Serum en Plasma kopiëren nummer detectie met behulp van PCR in real time

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft de kopie nummer variatie analyse uitgevoerd in serum of plasma DNA met behulp van real-time PCR-aanpak. Deze methode is geschikt voor de voorspelling van medicamenteuze resistentie bij castratie resistente prostaatkanker patiënten, maar het zou informatief ook voor andere ziekten.

Samenvatting

Serum en plasma cel gratis DNA (cfDNA) is aangetoond als een informatieve, niet-invasieve bron van biomarkers voor diagnose, prognose, toezicht en voorspelling van behandeling verzet. Vanaf de hypothese dat de androgeen receptor (AR) gene exemplaaraantal (CN) krijgen is een frequente evenement in metastatische castratie weerstand prostaatkanker (mCRPC), wij willen dit evenement in de cfDNA als een potentiële voorspellende biomarker analyseren.

We geëvalueerd AR CN in cfDNA met behulp van 2 verschillende real-time PCR-testen en 2 Referentie genen (RNaseP en geleden1). DNA bedrag van 60 ng werd gebruikt voor elke combinatie van assay. AR CN winst werd bevestigd met behulp van digitale PCR als een nauwkeuriger methode. CN variatie analyse heeft reeds aangetoond informatief voor de voorspelling van behandeling verzet in het kader van mCRPC, maar het kan zinvol zijn ook voor andere doeleinden in verschillende settings van de patiënt. GN-analyse op cfDNA heeft verschillende voordelen: het is niet-invasief, snelle en gemakkelijk uit te voeren, en het begint vanaf een klein volume van serum of plasma materiaal.

Inleiding

Cel gratis DNA (cfDNA) in het bloed circuleren heeft aangetoond dat een optimale bron van biomarkers voor diagnose, prognose, toezicht en voorspelling van^1,2van de weerstand van de behandeling. Vele studies hebben aangetoond een goede overeenstemming tussen DNA veranderingen (mutaties, kopie aantal variaties, epigenetische aanpassingen in de weefsels) en die gevonden in overeenkomstige plasma monsters¹, bevestigt dat de circulerende tumor DNA (ctDNA) is informatief voor primaire en uitgezaaide tumor weefsel wijzigingen³. De mogelijkheid van het bestuderen van ctDNA voorziet dus in de wederopbouw van de genomische herschikkingen en kopie aantal variaties (CNVs) op specifieke oncogenen⁴, die de potentieel metastatische klonen en subclonal cellen aangeeft. CtDNA is aangetoond dat klinisch nuttig zijn vooral voor kanker behandeling monitoring als het specifieke mutaties en CNVs, aan specifieke gerichte therapieën^5,6gerelateerde havens. Het ook overwint de behoefte aan weefsel biopsieën en laat resultaten kunnen worden verkregen op verschillende tijdstippen gedurende een bepaald kankerbehandeling in een niet-invasieve wijze.

Met betrekking tot prostaatkanker, een significante correlatie tussen het circuleren van cel-vrije androgeen receptor (AR) CNVs en behandeling response to abiraterone en enzalutamide is aangetoond, met de vermelding AR gene exemplaaraantal (CN) in cfDNA kan een veelbelovende biomarker kunnen voorspellen behandeling verzet^7,8,9,10,11. CNVs van specifieke genen in ctDNA kunnen worden geëvalueerd aan de hand van verschillende benaderingen met verschillende gevoeligheid, kosten en snelheid (bv. real-time, digitale PCR, en Next Generation Sequencing).

Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle aanpak, gebaseerd op dubbelzijdig testen in real-time PCR-technologie, voor de evaluatie van de AR CN in cfDNA van serum en plasma monsters^7,8. Wij vonden twee verschillende PCR-tests ontworpen op twee verschillende genomic regio's binnen de intron 5 voor AR (Xq12) en twee andere genen, als interne standaard referentie genen bekend dat een aantal status van normale kopie in prostaatkanker (RNaseP, gelegen op 14q11; AGO1, gelegen op 1 p 34). We kozen twee referentie genen, in plaats van één, de precisie en de gevoeligheid van de resultaten te verhogen. Een hoeveelheid van DNA van 60 ng werd versterkt voor elke combinatie van assay (gecombineerde assay voor AR-assay_1 + RNaseP en voor AR-assay_2 + AGO1). Drie serum of plasma DNA-monsters van gezonde mannen werden samengevoegd en gebruikt als een kalibrator. We hebben overwogen cutoffs van > 1.5 voor AR gewin en < 0,5 voor verwijdering. Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het flexibel is en dat kunnen ook andere genen worden geëvalueerd, veranderen de standaard interne referentie genen, op basis van de tumor type en kenmerken.

Protocol

Het protocol bestaat uit de isolatie van DNA uit serum of plasma monsters voor het uitvoeren van PCR in real time voor kopie nummer analyse. DNA-extractie, controle van de hoeveelheid DNA (spectrofotometer) en PCR in real time voor specifieke doelstellingen werden uitgevoerd. In Figuur 1wordt een overzicht van de procedures en de tijdlijn worden gemeld.

Het protocol volgt de richtsnoeren van de Commissie van de ethiek van het onderzoek van het eerste het menselijke.

1. serum verzameling en verwerking

1. Verzamelen van ongeveer 5 mL bloed in de buis van een serum zonder antistollingsmiddel verkrijgen van serum. Handhaving van bloed buizen bij 4 ° C tot verwerking.
2. Centrifuge buizen bij 1.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
3. Breng zorgvuldig serum in 2 mL tubes.
4. Negeren van de auteursrechtenorganisaties buis en onmiddellijk bevriezen het supernatant bij-80 ° C tot gebruik.

2. plasma verzameling en verwerking

1. Verzamelen van ongeveer 10 mL bloed in de buis van een plasma met EDTA plasma verkrijgen. De buis volledig te vullen en vervolgens het 8 keer omkeren. Handhaving van bloed buizen bij 4 ° C tot verwerking.
2. Centrifugeer de buis bij 1800 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met geen instelling van de rem op de centrifuge.
3. Breng zorgvuldig het bovenste deel van het plasma in 2 mL tubes. Herhaal de overdracht, ten minste 1 mL van het supernatans dat boven de witte cellaag verlaten.
   Opmerking: Overdracht van het bovenste gedeelte van het supernatans dat vermindert het risico van besmetting door cellen of cel puin.
4. Negeren van de auteursrechtenorganisaties buis en onmiddellijk bevriezen het supernatant bij-80 ° C tot gebruik.

3. DNA isolatie van Serum of Plasma

Opmerking: Isolatie van DNA van serum of plasma moet worden uitgevoerd met behulp van het commerciële protocol bewerkt in de volgende stappen.

1. Ontdooi een hoeveelheid (bevat van 0,5 tot 2 mL) serum of plasma bij kamertemperatuur.
2. Vortex en mengen van het monster af en breng 0,5 mL serum of plasma in een duidelijk 1.5 mL-buis. Bevriezen van de rest van het materiaal bij-80 ° C.
3. Voeg 50 µL van proteïnase k (20 mg/mL) direct aan het monster.
4. Voeg 0,5 mL lysisbuffermengsel aan het monster en meng goed door pipetteren.
5. Sluit de buizen en incubeer monsters bij 56 ° C gedurende 15 min. in het blok van de warmte.
6. De aangegeven hoeveelheid 100% ethanol op was buffer 1 en 2, toevoegen, zoals aangegeven door de instructies van de fabrikant.
7. Breng de monsters terug op kamertemperatuur en Voeg 0,5 mL van absolute ethanol en meng goed door pipetteren.
8. Voeg 650 µL van het mengsel in stap 3.7 aan de scheiding kolom en centrifuge op 6.000 x g voor 1 min verkregen.
9. Negeren van de buis met de stroom door en plaats van de kolom op een nieuwe schone collectie buis. Herhaal stap 3.8 en 3.9 één meer tijd.
10. Voeg 500 µL van was buffer 1, zonder de bevochtiging van de rand van de kolom en centrifugeer bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.
11. De buis met de stroom door verwijderen en vervangen door een nieuwe schone collectie buis.
12. Voeg 500 µL van was buffer 2, zonder de bevochtiging van de rand van de kolom en de centrifuge op volle snelheid (20.000 x g) gedurende 3 minuten.
13. De buis met de stroom door verwijderen en vervangen door een nieuwe schone collectie buis.
14. Centrifugeer bij volledige snelheid (20.000 x g) voor de 3 min te verwijderen van alle resterende wassen-buffer.
15. Plaats de kolom in een schone 1,5 mL-buis. Voeg 150 µL van elutie buffer en wacht 7 min om ervoor te zorgen dat buffer wets de kolom.
16. Centrifugeer bij 8.000 x g voor 1 min.
17. Pipetteer de elute uit stap 3.16 opnieuw in dezelfde kolom en centrifuge op volle snelheid (20.000 x g) voor 1 min maximale herstel van DNA te waarborgen.

4. DNA kwantificering en verdunning

1. Uitvoeren van kwantificering van DNA met een spectrofotometer. Gebruik 2 µL van het monster op een bank-top spectrofotometer per de instructies van de fabrikant.
   Opmerking: Als de hoeveelheid DNA is niet voldoende om door te gaan met PCR in real time (minstens 120 ng), een nieuw DNA isolatie proces uit te voeren.
2. Verdun DNA uit serum of plasma tot 2,5 ng/µL in een eindvolume voldoende voor alle real-time PCR (ongeveer 50 µL).

5. real-time PCR

1. Ontdooi kopie nummer testen, referentie gene assay, verdund DNA-monsters en kalibratoren gebundeld in ijs. Equilibreer bij kamertemperatuur de master mix die is opgeslagen bij 4 ° C.
2. Een mix van 1 µL van doel assay, 1 µL van referentie gene bepaling en 10 µL van master mix voorbereiden op 3 wordt gerepliceerd van elk monster en kalibratoren gebundeld. De mix met inbegrip van een negatieve controle (water) en 2 extra monsters te bereiden.
3. In een 96 goed plaat, aliquoot 12 µL van het mengsel in elk putje. Doen niet pipet of spin tubes.
4. Voeg 8 µL (concentratie van 2,5 ng/µL) van elke steekproef van DNA en kalibratoren gebundeld in elk putje. Doen niet pipet of spin tubes. De tip voor elk putje wijzigen
   Opmerking: 30 DNA-monsters kunnen worden verwerkt voor elk Real-time experiment met behulp van de 96-wells-plaat: 30 x 3 monsters + 1 x 3 kalibratoren gepoolde + negatieve controle = 94.
5. Kort spin down de plaat duikt met 1.000 x g.
6. De plaat met behulp van het volgende protocol worden uitgevoerd: Houd fase bij 95 ° C gedurende 10 min, 40 cycli bij 95 ° C voor 15 s, en 60 ° C gedurende 1 minuut.

6. data-analyse en interpretatie

1. Stel in de sectie "optie", hieronder de resultaten van de plot versterking, de Ct-drempel op 0,2 voor het eerste doel-gen geanalyseerd. Herhaal de set voor elk doel of verwijzing genen. De real-time PCR om bestand te exporteren in de extensie .txt, drukt u op 'Exporteren' in de werkbalk. Vlag alleen "resultaten" selecteert u in de gegevens exporteren → Kies als bestandstype de extensie .txt → druk op 'start export' → dicht de exporteerfunctie.
2. Open de software van de analyse en de .txt is gekoppeld (werkbalk → importeren) importeren.
3. Selecteer de naam van het bestand te analyseren en selecteer de instelling die analyse door toolbar (play symbool).
4. De kalibrator monster en de bekende aantal exemplaren van het doel (bijvoorbeeld 1 exemplaar voor AR gene) opgeven. Druk op "apply".
5. Voor elk monster, weglaten een goed met verschillende delta Ct (ΔCt) in vergelijking met andere wells.
6. Opnieuw analyseren het experiment (druk op play symbool).
7. Evalueren van de resultaten door de exemplaaraantal bar perceel of de tabel.
   Opmerking: De tabel van de resultaten bevat talrijke parameters zoals vertrouwen, de Z-score en replicatieonderzoeken geanalyseerd die nuttig voor interpretatie van de resultaten zijn kunnen.

Resultaten

Totale cfDNA concentratie was kwantificeerbare door spectrofotometrie voor alle monsters geanalyseerd, toont een mediaan van 6.12 ng/µL (bereik: 2,00-23.71 ng/µL) voor serummonsters en een mediaan van 3.21 ng/µL (bereik: 2.31-8,49 ng/µL) voor plasma monsters. We een totaal van 115 monsters geanalyseerd door real-time PCR-experimenten.

Test gevoeligheid evalueerden gemengde serum DNA van patiënten met hoge of lage winst voor ...

Discussie

AR GN-analyse in serum en plasma monster vormt een nieuwe, niet-invasieve benadering voor de gelaagdheid van castratie resistente prostaatkanker (CRPC) patiënten. Onlangs is gebleken dat de AR GN vermag voorspellen resultaten bij CRPC patiënten behandeld met abiraterone en enzalutamide, vóór en na chemotherapie^7,8,9,10.

Het belangrijkste voordeel va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BD Vacutainer Serum Tubes	Becton Dickinson	367814	whole blood tube voor serum
BD Vacutainer EDTA Tubes	Becton Dickinson	366643	whole blood tube voor plasma
Ethanol absoluut	VWR		de gebruiker kan ook andere bedrijven gebruiken
TaqMan Copy Number assay	Thermo Fisher Scientific	4400291	Vooruit ontworpen en gevalideerde assays met FAM-kleurstof. We gebruikten de volgende assay: AR_assay1: hs04107225 en AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (gemodificeerd)	Thermo Fisher Scientific	4467084	Vooruit ontworpen assay gemodificeerd met VIC-kleurstof: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, mens, RNase P	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4326708	Mastermix voor Real Time PCR
QIAamp DNA Mini Kit (50)	Qiagen	51304	DNA extractiekit
MicroAmp 96-Well Plates	Thermo Fisher Scientific	N8010560	platen voor realtime PCR
NanoDrop 1000 Spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific	-	de gebruiker kan ook andere spectrofotometrische methoden gebruiken om DNA te kwantificeren
7500 Fast Real-Time PCR Systeem	Applied Biosystem	-	de gebruiker kan ook andere real-time instrumenten gebruiken
CopyCaller Software	Applied Biosystem	-	Software voor copy number analyse