Dit protocol beschrijft eerst de chirurgische procedure de permanente innesteling van een urineblaas katheter gecombineerd met externe urethrale sluitspier elektroden, en de tweede, de waardering van de functie van de urineblaas en de externe urethrale sphincter in geïmplanteerde wakker dieren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cystometric en externe urethrale sluitspier metingen in wakker ratten met geïmplanteerde katheter en elektroden waardoor voor herhaalde metingen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lagere urinewegen functie is voornamelijk beoordeeld door middel van cystometric blaas functie analyse bij knaagdieren. Conventionele cystometries worden gewoonlijk uitgevoerd als terminal analyse onder urethaan verdoving. Het is algemeen bekend dat de verdovende drugs functie van de blaas kunnen beïnvloeden. Vandaar, is het doel van deze techniek is metingen uit te voeren cystometric van de urineblaas en de externe urethrale sluitspier in licht ingetogen wakker ratten. Voor dit doel, is een blaas catheter ingeplant in de blaas koepel. Vervolgens twee elektroden bilaterale aan de externe urethrale sluitspier zijn geïmplanteerd en een elektrode grond is om een niet-reagerende skeletspieren ingehecht. De blaas catheter en de drie elektroden zijn ten slotte tunnelverbinding subcutaan aan de nek regio en op een kabelboom aangebracht. Met deze techniek, kan de lagere urinewegen worden gemeten op meerdere tijdstippen in hetzelfde dier te beoordelen van de lagere urinewegen functie. De belangrijkste toepassing van deze techniek is de opvolging van gelijktijdige urineblaas en externe urethrale sluitspier functie bij wakker gezonde ratten en na de inductie van een ziekte of letsel. Bovendien kan latere lagere urinewegen controle worden uitgevoerd tijdens de evaluatie van de ziekte/letsel en controleren van de doeltreffendheid van de behandeling.
Inleiding
Voor het analyseren van urine opslag en vernietigen van functie en dysfunctie, hebben de meeste studies knaagdier modellen gebruikt. Door middel van opeenvolgende activering van reflexen, wordt micturition geproduceerd. De coördinatie van deze reflexen is essentieel voor efficiënt leren1. Cystometric opname technieken bieden waardevolle hulpmiddelen voor het analyseren van de functie van de urineblaas onder haar neuraal controle1.
Meeste conventionele cystometries bij ratten zijn gedaan als een enkele, definitieve analyse in anesthesie, voornamelijk urethaan2, en uitsluitend richten op de urineblaas. Echter in bepaalde pathologieën als neurogene lagere urinewegen disfunctie (NLUTD) is niet alleen de urineblaas, maar ook de uitgang van de blaas, de externe urethrale sfincter, disfunctioneel3,4. Dit bemoeilijkt NLUTD follow-up, als alleen de blaas wordt onderzocht in een enkele cystometric meting. Om betrouwbare resultaten die vergelijkbaar met mensen zijn, is het essentieel voor het nauwkeurig meten van zowel de urineblaas en de functie externe urethrale sluitspier en zijn interacties2. Bovendien is het cruciaal voor functionele analyses uitvoeren bij wakker ratten als verdoving is het zeer waarschijnlijk te wijzigen van de blaas functie2,5,6. Een goede cystometric opnemen in wakker dieren is de basis voor de identificatie van blaas functie en storing7.
Het kleine dierlijke cystometry station gebruikt (bijvoorbeeldCatamount cystometry station (CCS)) is een eenheid cystometric-analyses uitvoeren in kleine wakker dieren8. Door middel van een permanente blaas katheter en geïmplanteerde externe urethrale sluitspier elektroden, kunnen herhaalde metingen over een langere tijd perioden2worden uitgevoerd. Het CCS biedt dus een waardevol instrument voor niet-neurogene en NLUTD evaluaties in het knaagdier model, waarin de pathomechanisms tijdens de follow-up van de korte - of middellange termijn veranderen kan. Daarnaast bevat deze methode een artefact verminderde cystometric-analyse met behulp van een afdekking te voeren metingen van de blaas bij wakker ratten.
In deze paper beschrijven we de chirurgische benadering om het implantaat permanent een blaas catheter en externe urethrale sluitspier elektroden, samen met de cystometric metingen bij wakker ratten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Oostenrijkse gouvernementele ethisch comité voor dierlijke onderzoek (Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, WF / V /3b) en waren met inachtneming van de vereniging voor beoordeling van laboratorium Animal Care guidelines voor dierlijk gebruik. Ratten gebruikt voor deze aanpak waren vrouwelijke, 12 weken oude Lewis ratten. Steriele instrumenten in het gehele protocol gebruiken.
1. materiële voorbereiding
-
Productie van de katheter
- Snij de katheter (polyethyleen buizen van PE-50) in de juiste lengte (20 tot 25 cm) aan de grootte van het dier.
Opmerking: Laat wat extra lengte voor tunneling en gemakkelijker verwerken. - Ene uiteinde oplaaien met een aansteker te krijgen een afgeronde tip. Selectievakje voor definitieve passende opening en botte uiteinde van de katheter.
- Plaats een 2-mm lange Siliconen slang boven de katheter tot het ligt net onder het uitlopende einde.
- Snij de katheter (polyethyleen buizen van PE-50) in de juiste lengte (20 tot 25 cm) aan de grootte van het dier.
-
Productie van de elektroden
- Bereiden een polytetrafluorethyleen-gecoat staaldraad van 20-25 cm (juiste lengte afhankelijk van de grootte van het dier).
- Bereiden van een zilver draad 2 cm in lengte en draai de uiteinden tot een kleine lus blijft. Strippen af 2 mm van de Teflon isolatie aan de ene kant. Soldeer de gedraaide zilver draad die eindigde met de gestripte stalen draad.
- Conventionele nagellak op de coating zone van toepassing. 4-mm lange polyethyleen slang voor te bereiden over de gecoate regio, en verzegel het einde door het toepassen van warmte naar het samenpersende pincet.
2. dierlijke voorbereiding
-
Anesthesie
- Gebruik een passende verdoving cocktail goedgekeurd door de instelling voor een algemene verdoving.
- Bereiden van anesthesie cocktail met medetomidine (0,15 mg/kg), midazolam (0,08 mg/kg) en fentanyl (0,01 mg/kg), en inject intramuscularly door een spuit van 1 mL met een 27 meter naald.
-
Chirurgische voorbereiding
- De buik scheren met een elektrisch scheerapparaat, met inbegrip van het genitale en terug regio op het niveau van de scapulae.
- Desinfecteren buik en hals van regio's met 70% ethanol eerste en dan 3 afwisselend scrubs met Povidon-jodium oplossing.
3. blaas Catheter implantatie
- Een lage middellijn laparotomie op niveau van de derde en vierde speen (ongeveer 2 tot 2,5 cm lengte) uit te voeren met behulp van een scalpel voor de huid en een chirurgische schaar voor de buikspier.
- Blootstellen van de blaas door de buikwand in de cranio-caudal richting begeleiden en repareren in deze positie door het plaatsen van de achterkant van een verlostang achter de blaas om te voorkomen dat re-positionering.
- Plaats een portemonnee-snarige hechtdraad rond de koepel van de blaas met behulp van een 6-0 niet-absorbeerbare monofilament hechtdraad met een naald taper-tip.
- Incise van de koepel van de blaas binnen de portemonnee-tekenreeks, hetzij door scalpel tip of 18G naald, de blaas catheter invoegen (Zie Protocol stap 1).
- Plaats de katheter gevuld met de steriele fysiologische 0,9% natriumchlorideoplossing en blaas katheter zorgvuldig worden ingetrokken totdat uitlopende opening van de katheter net onder de blaas koepel ligt.
- Beveilig de portemonnee-snarige hechtdraad rond de katheter en maken een stop-hechtdraad rond katheter lichaam voor verdere fixatie.
- Controleren op lekkage via de blaas koepel door langzaam vullen van de blaas via de katheter met steriel fysiologisch 0,9% natriumchlorideoplossing.
4. urethrale sluitspier elektrode implantatie
- Drie elektroden voorbereiden implantatie (Zie Protocol stap 1).
- Markeer een elektrode met een permanente gekleurde viltstift voor verdere identificatie van de toekomstige null elektrode. Desinfecteer elektroden met 70% ethanol.
Opmerking: De katheters zijn niet geschikt voor warmte- en chemische sterilisatie procedures. Koude steriliseren in plaats daarvan de elektroden gedurende 24 uur. - Uitbreiden van de buik incisie door chirurgische schaar tot het schaambeen, maar dus knip de symphysis pubica niet af.
- Identificeren van de urethra en maken een botte zak met behulp van fijne pincet aan weerszijden van de urinebuis, maar voorkomen dat trauma van vaartuigen of zenuwen.
- Identificeren van geschikte vet zakjes dicht bij de urethra binnen dit venster.
- Positiebepaling elektroden bilateraal naar het juiste vet zakje tegen using naar de 6-0 niet-absorbeerbare monofilament hechtdraad.
Opmerking: De uiteindelijke positie van de elektroden moeten bilaterale de mid regio van de urinebuis. - Binden de twee elektroden samen met 6-0 niet-absorbeerbare monofilament hechtdraad.
- Sutuur (geologie) de gemarkeerde null elektrode naar de spieren van de buikwand binnen afstand van urethra. Alle drie elektroden samen met een enkele hechtdraad binden.
5. tunneling
- Maak een kleine huid incisie tussen de scapulae voor tunneling.
- Tunnel elektrode draden aan de hals en doen een definitieve controle voor juiste plaatsing, en het controleren van de positie van de elektroden na tunneling.
- Tunnel blaas katheter naar het niveau van de scapulae - aandacht besteden aan de blaas terwijl de katheter Voorkom blaas draaien tunneling. Voor dit doel, houdt u de katheter net voor het invoeren van de koepel van de blaas om te voorkomen dat het verdraaien van de blaas.
- Sluit de buikspieren aan te spannen door doorlopend of onderbroken steken met een 4-0 polyfilament absorbeerbare hechtdraad. Sluit de huid incisie door onderbroken matras hechtingen.
- Rekken het dier aan de volle lengte te hebben van de maximale uitzetting van de draden van de elektrode en de katheter.
- Katheter en elektrode draden door een hechtdraad gezonken-in naar de schouder spier vast.
- Sluit de huid door een enkele steek met de 4-0 hechtdraad.
6. harness montage
- Een harnas aan het dier door te trekken van het harnas over het hoofd van het dier passen en trek de voorpoten naar een eindpositie ligt tussen de twee silicone strips. De harnas grootte controleren door het gewicht van het dier voorafgaand aan de operatie met de distributeur.
- Tunnel de blaas catheter naar het gat in het midden van de kabelboom en de elektroden door het op maat gemaakte gat met een boor aangepast aan de afmetingen van de elektrode draden.
- Pas het harnas door te trekken de silicone strips. Aanpassen van het harnas, dus het is niet te los, maar zorgen dat wat ruimte blijft om het onderhouden van het bewegende vermogen van de rat.
- Gebruik een kabel riem om te bevestig silicon strips.
- Gesneden van de lengte van de blaas catheter tot 3 cm boven het harnas, verbinden met de 23-G-Stop, en ten slotte aan de kabelboom repareren.
7. vervaardiging van de elektrode-Connector
- Drie kleine heat shrink buizen (een andere kleur voor de nul elektrode) voor te bereiden. Twee verdere warmte krimpen buizen in een passende grotere omvang voor te bereiden.
- De lengte van de elektrode draden aan een optimale lengte om later aansluit aan de vrouwelijke stekker zonder te los of te kort te kunnen verkorten. Strip uit de Teflon isolatie van de drie draden (ongeveer 2 mm), en draai de stalen draden naar een tekenreeks.
- Grote warmte krimpen buizen op alle draden plaatst, plaatst de kleine buizen afzonderlijk voor alle drie draden en gebruik de gekleurde tube gedurende de null elektrode.
- Soldeer de elektroden naar de mannelijke 3-verbinding-stekker. Plaats de null elektrode in het midden en krimpen van de drie kleine afzonderlijke buizen bovenstaande gesoldeerd gebied.
- De eerste van de grotere buizen aan het einde van de buis van de afzonderlijke uitgangen en de laatste grote buis krimpen tot aan de grens van de mannelijke stekker.
- Sluit de mannelijke stekker aan de vrouwelijke connector bevestigd aan het harnas, en de moeilijke met een stukje tape voor meer veiligheid.
8. na chirurgie Care
- Chirurgische gebieden gereinigd en ontsmet met Povidon-jodium.
- Plaats het dier op een verwarming pad totdat wakker en 0,9% natriumchlorideoplossing geven voor het vervangen van het water, op basis van de richtsnoeren van de lokale dierenverzorgers tijdens en na de operatie.
- Beheren van analgetica (meloxicam 1 mg/kg) en antibiotica (sulfadoxinum 200 mg, 40 mg, 15 mg/kg trimethoprimum) als een gecombineerde injectie oplossing subcutaan. Tweemaal daags, geven pijnstillers ('s morgens en 's avonds), en één keer per dag geven antibiotica, voor vijf opeenvolgende dagen.
- Antibiotica bij de dezelfde dosering voortzetten over de hele follow-up periode op twee tot drie injecties per week.
- Sortie werkster voor juiste montage van de kabelboom en het uitvoeren van een chirurgische veldkeuring, vooral in de nek regio. Het harnas aanpassen als het te strak wordt door zorgvuldig te trekken op de silicone strips.
- Spoel de katheter regelmatig eenmaal per week om te voorkomen dat een blokkade.
9. voorbereiding van de meting van de Cystometric
- De eerste metingen van de cystometric na zes dagen van de post-operatieve uitvoeren
Opmerking: Eerdere metingen kunnen worden beïnvloed door pijnstillende medicatie en/of urothelial irritatie als gevolg van de implantatie van de katheter. - Zet de hoofdschakelaar, de computer, en de EMG versterker.
- Vul de spuitpomp met kamertemperatuur opgewarmd 0,9% natriumchloride. De drie-weg connectors één na de ander op een aflopende wijze geopend, vanaf de pomp, en spoel de buizen.
Opmerking: Controleer zorgvuldig voor resterende luchtbellen, zoals bubbels zal het veranderen van de metingen van de cystometric.
10. kalibratie
- Start het programma uroflowmeter-software en ga naar kalibratie.
- Sluit de drieweg-connector aan de pomp en het dier.
- Open de klep aan de aangesloten manometer en druk op nul in het programma.
- Druk op de manometer tot 100 mmHg aanpassen en 100 mmHg druk in het programma. Pers bevestigen om op te slaan van de aanpassing van de kalibratie. Het venster zal automatisch sluiten.
- Sluit de klep op de manometer en open de drieweg-connectoren van de pomp tot het dier klaar te zijn voor de meting.
11. dier Database (dier DB)
- Om te registreren dieren, geven het dier een beknopte-ID.
- Verdere gegevens invoeren, zoals de datum van het GCB, begin van de behandeling, de datum van inplanting van de katheter, experimentele groep en de geboortedatum van het dier.
- Tot slot als u wilt de gegevens, druk op "opslaan record" en opslaan naar bestand.
12. meting instellingen vóór opname
- De softwareprogramma starten door op de startknop.
- Het dier te selecteren en druk op tarra schaal en nul druk.
Opmerking: Let terwijl de plaatsing van het dier in de afdekking, zodanig dat geen kabel vastzit, omdat dit tot een verwijdering van een draad van de EMG-kabel leiden kan.
13. dierlijke voorbereiding
- Verwijder de stekker van de katheter en trek de stekker van de EMG uit het harnas.
- Zet de rat in de afdekking. Sluit de afdekking en vergrendelen van het harnas met een klem.
- Haal de katheter en EMG stekker uit de afdekking.
- Plaats de afdekking in de catamount eenheid. De staart doorverbonden met de buis en monteren van de buis met tape aan het vermijden van bewegingen.
- Sluit de mannelijke EMG aan de opname vrouwelijke EMG connector.
- Druk opnieuw op nul druk en sluit vervolgens de katheter aan de vulling/opname-buis. Controleer de druk in de software.
Opmerking: Druk moet positief, rond 5-10 cm H2O op basislijn. Als de druk negatief is, druk op nul druk, katheter verbreken de canule en daarna weer de katheter.
14. opname
- Als de katheter en de EMG-kabel zijn aangesloten, drukt u op run pomp en opname.
- Aanpassen van de snelheid van de vulling aan de experimentele behoeften in l/min.
- Opmerking de keer de opname is gestart en de temperatuur van de kamer in het logboek.
- Om te stoppen met het opnemen van cystometric, stop de pomp door op te drukken uitvoeren pomp en druk op nogmaals opnemen.
Opmerking: De pomp zal uitschakelen en het groene licht aan de pomp is uitgeschakeld. - Koppel de katheter en de 23G stop stekker gebruiken om af te sluiten van het einde van de katheter. De EMG kabel.
- Open de voorzijde van de afdekking en begeleiden van de rat uit de afdekking.
Opmerking: Rat voorzichtig en volgen van de draden om te voorkomen dat eventuele vergrendeling van kabels. - Sluit de katheter weer aan op het harnas. Opnieuw sluit de EMG-stekker aan de kabelboom en leg een stuk tape rond de stekker.
Opmerking: Indien het dier een pathologische aandoening voor lagere urinewegen heeft, kenbaar maken de blaas eind handmatig om te voorkomen dat overdistention van de blaas. - Zet het dier terug in zijn kooi.
- Sluit het programma door afsluiten te drukken.
- Reinig de afdekking en het bekerglas.
- Sluit de connectors van de drie-weg naar de pomp en de dierlijke uitlaat.
- Afsluiten van de computer, het EMG-apparaat en het systeem via de hoofdschakelaar.
Opmerking: De gegevens worden opgeslagen in de afzonderlijke map "Gelogde gegevens" met het bestand van de submap van de gemeten rat-ID. Enkele opnamen zijn in de interne rat ID mappen gesorteerd op datum.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een schema waarin het proces van wakker cystometric metingen wordt weergegeven in Figuur 1 en de interne anatomie voor blaas katheter implantatie is afgebeeld in Figuur 2. Operatie neemt ongeveer 2 h. postoperatieve analgesie en antibiotica, zoals beschreven in het protocol betrekking hebben op pijn en infecties meer dan vijf dagen na de operatie. Geen tekenen van pijn werden daarna opgemerkt. Tweemaal dagelijks zorgvuldige inspe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft de chirurgische procedure van een permanente katheter en urethrale sluitspier elektroden implantatie en de opname van techniek in wakker, licht ingetogen ratten met inbegrip van zowel de gelijktijdige analyse van de urineblaas cystometric en externe urethrale sluitspier.
Kritische stappen tijdens de operatie zijn de zorgvuldige inplanting van de blaas catheter, lekkage en uitgebreide manipulatie te voorkomen. Bovendien is een nauwkeurige implantatie van de elektroden op...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben niet alle bevestigingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Polyethylene tubing PE 50 | Becton Dickinson | 427411 | Catheter |
| Prolene 6-0 (BV-1, 9.3 mm, 3/8c) | Ethicon | EH7403H | Suture |
| Teflon coated steel wire | Cooner wire | AS631 | Elektrodemateriaal |
| Silver wire 0.250 mm | World Precision Instruments | AGW1030 | Elektrodemateriaal |
| Rotilabo - PVC tube | Carl Roth | 97241 | Harnas |
| Vicryl rapide 4-0 (P-3, 13 mm, 3/8c) | Ethicon | V4940H | Suture |
| Quick Connect Single Harness | SAI Infusion Technologies | QCH-23CW | Harnas |
| Shrinking tubes | ChiliTec | 17894 | Elektrode solderen |
| Soldering wire Pb60 Sn40 | Stannol | LD0029 | Elektrode solderen |
| Fluxing agent 157 | Castolin Eutectin | 157 0150 | Elektrode solderen |
| Conn Unshrouded Header HDR 3 POS, 2.54mm Solder ST Thru-Hole Box | Preci-dip | 801-87-050-10-001101 | Elektrode solderen |
| Conn Socket Strip SKT 50 POS 2.54mm, Solder ST Thru-Hole Box | Preci-dip | 890-18-003-10-001101 | Elektrode solderen |
| Rat Cystometry Package (contains pump, scale, pressure transducer, hardware for cystometric analysis) | Catamount Research and Development Inc. | CAT-CYT-R | |
| Differential amplifier with active headstage | AD instruments | DP-311 | EMG-versterker |
| Restrainer Medium size for rats 200-300 g | emka Technologies | HLD-RM | |
| Uro Dyn Software | Zürich of University | MTA-based | |
| Female rats (Strain Lewis) 12 weeks of age | Charles River, Sulzfeld, Germany | dieren |
Referenties
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30, 636-646 (2011).
- Schneider, M. P., et al. A novel urodynamic model for lower urinary tract assessment in awake rats. BJU Int. 115, Suppl 6. 8-15 (2015).
- Cruz, C. D., Cruz, F. Spinal cord injury and bladder dysfunction: new ideas about an old problem. Scientific World Journal. 11, 214-234 (2011).
- de Groat, W. C., Yoshimura, N. Plasticity in reflex pathways to the lower urinary tract following spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 123-132 (2012).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19, 87-99 (2000).
- Cannon, T. W., Damaser, M. S. Effects of anesthesia on cystometry and leak point pressure of the female rat. Life Sci. 69, 1193-1202 (2001).
- Patra, P. B., Thorneloe, K. S. Enhanced sensitivity to afferent stimulation and impact of overactive bladder therapies in the conscious, spontaneously hypertensive rat. J Pharmacol Exp Ther. 338, 392-399 (2011).
- Herrera, G. M., Meredith, A. L. Diurnal variation in urodynamics of rat. PloS One. 5, e12298(2010).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F1248-F1253 (2008).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251, R1177-R1185 (1986).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
