ze voor 2 dagen
  2. (optioneel) de volgende dag, het wassen van de cellen met serumvrij Dulbecco ' s gewijzigd Medium (DMEM) media eenmaal adelaar en incubeer met serum gratis DMEM's nachts als de behandeling dient te gebeuren in serum mediagroep.
  3. Op dag 3, los S14G-humanin peptiden in 0,2 µm gefilterd, gedestilleerd water en reconstrueren van hen als de stamoplossing van 1mM.
    Opmerking: De peptiden moeten worden opgelost in de geschikt oplosmiddel, waarbij kan worden bepaald door de kenmerken van de reeks van de peptide (b.v., algemene kosten) kan worden verstrekt door de fabrikant als de peptiden commercieel verkrijgbaar zijn. Bijvoorbeeld, los S14G-humanin, SHLP2, en SHLP6 en MOTS-c op in water. Aliquot de peptiden in een geschikt volume (b.v., 50 μl) voor het voorkomen van bevriezen en ontdooien cycli. Eenmaal ontdooid, gebruik geen hen opnieuw.
  4. Aliquot de voorverwarmde serum-bevattende of serum-vrije media in een 50 mL conische buis en toevoegen van kamertemperatuur 1 mM stamoplossing te maken in een concentratie van de werken (bijvoorbeeld, 1 µM, 10 µM).
  5. Vervangen de media met 6 mL peptide uit stap 1.4. en Incubeer de cellen gedurende de juiste hoeveelheid tijd.
    Opmerking: Kies de incubatietijd afhankelijk van uw aandoening die ERK activeert.

2. Subcellular fractionering voor Cytosol en Nucleus

  1. wassen van de cellen tweemaal met 10 mL ijskoud PBS, schraap de cellen uit de plaat in 5 mL ijskoud PBS en de celsuspensie Breng in een conische tube van 15 mL.
  2. De cellen bij 500 x g gedurende 5 min Centrifugeer bij 4 ° C.
  3. De PBS gecombineerd en resuspendeer de pellet in 200 µL van ijskoud, fractionering buffer (10 mM HEPES pH = 7.6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5% (v/v) van glycerol 1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), protease/phosphatase inhibitors).
    Noot: Om te houden van de eiwitten in hun status fosforylatie, de fosfatase-remmer zoals evenals protease inhibitor vers moet worden toegevoegd en monsters moeten worden bewaard op ijs helemaal keer. Bevriezen en ontdooien herhalende cycli van de monsters moeten worden vermeden. Aliquot monsters in kleine hoeveelheid (bijvoorbeeld 50 μg) voordat ze willen bevriezen -80 ° C.
  4. Incubeer het opnieuw gesuspendeerde pellet op ijs gedurende 15 minuten en vervolgens Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  5. Verzamelen de bovendrijvende substantie als de cytoplasmatische breuk en houden de pellet voor de nucleaire Fractie.
  6. Centrifugeren het supernatant om te verwijderen van cellulaire puin en andere verontreinigingen bij 18.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe microcentrifuge buis. Dit is de Fractie cytosol.
  7. Resuspendeer de pellet in 200 μl ijskoud was buffer (10 mM HEPES pH = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) van glycerol 0.2 mM EDTA, protease/phosphatase inhibitors) en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min bij 4 ° C
  8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 μl ijskoud, nucleaire extractie buffer (20 mM HEPES pH = 7.6, 1.5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) van glycerol 0.2 mM EDTA, protease/phosphatase inhibitors) en bewerk ultrasone trillingen ten 10 keer (5 s op, 10 s uitschakelen, 30% amp.) op ice.
  9. Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  10. Het supernatant overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis. Dit is de nucleaire Fractie.
  11. Quantify het bedrag van de eiwitten met behulp van een BCA assay

3. ruwe-mitochondriale fractie

  1. wassen van de cellen in elk 10 cm schotel met 10 mL ijskoud PBS, voeg toe 5 mL ijskoud PBS en loskoppelen van de cellen met behulp van een cel schraper.
    Opmerking: Gebruik drie 10 cm schotels van cellen om een goede opbrengst van mitochondriën voor het westelijke bevlekken.
  2. De celsuspensie overbrengen in een conische tube van 15 mL, en allemaal uit drie 10 cm gerechten te combineren in een conische tube van 15 ml.
  3. Centrifugeer de cellen bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  4. De PBS gecombineerd en resuspendeer de pellet in 1 mL ijskoud mitochondriën isolatie buffer (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM sacharose, aangepast aan de pH = 7.4).
  5. Meng de cellen met 25 lijnen van een homogenizer van 2 mL met polytetrafluorethyleen gecoate stamper op ice.
    Opmerking: Deze stap is essentieel voor mitochondriale integriteit te behouden en het maximaliseren van het rendement van de mitochondriale fractie. Het aantal slagen moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype. De homogenizer voordat u de procedure start precool.
  6. Het homogenaat overbrengen in een microcentrifuge buis en Centrifugeer het bij 600 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot het verwijderen van de kernen en ongebroken cellen.
  7. Verzamelen het supernatant, overbrengen naar een nieuwe microcentrifuge-buis en Centrifugeer het bij 7.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    Opmerking: De pellet is los, het supernatant zorvuldig te verzamelen en proberen niet te verstoren de pellet.
  8. Verwijder het supernatant resuspendeer de pellet met 200 μL van ijskoude mitochondriën isolatie buffer en breng de oplossing over in een nieuwe microcentrifuge buis. Centrifugeer de buis bij 7.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  9. Herhaal stap 3.8 te wassen de pellet. Het is niet nodig het supernatant overbrengen naar een nieuwe microcentrifuge buis in deze stap.
  10. Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de gewassen pellet en resuspendeer de pellet met mitochondriën met 50 μl van de buffer RIPA.
  11. Incubate de opschorting op ijs gedurende 10 minuten
  12. De schorsing bij 16.000 x g gedurende 15 min Centrifugeer bij 4 ° C.
  13. Het supernatant overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis. Dit is de mitochondriale fractie.
  14. Kwantificeren van het bedrag van de eiwitten met behulp van een BCA assay.

4. Westelijke bevlekken voor Phospho-specifieke eiwitten

  1. het uitvoeren van een SDS-polyacrylamide-gelelektroforese (8-16% premade gel) en het eiwit overbrengen in een membraan PVDF 4.
  2. Incubeer het membraan met 5% BSA in TBST (0,1% Polysorbaat 20) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te blokkeren van achtergrond aspecifieke bandplaatsen.
    Opmerking: Voor de detectie van gefosforyleerd eiwit, blokkeren het membraan met BSA geen melk. Melk bevat caseïne, een overvloedige phosphoprotein, wat in hoge niet-specifieke signaal resulteert.
  3. Na een nacht bebroeden het membraan met het primaire antilichaam (anti-phospho-ERK1/2) bij 4 ° C.
  4. De volgende dag, het membraan met TBST wassen (0,1% Polysorbaat 20) drie keer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Het membraan met secundair antilichaam (anti-konijn HRP) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  6. Het membraan met TBST wassen (0,1% Polysorbaat 20) drie keer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Het membraan met ECL oplossing uit te broeden en beeld van het membraan in de afbeelding analyzer.
  8. Strip het membraan met strippen buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en het membraan met drie keer, gedurende 5 min. TBST wassen
  9. Herhaal stap 4.2 tot 4,7 met behulp van het anti-totaal van de ERK1/2 antilichaam.
  10. Om te controleren op de zuiverheid van elke fractie, SDS-pagina uitvoeren en uitvoeren van immunoblots met antilichamen herkennen markers voor elk compartiment (bijvoorbeeld B1 triplex voor nucleus, GAPDH voor cytosol en TOM20 voor de mitochondriën).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, we HEK293 en SH-SY5Y cellen met 1 μM en 100 μM behandeld S14G-humanin, een krachtige humanin analoge21, respectievelijk, in volledige media voor de aangegeven perioden (Figuur 1 en Figuur 1 B). vervolgens onderzochten We de totale en gefosforyleerd vorm van ERK1/2 bij Thr202/Tyr204 uit totaal eiwit ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier, wij laten zien dat humanin peptide-gemedieerde ERK1/2 activering treedt op in twee verschillende soorten cellen, en de subcellular localisatie van geactiveerde ERK1/2 verschillen naargelang de omstandigheden (bijvoorbeeld, dosis van peptide, tijdstip en cel kunnen type). Het is aangetoond dat humanin signalen door middel van twee verschillende receptoren22,23, wat de verschillen verklaart wellicht in de signalering tussen de twee cellijnen, evenals...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Pinchas Cohen is een aandeelhouder en consultant bij CohBar, Inc. Kelvin Yen heeft gediend als consultant bij CohBar, Inc.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship in Aging Research Program aan SJK en een Glenn Foundation Award en NIH grants naar PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alle auteurs worden weergegeven in de film.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
p44/42 MAPK (ERK1/2)Celsignalering9102Verdunning 1:1.000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)Celsignalering4370Verdunning 1:1.000
Lamin B1Celsignalering12586Kernmarker, Verdunning 1:1.000
GAPDHCelsignalering5174Cytoplasmatische marker, Verdunning 1:2.000
Tom20Santa cruzSC-17764Mitochondria marker, Verdunning 1:2.000
anti-Rabbit-HRP geconjugeerdCelsignalering7074Verdunning 1:30.000
RIPA Lysis and Extraction BufferThermoFisher SCIENTIFIC89900
100 mm CultuurschaalThermoFisher SCIENTIFIC12556002
HNG peptideGenescript
25mm sylinge filterThermoFisher SCIENTIFIC09-719A
HEPESSigmaH3375
MgCl2SigmaM8266
KClSigmaP9333
GlycerolSigmaG9012
Triton X-100ThermoFisher SCIENTIFICBP151-100
EDTASigma3609
MOPSSigmaM1254
EGTASigmaE3889
SucroseSigmaS7903
Tris-baseThermoFisher SCIENTIFICBP152-1
HCLSigmaH1758
PBSLonza17-512F
CelschraperFALCON353085
Halt™ Protease en Fosfatase Inhibitor Cocktail (100X)ThermoFisher SCIENTIFIC78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies met gladde PestlesThomas Scientific3432S90
Tween-20ThermoFisher SCIENTIFICBP337-500
BSAThermoFisher SCIENTIFICBP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Eiwit GelsBIO RAD4561104
Mini Trans-Blot ModuleBIO RAD1658030
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBIO RAD1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer KitBIO RAD1704272
Clarity Western ECL Blotting SubstratesBIO RAD1705060
Restore Western blot stripping bufferThermoFisher SCIENTIFIC21059
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle MediumThermoFisher SCIENTIFIC11965-092
Sonicator, Model: FB120ThermoFisher SCIENTIFIC695320-07-12

Referenties

  1. Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
  2. Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334(2009).
  3. Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
  4. Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
  5. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  6. Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
  7. Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
  8. Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
  9. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  10. Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
  11. Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
  12. Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
  13. Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
  14. Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
  15. Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
  16. Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
  17. Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
  18. Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
  19. Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).
  20. You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
  21. Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
  22. Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
  23. Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondriale peptidenWestern blottingcelkweekcytoplasmatische fractienucleaire fractiemitochondri le isolatiebehandeling met humanineERK fosforylering

Gerelateerde artikelen