Methodenartikel

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

DOI:

10.3791/56497

⸱

24 november 2017

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Core cellulaire processen zoals DNA-replicatie en segregatie, eiwitsynthese celwand biosynthese en celdeling, is afhankelijk van de functie van eiwitten die essentieel voor bacteriële overleven zijn. Een aantal doelgroepen gerichte kleurstoffen kan als sondes beter deze processen begrijpen worden gebruikt. Kleuring met lipofiele kleurstoffen kan de observatie van de membraan structuur, visualisatie van lipide-microdomains, en detectie van membraan blebs. Gebruik van TL-d-aminozuren (FDAAs) om de sites van peptidoglycaan biosynthese sonde kan duiden op mogelijke gebreken in de celwand biogenese of cel groei patronen. Ten slotte kunnen nucleïnezuur vlekken aangeven mogelijke defecten in DNA replicatie of chromosoom segregatie. Cyanine DNA vlekken label levende cellen en zijn geschikt voor time-lapse microscopie real-time waarnemingen van nucleoïde morfologie inschakelen tijdens celgroei. Protocollen voor het labelen van de cel kunnen worden toegepast op eiwit uitputting mutanten te identificeren van de gebreken in de membraan structuur, celwand biogenese of chromosoom segregatie. Bovendien kan time-lapse microscopie worden gebruikt om te controleren van morfologische veranderingen zoals een essentieel eiwit wordt verwijderd en extra verwerven in eiwitfunctie inzicht kan. Bijvoorbeeld, resulteert de uitputting van essentiële celdeling eiwitten in filamentation of vertakking, overwegende dat de uitputting van de cel groei eiwitten cellen tot kortere of ronder kan veroorzaken. Protocollen voor celgroei doelgroepen gerichte labeling en time-lapse microscopie vindt u hier, voor de bacteriële plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Samen, doelgroepen gerichte kleurstoffen en time-lapse microscopie inschakelen karakterisering van essentiële processen in A. tumefaciens. Tot slot, de protocollen die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor sonde essentiële processen in andere bacteriën.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Progressie door de bacteriële cel cyclus moet de coördinatie van de vele processen met inbegrip membraan en een celwand biosynthese, DNA-replicatie en segregatie en celdeling. Om volledig te begrijpen de complexiteit van de bacteriële celbiologie, is het noodzakelijk om te studeren van deze essentiële activiteiten; Dit is echter een niet-triviale taak omdat de levensvatbaarheid van de cellen in het gedrang komt wanneer essentiële onderdelen van deze trajecten zijn mutagenized. Epifluorescence microscopie in combinatie met doelgroepen gerichte kleurstoffen is een krachtige aanpak van deze essentiële processen in wildtype en mutant bacteriestammen sonde.

Peptidoglycaan-specifieke kleurstoffen zijn fluorescerende antibiotica (vancomycine-FL, bocillin-FL) en TL-d-aminozuren (bijvoorbeeld. 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid-3-amino-d-alanine, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanine , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanine; TADA). Bij gram-positieve bacteriën, het gebruik van subletale concentraties van fluorescerend antibioticum analogen sonde sites van peptidoglycaan biosynthese heeft een effectieve strategie geweest om te onthullen peptidoglycaan invoeging patronen1,2, 3,4. Terwijl inzichten te krijgen in het peptidoglycaan invoeging patronen in vaste gram-negatieve bacteriën5TL vancomycine labeling is gebruikt, geeft de buitenmembraan in het algemeen een permeabiliteit barrière die voorkomt het gebruik van TL dat antibiotica als een sonde voor peptidoglycaan biosynthese in levende cellen. In tegenstelling, label korte pulsen van TL-d-aminozuren of d-aminozuren met biorthogonal functionele groepen covalent regio's van recente peptidoglycaan opneming in een breed scala van levende bacteriecellen6,7. Patronen van peptidoglycaan invoegen die zijn waargenomen met synthetische d-aminozuren bevatten punctate en septal (Escherichia coli en Bacillus subtilis), polaire en septal (Agrobacterium tumefaciens en Listeria monocytogenes), septal enige (Staphylococcus aureus) en apicaal (Streptomyces venezuelae)6,7. Deze opmerkingen aangeven dat bacteriën uiteenlopende patronen van biogenese van de celwand vertonen en dat het gebruik van synthetische d-aminozuren als sondes voor de behandeling van de groei patronen een kostbare strategie in veel bacteriën is.

Kleurstoffen die label bacteriële chromosomen bevatten de deoxyribonucleic acid (DNA) specifieke kleine groef binder (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) en hoge affiniteit cyanine kleurstoffen (groen en oranje; overzicht van de materialen). DAPI kleuring van vaste cellen helpt in opsomming van bacteriën van milieu monsters8, terwijl DAPI kleuring van levende cellen wordt gebruikt om aan te geven van bacteriële levensvatbaarheid9. In tegenstelling, kleurstoffen cyanine zoals oranje en groen worden vaak beschreven als de impermeant "dode" cel membraan vlekken bij het inventariseren van niet-levensvatbare cellen9. Opmerkelijk is wanneer deze reagentia worden gebruikt om de morfologie van het bacteriële nucleoïde tijdens de celgroei sonde, waren DAPI, oranje en groen alle aangetoond membraan permeant en geschikt voor het labelen van levende cellen10. In levende cellen van de E. coli , diffuus als gevolg van auto-fluorescentie DAPI kleuring van DNA blijkt uit het cytoplasma en herhaalde blootstelling aan DAPI gebeitste cellen aan het ultraviolette (UV) licht ten de nucleoïde structuur10. Kleuring van E. coli of B. subtilis met oranje blijkt dat deze kleurstof membraan permeant is en langdurige fluorescentie op bindende aan DNA in levende cellen biedt zonder de beïnvloedende celgroei, DNA-replicatie of chromosoom segregatie10 . Deze opmerkingen suggereren dat cyanine DNA kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het bewaken van de morfologie van nucleoids tijdens de celgroei bij vele bacteriën.

Phospholipid-specific stryl kleurstoffen zoals N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; Zie materialen lijst) kationogene stoffen zijn en bij voorkeur associëren met negatief geladen fosfolipiden zoals cardiolipin en phosphatidylglycerol11. Verschillende patronen worden waargenomen wanneer 4-64 wordt gebruikt voor het label van de membraan van verschillende bacteriën. Bij Escherichia coli, 4-64 is verrijkt met de palen, in banden langs de laterale muur, en in de divisie sites laat pre-divisional cellen12. Bacillus subtiliskunt 4-64 labelen de visualisatie van lipide spiralen13. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketten de buitenmembraan en wordt waargenomen in een patroon van de karakteristieke "hoefijzer" waarin de groei paal is verstoken van labeling14,15. Deze opmerkingen geven aan dat deze bacteriën vertonen heterogene lipide distributies als gevolg van de aanwezigheid van lipide-domeinen die tot cellulaire asymmetrie bijdragen. Veranderingen in 4-64 labeling patronen zoals de aanwezigheid van diffuse labeling, blebs of blaasjes, invaginations of krimp van het membraan kan worden informatieve in karakterisering van mutanten die van invloed zijn de distributie of de biosynthese van lipiden.

Verder dan kleuring cellen, is de functie van eiwitten deelnemen aan essentiële processen bepalen nodig. De karakterisering van essentiële eiwitten is technisch uitdagend, want het is niet mogelijk om te verwijderen van essentiële genen en de fenotypische gevolgen bestuderen. Dus, alternatieve benaderingen die de eiwitten afbreken naar voren zijn gekomen. Bijvoorbeeld, kan een essentiële gen worden gebracht onder de controle van een afleidbare promotor in plaats van zijn eigen promotor. Afleidbare initiatiefnemers zijn inspelen op kleine molecules zoals; 16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, van zink xylose23, dus de transcriptie van het target-gen ophoudt en de proteïne van belang is uitgeput wanneer de inductor wordt verwijderd. Alternatieve benaderingen voor het afbreken van essentiële eiwitten van belang omvatten synthetische riboswitches24 die kleine molecuul-RNA interacties kunt belemmeren transcriptie van doelgenen, CRISPR interferentie25,26 naar blok transcriptie van doelgenen en afleidbare eiwit afbraak27,28 die gebruikmaakt van peptide tags aan target eiwitten voor aantasting door het ClpXP protease. Uitputting stammen bieden slechts een korte tijd voor karakterisering voordat de cellen verliezen levensvatbaarheid, microscopische beeldvorming van cellen na verloop van tijd tijdens eiwit uitputting is daarom een krachtige aanpak voor karakterisering. Inderdaad, microscopie van levende bacteriecellen onderzoekers inzichten te krijgen in de fundamentele biologische processen, met inbegrip van de mechanismen van de cel vorm onderhoud, secretie en compartimentering29in staat heeft gesteld.

A. tumefaciens is een bacteriële plant pathogen30 en natuurlijke genetische ingenieur31,32. Dus, mechanismen met betrekking tot pathogeniteit, inbegrepen, gastheer-pathogeen interacties33,34,35, secretie36en host transformatie30,31, 37 uitgebreid zijn onderzocht. Voor het ontwerpen van strategieën die A. tumefaciens gemedieerde ziekte te voorkomen of te verbeteren plant transformatie, moeten de processen essentieel voor overleving van A. tumefaciens beter worden begrepen. Het gebruik van doelgroepen gerichte kleurstoffen en de recente ontwikkeling van een strategie van de uitputting eiwit voor A. tumefaciens18 biedt een manier om te onderzoeken van essentiële processen.

Hier vindt u gedetailleerde protocollen voor microscopische analyse van wildtype, mutant en eiwit uitputting stammen van A. tumefaciens . De eerste twee protocollen beschrijven hoe te bereiden cellen en hen label met doelgroepen gerichte kleurstoffen. Het derde protocol biedt stapsgewijze aanwijzingen voor agarose pads (Figuur 1) voorbereiding en beeldvorming van de bacteriële cellen (Figuur 2, Figuur 3, , Figuur 4). Deze protocollen mogelijk ook geschikt voor andere bacteriën met extra aanpassingen ter verantwoording voor verschillende media voorwaarden, groeicijfers, zuurstof eisen en structuren van de cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. groei van A. tumefaciens stammen

  1. A. tumefaciens stammen kweken
    1. Gebruik een steriele houten stok of Pipetteer tip om te enten met een één kolonie van de gewenste stam 1 mL van ATGN groei media (zie lijst van de materialen voor het recept).
      Opmerking: Voor A. tumefaciens uitputting stammen, moet de ATGN 1 mM IPTG bevatten als een inductor te handhaven van de biosynthese van het essentiële eiwit.
    2. Groeien de A. tumefaciens stammen overnachting in ATGN bij 28 ° C met schudden bij 225 t/min.
    3. Meet de extinctie van de cellen in 600 nm (OD600) gebruik van een spectrofotometer. Verdun de cultuur van de cel tot een OD600 = ~0.2 en blijven groeien tot OD600 = ~0.6 is bereikt. Voor uitputting stammen, blijven groeien met inductor tot OD600 = ~0.6 is bereikt.
    4. Gebruik van wildtype en mutant stammen van A. tumefaciens op OD600 = ~0.6 voor doelgroepen gerichte kleuring en/of time-lapse microscopie (Zie secties 2 en 3.1). Wassen voor uitputting stammen, de inductor (zie punt 1.2).
  2. Verwijdering van inductor voor karakterisering van A. tumefaciens eiwit uitputting stammen
    1. 1 mL van de exponentiële cultuur pellet (OD600 = ~0.4-0.6) door middel van centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge bij kamertemperatuur.
    2. Om te wassen, verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet in verse media zonder inductor en pellet van de cellen, zoals eerder beschreven (1.2.1). Wassen van de cellen een totaal 3 keer in de nieuwe media.
    3. Resuspendeer de laatste pellet in verse media en het concentreren van de cellen tot een OD600 = ~0.8 voor onmiddellijke kleuring met doel specifieke kleurstoffen (sectie 2 en figuur 4B-D) of time-lapse microscopie (punt 3.2 en figuur 4A) . U kunt ook vooraf afbreken de cellen voor de gewenste hoeveelheid tijd door de groeiende cellen in media zonder inductor vóór kleuring en beeldvorming van de cellen.

2. doelgroepen gerichte kleuring van A. tumefaciens cellen

  1. Fluorescerende d-amino acid celwand labeling
    Opmerking: FDAAs zijn niet-toxisch fluorescerende d-aminozuren die gemakkelijk in de A. tumefaciens peptidoglycaan worden verwerkt. Deze eenvoudige labeling procedure sondes groei patronen in levende cellen6. Protocollen voor de synthese van vier FDAAs zijn beschikbaar38.
    1. Pellet 500 µL van exponentiële cultuur (OD600 = ~0.4-0.6) door middel van centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge. Resuspendeer de pellet cel in 100 µL van nieuwe media.
    2. Voeg 5 µL van 5 mM FDAA aan gewassen en geconcentreerd cellen en incubeer gedurende 2 min. in het donker.
      Opmerking: Maximaal FDAA blootstelling aan licht. De tijd van incubatie zal variëren afhankelijk van de groei van de stam. Incubatie keer moet meestal 5-10% van de verdubbeling tijd6.
    3. Pellet de cellen door centrifugeren en cel pellets met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) drie keer wassen.
    4. Resuspendeer de pellet in ~ 50 µL PBS.
      Opmerking: Het volume van PBS gebruikt voor resuspensie kan variëren afhankelijk van de grootte van de pellet.
    5. 0,8-1 toepast µL van cellen agarose stootkussen te een beeld met behulp van microscopie van de epifluorescence onmiddellijk (zie onder de punten 3.1 en 3.2).
      1. U kunt ook stoppen verder label opneming door vaststelling van de cellen met ijskoude 70% ethanol. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL ijskoud 70% ethanol en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
      2. Verzamelen van cellen door centrifugeren en resuspendeer in een klein volume van PBS voor imaging op een later tijdstip. Cel schorsingen bij 4 ° C en afbeelding opslaan binnen 48 uur.
  2. DNA kleuring met DAPI of oranje vlek
    Opmerking: Om te observeren DNA structuur, cellen worden aangeduid met hetzij de DAPI of oranje (dode cel vlek). Hoewel klassiek beschreven als een "dode cellen vlek', oranje is permeant, photostable, en heeft geen invloed op de groei van bacteriële cellen, live-cel DNA imaging10inschakelen. In A. tumefaciens, oranje labeling werkt goed in levende cellen en is geschikt voor time-lapse microscopie (Figuur 3). In tegenstelling, het ultraviolette (UV) licht blootstellingsduur die nodig zijn voor imaging DAPI gebeitste cellen is fototoxisch (Figuur 3) en DAPI kleuring is dus geschikt voor de kleuring van levende cellen voor onmiddellijke imaging of kleuring vaste cellen.
    1. DAPI kleuring van cellen
      1. 1 mL van de exponentiële cultuur pellet (OD600 = ~0.4-0.6) door middel van centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge.
      2. Optioneel, om te lossen cellen voorafgaand aan kleuring, resuspendeer de cel pellet in 1 mL ijskoud ethanol 70%. Incubeer op ijs voor 10-15 min. Collect de cellen door centrifugeren als in 2.2.1.1 beschreven.
      3. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS, met 1 µL van DAPI stockoplossing (1 mg/mL; Zie Materialen tabel). Meng zachtjes door pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten in het donker.
      4. Pellet cellen door centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 min en resuspendeer in 1 mL PBS te verwijderen overtollige DAPI. Spoel de cellen nog tweemaal en resuspendeer de pellet in PBS 50 µL of media.
      5. 0,8-1 toepast µL van cellen agarose stootkussen te een beeld met behulp van microscopie van epifluorescence onmiddellijk. Zie punten 3.1 en 3.2.
        Opmerking: Dit protocol is niet optimaal voor time-lapse microscopie te observeren chromosoom dynamics (Figuur 3). Overweeg het gebruik van oranje vlekken als alternatief (zie paragraaf 2.2.2).
    2. Oranje verkleuring van levende cellen
    3. 1 mL van de exponentiële cultuur pellet (OD600 = ~0.4-0.6) door middel van centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge. Resuspendeer cel pellet in 1 mL PBS, met 1 µL van Oranje stockoplossing (zie lijst van de materialen). Meng zachtjes door pipetteren en incubeer gedurende 5 min. in het donker.
    4. Pellet cellen door centrifugeren en resuspendeer in 1 mL PBS te verwijderen overtollige oranje. Spoel de cellen nog tweemaal en resuspendeer de pellet in PBS met 50 µL.
    5. 0,8-1 toepast µL van cellen agarose stootkussen te een beeld met behulp van microscopie van epifluorescence onmiddellijk. Zie punten 3.1 en 3.2.
      Opmerking: Dit protocol werkt goed samen met levende cellen en is geschikt voor time-lapse microscopie te observeren chromosoom dynamics (Figuur 3). Als het is niet handig om het imago onmiddellijk, kunnen cellen in ijskoude 70% ethanol (zie punt 2.2.1.2) worden vastgesteld.
  3. Membraan labeling
    Opmerking: De lipofiele styryl fluorescerende kleurstof 4-64 is gebruikt uitgebreid te observeren het membraan van bacteriële cellen. In tegenstelling tot veel bacteriën, 4-64 A. tumefaciens cellen het label niet uniform Maak label, maar vrij vaak vertonen een "hoefijzer" patroon14,15. Opmerkelijk, de groei paal is bijna verstoken van vlek terwijl de oude paal intens heet. Aldus, kan 4-64 visualisatie van zowel de groeipatronen van de cel als de membraan structuur in A. tumefaciens.
    1. FM 4-64 toevoegen om een eindconcentratie van 8 µg/mL, in 1 mL van de cultuur van de cel van de exponentiële fase en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten in het donker.
    2. Pellet gelabelde cellen door centrifugeren bij 7.000 x g gedurende 5 minuten in een desktop centrifuge en resuspendeer cel pellet in 1 mL PBS. Wassen van de cellen een totaal van drie keer te verwijderen overtollige kleurstof.
    3. Resuspendeer de cellen in een klein volume van PBS en plek op een agarose aanvullen tot het beeld onmiddellijk. (Zie punten 3.1 en 3.2)
      Let op: Cellen moeten onmiddellijk beeld worden om te observeren karakteristiek labeling patronen.

3. beeldvorming van A. tumefaciens cellen

  1. Agarose pad voorbereiding
    Opmerking: Figuur 1 bevat een reeks afbeeldingen (a-panel) en schema (deelvenster B) van een typische agarose pad time-lapse microscopie voorbereid. Agarose pads zijn meestal bereid zo nodig.
    1. 3.1.1. het gebruik van een dekglaasje aan als een gids en knippen een 22 x 22 mm vierkant laboratorium film (Zie materialen lijst) door het uitvoeren van een scalpel rond de randen.
    2. Een vierkant gesneden uit het midden van de film van de laboratorium verlaten een ~ 2-5 mm grens om te dienen als een pakking voor de agarose pad. Gooi het centrum-knipsel.
    3. Plaats de pakking van de film op een glasplaatje (75 x 25 mm) gereinigd met een ammoniak en alcoholvrij reiniger (zie lijst van materialen) en verwarm tot de film licht op glas (bovenste afbeelding in figuur 1A gesmolten is). Om te smelten laboratorium film, de rand van een warmte blok set tot 70 ° C gebruiken of licht boven een vuur smelten.
    4. Bereid agarose oplossing door het mengen van ~0.075 g agarose (zie lijst van de materialen) in 5 mL van de media in een kleine kolf. Verwarm de oplossing in een magnetron met periodieke wervelende te mengen totdat de agarose wordt opgelost en de oplossing duidelijk is. Bewaar deze agarose oplossing bij 55-70 ° C en gebruik voor de bouw van meerdere agarose pads binnen 48 uur.
    5. Pipetteer media met 1,2-1,5% agarose in het midden van de pakking.
      Opmerking: Het volume van de media is meestal 50-60 µL maar afhankelijk van de grootte van de pakking. Het toevoegen van media aan een koude dia kan leiden tot de agarose te te snel stollen, moet dus de dia worden bewaard op een warme ondergrond. De rand van een warmte-blok ingesteld op 70 ° C werken goed. Water agarose of gebufferde agarose oplossingen zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) kunnen worden gebruikt in plaats van media met agarose voor toepassingen waarin verdere celgroei niet vereist is. Voor imaging uitputting stammen, kunnen de inductor aanwezig of afwezig in de media. Aanwezigheid van inductor kan worden gebruikt als een besturingselement, overwegende dat het ontbreken van inductor het fenotype van uitputting onthullen zal.
    6. Plaats een dekglaasje aan over de pakking gelijkmatig verdelen de agarose.
    7. Plaats dia op een koele, vlakke ondergrond te stollen voor ~ 2 min. vermijden uitdrogen van het agarose stootkussen aangezien dit in een gerimpelde oppervlak op het pad agarose en bundeling van de celsuspensie resulteren zal wanneer toegepast op het oppervlak.
    8. Schuif voorzichtig het dekglaasje aan uit de agarose pad.
      Let op: Deze stap niet overhaast. De agarose pad kan gemakkelijk scheuren en een ongelijke agarose pad beeldvorming kan bemoeilijken.
    9. Laat de agarose pad om lucht droog zijn voor 1-2 min bij kamertemperatuur, totdat het oppervlak van de pad droog verschijnt. Met behulp van een scalpel, het verwijderen van een kleine strook van agarose maken een zak lucht (middelste afbeelding, figuur 1A); de zak van de lucht is meestal ~ 2 x 7-10 mm en A. tumefaciens cellen de neiging om te groeien het beste in de buurt van de zak van lucht (Figuur 1 c).
      Opmerking: Voor beeldvorming van vaste cellen of onder omstandigheden waar groei niet wordt gecontroleerd, een zak lucht is niet nodig.
    10. Plek 0,8-1 µL van cellen in de agarose pad en bedek met een nieuwe dekglaasje aan. Plaats het dekglaasje aan zachtjes over de bovenkant van de agarose pad naar de cellen verdelen over het oppervlak van de agarose pad.
    11. Zegel van de randen van het dekglaasje aan met behulp van gesmolten VALAP (Zie Materialen tabel voor recept; Figuur 1A, afbeelding onderz─│de). Storing te verzegelen langs alle randen en hoeken van het dekglaasje aan kan veroorzaken drogen van het agarose pad, die leiden zal tot het drijven van cellen tijdens de beeldvorming. Opmerking: De verzegeling van het dekglaasje aan is alleen nodig voor lange termijn time-lapse imaging.

figure-protocol-1
Figuur 1: Agarose pad voorbereiding. (A) beeld van de volgorde van het protocol van de voorbereiding van het pad van agarose. Afbeelding 1 is een dia met de pakking van de film laboratorium. In afbeelding 2, worden de agarose pad en air pocket gevisualiseerd. Ten slotte, afbeelding 3 toont de volledige agarose pad met de cellen onder een dekglaasje en verzegeld met VALAP. (B) een schematische voorstelling van een agarose pad voor time-lapse microscopie wordt verstrekt. Zeer belangrijke eigenschappen van de agarose pad worden aangeduid op het schema. (C) de zak lucht bevorderd groei van A. tumefaciens op agarose pads. Beelden van wildtype A. tumefaciens cellen gekweekt op een agarose pad voor 20 uur staan. Beelden werden genomen op posities steeds ver uit de zak van de lucht. De afstand van de dichtstbijzijnde rand van de afbeelding aan de zak lucht wordt boven elke afbeelding weergegeven. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Imaging
    Opmerking: Differential-interference-contrast, fase contrast en epifluorescence imaging is uitgevoerd met een omgekeerde Microscoop uitgerust met hardware gebaseerde autofocus met een geautomatiseerde stadium, standaard filters, een LED-lichtbron, 60 X olie-immersie doelstellingen (1.4 nvt) voor fase contrast of differentiële interferentie contrast (DIC), en een elektron-vermenigvuldigen 1K-camera voor charge-combinatie-apparaat (EMCCD). De Microscoop moet in een temperatuur gecontroleerde ruimte worden geplaatst. Als alternatief, een podium warmer of kamer kan worden gebruikt om consistente temperaturen tijdens de beeldvorming.
    1. Epifluorescence microscopie
      Nota: Voor de beeldvorming van de fluorescentie van levende cellen is het noodzakelijk te beperken van het aantal afbeelding acquisities en optimaliseren van de belichtingstijd te minimaliseren photobleaching en fototoxiciteit. Voor de beeldvorming van elke kleurstof, is het raadzaam om een optimale belichtingstijd die voldoende fluorescentie detectie biedt maar leidt niet tot photobleaching of fototoxiciteit te vinden. In de figuren 2-4, werden belichtingstijden van 200 ms gebruikt voor alle afbeeldingen van de fluorescentie. Voor de time-lapse sequenties afgebeeld in Figuur 3, werden de beelden elke 10 min. voor 3U verworven.
      1. Plaats van immersie-olie op het nagestreefde doel en plaats van de omgekeerde dia in de dia houder in het werkgebied. Gebruik de focus knoppen om de cellen in focus.
      2. Afbeeldingen in fase (of DIC) en de gewenste fluorescentie-filter te verwerven.
        Opmerking: De maximale excitatie en emissie golflengten voor de vlekken gebruikt in Figuur 4 Figuur 2en Figuur 3zijn als volgt: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), oranje (547/570).
    2. Time-lapse microscopie
      Opmerking: Tijdens de time-lapse microscopie de volgende functies zijn computergestuurde: x, y en z-positie, luiken en fluorescentie-filters. Een op hardware gebaseerde auto-focus systeem is optimaal te houden van focus tijdens time-lapse imaging. U kunt ook kan een software gebaseerde auto-focusing lus worden gebruikt.
      1. Plaats van immersie-olie op het nagestreefde doel en plaats van de omgekeerde dia in de dia houder in het werkgebied. Gebruik de focus knoppen om de cellen in focus.
      2. Optioneel: Verwerven meerdere (x, y) positie. Selecteer willekeurig 10 velden van cellen in de nabijheid van de zak van de lucht van de agarose pads.
      3. Set-up tijd volgorde overname naar afbeelding in fase of DIC op het gewenste tijdsinterval.
        Opmerking: Voor de time-lapse opeenvolging afgebeeld in Figuur 4, DIC beelden werden verkregen met 30 ms blootstelling elke 10 min. voor 14u. Bij het gebruik van fluorescentie imaging tijdens time-lapse microscopie, passen de interval en blootstelling Acquisitietijd om photobleaching en fototoxiciteit te minimaliseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doel-specifieke etikettering van wildtype A. tumefaciens cellen
Om te illustreren dat cel morfologie wordt niet beïnvloed door het wassen stappen of behandeling met 1% DMSO (die wordt gebruikt voor het verdunnen van de fluorescente kleurstoffen), cellen werden beeld rechtstreeks vanuit cultuur (figuur 2A, uiterst linkse paneel), na het wassen van de cellen door centrifugeren zoals beschreven in 1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol bevat een reeks procedures voor het onderzoek van A. tumefaciens wildtype, mutant en uitputting stammen. Het is vermeldenswaard dat alle procedures vermeld in de sectie protocol gemakkelijk aangepast voor andere bacteriestammen met extra wijzigingen worden kan ter verantwoording voor groei media, temperaturen en groeicijfers.

Het gebruik van doelgroepen gerichte kleurstoffen is een waardevol instrument voor het verstrekken van een gedetailleerde karakterisering van celcyc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Michael VanNieuwenhze (Indiana University) voor het geschenk van de FDAAs gebruikt in Figuur 2 en Figuur 4. Wij danken de leden van de bruine lab voor feedback tijdens de voorbereiding van dit manuscript. Onderzoek in de bruine lab op A. tumefaciens celgroei en deling wordt ondersteund door de National Science Foundation (IOS1557806).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacteriale stammen
Agrobacterium tumefaciens C58ATCC33970Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid vereist voor virulentie van Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrAFigueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 invoeging in een kunstmatige attTn7 site maakt depletie mogelijk van de essentiële master regulator CtrA in de fytopathogeen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mediacomponenten
ATGN minimaal mediumVoeg aan 1 L gesteriliseerd water 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Zouten, 12,5 ml 40% glucose toe. Voor platen, voeg 15 g Bacto Agar toe aan 1 L water en autoclaveer. Koel af tot 55 °C en voeg 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Zouten, 12,5 ml 40% glucose toe.
20X AT BufferVoeg 214 g/L KH2PO4 toe aan water en pas pH aan tot 7,0 met natriumhydroxide. Autoclaveer.
NaOHFisher BioReagentsBP359
KH2PO4Fisher ChemicalP288
20X AT ZoutenVoeg 40 g/L (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4•7H2O, 0,2 g/L CaCl2•2H2O en 0,024 g/L MnSO4•H2O toe aan water. Autoclaveer.
(NH4)2SO4Fisher ChemicalA701
MgSO4•7H2OFisher BioReagentsBP213
CaCl2•2H2OFisher BioReagentsBP510
MnSO4•H2OFisher ChemicalM114
GlucoseFisher ChemicalD16Bereid 40% stockoplossing in water. Filter steriliseer.
Bacto AgarFisher BioReagentsBP1423Voeg 15 g toe aan 1 L water bij het bereiden van platen.
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Optionele media-additiva
KanamycineGoldBioK-120Bereid als een 100 mg/ml stockoplossing in water en filter steriliseer. Gebruik bij een eindconcentratie van 200 µg/ml.
IPTGGoldBioI2481C5Bereid als een 1 M stockoplossing in water en filter steriliseer. Gebruik bij een eindconcentratie van 1 mM naargelang nodig voor inductie.
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Microscopiematerialen
MicroscoopglazenFisherbrand12-550D25 X 75 X 1,0 mm. Schoon met Sparkle glasreiniger.
MicroscoopdekglasFisherbrand12-541-B22 X 22 mm. Nr. 1,5. Schoon met Sparkle glasreiniger.
Sparkle GlasreinigerHome Depot203261385Ammoniak- en alcoholvrij.
Ultra Pure AgaroseInvitrogen16500-100Voeg toe aan water, PBS of media tot een eindconcentratie van 1 - 1,5%. Smelt in magnetron en plaats op 70 C
PBSFisher BioReagentsBP39950010X oplossing die verdund moet worden tot 1X met steriel water.
ParafilmBemisPM-999Laboratoriumfilm gebruikt als pakking bij agarrose pad bereiding.
VALAPVoeg gelijke hoeveelheden lanoline, paraffine was en petroleum jelly toe aan een kegelbuis. Verwarm buis in 70 °C droog, bead of waterbad tot smelten en mengen. Breng VALAP aan terwijl het nog gesmolten is.
Lanolin BoterSAAQINSQ-LAB-R1
Petroleum JellyTarget Corp.06-17644
Paraffine WaxCrafty Candles263012
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Doelspecifieke kleurstoffen
DMSOFisher BioReagentsBP231-1Gebruik om stockoplossingen van kleurstoffen naar behoefte te verdunnen.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)FDAAs kunnen worden gesynthetiseerd of verkregen via overeenkomst met Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Bereid 100 mM stockoplossing in DMSO. Gebruik bij een eindconcentratie van 5 mM.
DAPIThermoFisher Scientific62247Bereid 1 mg/ml stockoplossing in DMSO. Gebruik bij een eindconcentratie van 1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26(2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496(2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219(2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137(2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730(2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488(2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322(2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519(2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682(2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363(2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Time lapse microscopiebacteri le celgroeiDNA replicatieeiwitsynthesecelwandsyntheseceldelingfluorescerende kleurstoffennucle nezuurkleuringenAgrobacterium tumefaciens

Gerelateerde artikelen