Methodenartikel

Een efficiënte en eenvoudige methode om de NK- en T cellijnen van patiënten met chronische actieve Epstein - Barr virusinfectie

DOI:

10.3791/56515

⸱

30 maart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een eenvoudige methode voor het verkrijgen van T-cel en NK klonen van CAEBV patiënten werd ontwikkeld met hoog rendement, een kleine hoeveelheid van perifeer bloed en een lage dosis van IL-2.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een aantal methoden zijn beschreven om NK/T cellijnen van patiënten met lymfoom of proliferatieve syndroom geweest. Deze methoden die feeder cellen, gezuiverde NK of T cellen met maar liefst 10 mL bloed of een hoge dosis van IL-2. Deze studie presenteert een nieuwe methode met een krachtige en eenvoudige strategie om NK en T cel lijnen door het kweken van de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) met de toevoeging van recombinante menselijke IL-2 (rhIL-2), en zo weinig als 2 mL bloed gebruikt. De cellen kunnen verspreiden snel in twee weken en worden gehandhaafd voor meer dan 3 maanden. Met deze methode 7 NK of T cel lijnen gelegd met een hoog slagingspercentage. Deze methode is eenvoudig, betrouwbaar, en die van toepassing zijn tot het vaststellen van cellijnen van meer gevallen van CAEBV of NK/T-cel lymfoom.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epstein - Barr virus (EBV) is alomtegenwoordig en infecteert niet alleen B-cellen, maar ook T en natural killer (NK) cellen, waardoor een aantal EBV-geassocieerde NK/T proliferatieve ziekten (LPD) en lymfoom/leukemie, zoals EBV-geassocieerde hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-achtige lymfoom, extranodal NK/T-cel lymfoom, nasale type en agressieve NK-cel leukemie1,2,3. Daaronder is ernstige chronische actieve EBV (SCAEBV) ziekte, die vooral in Oost-Azië incident, en die wordt nu beschouwd als een LPD veroorzaakt door klonen expansie van EBV-geïnfecteerde T of NK cellen4,5,6, 7, maar zonder de schijnbare immunodeficiëntie presenteren in klierkoorts (IM)-als symptomen waaronder koorts, hepatosplenomegaly, lymfadenopathie en lever dysfunctie aanhoudend of productlevering, evenals hoge EBV-DNA laden de perifeer bloed8,9. Patiënten met CAEBV hebben een slechte prognose10,11, en de pathogenese en de rol van de EBV is onduidelijk. Daarom, cellijnen afgeleid van EBV-geassocieerde NK/T proliferatieve ziekten en lymfomen zijn zeer behulpzaam als cel modellen voor verduidelijking van het mechanisme van EBV NK of T-cel proliferatie en haar relatie met een hoge incidentie van leukemie geïnduceerde of lymfoom.

Tot op heden zijn verschillende cellijnen opgericht met verschillende technieken12,13,14,15,16. Een menselijke NK cellijn, NK-YS, ontstond uit de NK-cel lymfoom/leukemie, door samen met een muis stromale cellijn kweken als feeder, en in aanwezigheid van rhIL-2 bij een concentratie van 20U per mL15. KAI3 was een andere NK cellijn opgericht met ingang van patiënten met een ernstige mug allergie of SCAEBV met autologe lymphoblastoid cellijn (LCL), B-cellen getransformeerd door EBV, als feeder cellen en toevoeging van rhIL-2 at 100U/mL16. SNK6 en SNT8 werden afgeleid van tumor weefsels van nasale NK/T-cel lymfoom patiënten door toevoeging van hoge dosis van rhIL-2 (700U/mL)12. Met soortgelijke techniek was de SNK-1 cel van CAEBV patiënten, gekweekt uit PBMC door verwijderen van T-cellen en het toevoegen van 700U/mL van rhIL-213,17. SNT13 en SNT15 werden opgericht door CD4 +- en CD8 + cellen18te verwijderen. Tot nu toe, werden andere T-cel en NK cellijnen van EBV-NK/T LPD patiënten alle ontwikkeld met deze methode19.

De nadelen van de hierboven genoemde bestaande methoden omvatten de tewerkstelling van feeder cellen, de eis van een hoge dosis IL-2, of het gebruik van maar liefst 10 mL bloed, de zuivering van NK/T-cellen, die is een grote uitdaging in de kliniek worden de noodzaak om te verifiëren welke soorten cel dat EBV latent infecteert vóór begin aan cultuur. Zoals CAEBV treedt vooral op bij kinderen in Azië, is 10 mL bloed niet makkelijk te verwerven in alle regio's. In deze studie ontwikkelden we een nieuwe eenvoudige methode met een hoog slagingspercentage om NK en/of T cel lijnen door PBMC kweken van CAEBV patiënten met een lage dosis van rhIL2 en een volume van 2 mL van volbloed zonder feeder cellen. De resultaten van deze methode gebleken zijn hoge efficiëntie en tijdwinst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Instituut voor genetica en ontwikkelingsbiologie, Chinese Academie van Wetenschappen, en het protocol volgt de institutionele richtsnoeren voor menselijk welzijn.

Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schematische voorstelling van de werkstroom.

1. isolatie van in PBMC van CAEBV patiënten

  1. Zuiveren van primaire PBMC van 2 mL van de volbloed van CAEBV patiënten door verloop (bijvoorbeelddensiteitgradiënt-plaque) centrifugeren na instructies van de fabrikant. Als alternatief, ontdooi cryopreserved PBMC van vloeibare stikstof met RPMI 1640 medium.
  2. Voeg 2 µL van trypan blauw (0,4%) naar 18 µL celsuspensie, 3 min wachten om vlekken van cellen, spoel de suspensie op de plaat van de teller cel en meten van de concentratie en de levensvatbaarheid met een geautomatiseerde cel teller de cellen.
  3. Voorbereiden van de celsuspensie bij een dichtheid van 2-3 × 106 cellen/mL aangevuld met volledige RPMI 1640-kweekmedium dat 20% menselijk serum (warmte geïnactiveerd bij 56 ° C), 2 mM L-glutamine, en antibiotica (100 µg/mL streptomycine, 100 U/mL penicilline). Zaad 1 mL PBMC schorsing per putje in 24-well cel cultuur platen.
  4. Voeg 150 U rhIL-2 per putje.
  5. Plaats de platen van de cultuur in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
  6. Op dag 2, het observeren van de morfologie van de cel onder een microscoop (200 X vergroting); cellen zijn in goede conditie wanneer ze licht en ronde zijn.

2. uitbreiding van de cellen en de nummering van de levensvatbare cellen

  1. Observeren van de morfologie van de cel onder een microscoop (200 X vergroting) en de voorwaarde van celgroei controleren door de nummering van de cellen voordat u wijzigt medium: 2 µL van trypan blauw (0,4%) aan 18 µL celsuspensie toevoegen en bereken de concentratie de cellen (zie 1.2, Figuur 2).
  2. Verwijderen van 500 µL van het medium in een 24-well-plate, en toevoegen van 500 µL verse volledige kweekmedium. 150U rhIL-2 per putje toevoegen.
  3. Wijzig het medium twee keer per week zoals in stap 2.2.
  4. Trekken de cel groeicurve (Figuur 3).
  5. Wanneer de levensvatbare cellen concentratie groter is dan 5 × 10-6/mL, verdeel cellen in nieuwe putten met een concentratie van 1-2 × 10-6 cellen/mL in elk putje. Dit proces duurt 2-4 weken.

3. cel fenotypering door Stroom Cytometry

  1. Wanneer cellen hebben uitgebreid, verzamelen van 1 × 10-6 cellen om te bepalen van de fenotypen van cellijnen. Centrifugeer bij 240 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur cellen (NK/T cellen neerslaat op de onderkant van de buis).
  2. Verwijder het supernatant, wassen van de neerslag door 7 mL PBS toe te voegen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 240 x g bij kamertemperatuur. Eenmaal herhaald.
  3. 200 µL menselijk serum toevoegen aan elke buis, meng goed en laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
  4. Centrifugeer cellen bij 240 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen bij 1 × 10-6/mL met koude PBSA (PBS+0.2%BSA). Verdeel cellen in 5 buizen, elke buis met 2 × 105 cellen.
  5. Centrifuge cellen bij 240 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met PBSA buffer of PBSA met 10 µL PE (of PE-Cy7) en 10 µL FITC label antilichamen om vlekken van cel receptoren van T of NK cellen op ijs, zoals is aangegeven in Figuur 4. Cellen met PBSA buffer geschorst worden gebruikt als een negatieve controle.
  6. Incubeer de cellen met antilichamen voor 20-30 min op ijs in het donker.
  7. Wassen van de cellen tweemaal met koude PBSA, resuspendeer de cellen met 300 µL koude PBSA.
  8. Analyseer het fenotype van de cel met een cytometer van de stroom.
    1. De Flow Cytometer in 'Werkblad maken' voorwaarde instellen. De experimentele sjabloon met een dot-perceel waarin vooruit scatter (FSC) versus kant scatter (SSC) instellen.
    2. Laad de isotype controle buis voor het optimaliseren van de FSC en SSC spanningen, en optimaliseren van de FSC-drempelwaarde te elimineren puin zonder zich te mengen met de bevolking van de cel van belang. Verwijder alle parameters staan, behalve de FSC, WS, FITC, PE en PE-Cy7.
    3. Compensatie met behulp van het besturingselement isotype en een enkele positieve controle in elke groep 2-kleur analyse uit te voeren.
    4. Laden van monsters en maak HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 en CD3 VS CD16 dot plots tonen verschillende bevolking van cellen.
      Opmerking: PBMC werden gebruikt voor het uitvoeren van compensatie met behulp van het negatief/isotype-besturingselement en de enkele positieve controle. 2-kleur immunofluorescentie met stroom cytometer werd routinematig gebruikt voor het analyseren van de expressie van oppervlakte markers. De volgende antistoffen zijn inbegrepen: anti-HLA-DR, anti-CD4 anti-CD16 geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 geconjugeerd met phycoerythrin (PE) en anti-CD19 geconjugeerd met PE-Cy7.

4. uitbreiding en cryopreservatie van NK/T cellen

  1. Het medium veranderen nadat de cel fenotype analyse is voltooid. Verwijder de helft van het supernatans dat voorzichtig en raak de cellen aan de onderkant van de plaat. Voeg een gelijk volume verse kweekmedium dat 300 U/mL rhIL-2 aan de platen van de cel.
  2. De helft van het medium wijzigen om de 3 dagen (als 2.2) tot de cel clusters zijn duidelijk zichtbaar onder de Microscoop (Figuur 2). Dit proces duurt doorgaans 2-3 weken.
  3. Overbrengen in de cellen van 24-Wells-platen T25 cultuur kolven na het mengen van verschillende putjes van de dezelfde bloedlijn. Verdubbel de hoeveelheid kweekmedium het gele blijkt tot het volume van het medium breidt uit naar 10-15 mL. RhIL-2 met de concentratie van 150 U/mL toevoegen.
  4. Middellange 24u wijzigen voordat u bevriezing na 2-3 weken groeien, wanneer de cel massa met het blote oog kan worden waargenomen. Maatregel cel concentratie met een teller van de cel.
  5. De celsuspensie gedurende 5 minuten bij 240 x g centrifugeren en resuspendeer de pellet cel bij een dichtheid van 5-10 x 106 cellen/mL met de bevroren stockoplossing waarin foetale runderserum 90% en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Bevriezen met een snelheid van 1 ° C per min tot-80 ° C en breng direct in vloeibare stikstof.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na 3 dagen cultuur tijdens de totstandbrenging van cellijnen, wordt de polymorfe cellen beginnen te verschijnen (Figuur 2). Na 7 dagen groeien cellen snel, zoals het aantal en de levensvatbaarheid van cellen worden verhoogd met een hoge snelheid (Figuur 3). Kleine clusters van cellen zijn duidelijk zichtbaar na 10-14 dagen groeien, wanneer de concentratie van de cel kan groter zijn dan 3-6 × 10-6. In deze periode, moet...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol, heeft een nieuwe techniek voor de vaststelling van NK/T cellijnen van volbloed van CAEBV patiënten ontwikkeld. Vergeleken met de bestaande methoden, is het grote voordeel van deze methode zijn eenvoud en zijn eis van slechts een kleine hoeveelheid bloed, terwijl het vertoont een hoog slagingspercentage en goede voorwaarden voor de levensvatbaarheid van de cellen. Bovendien kunnen NK/T cellijnen worden vastgesteld door het kweken van PBMC zonder eerst te controleren de celtypes het EBV latent geïnfecteerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.Z., X.Z. en X.C. zijn mede-uitvinders op in afwachting van octrooi-aanvragen die betrekking hebben op mogelijke toepassingen van deze methode voor de vaststelling van NK/T cellijnen en de cellijnen gevestigd in deze studie. D.Z., X.Z. en X.C. verklaren geen concurrerende financiële belangen bij dit werk. De resterende auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de sleutel projecten van Chinese Academie van Wetenschappen (KFZD-SW-205), strategische biologische middelen technologie steunregeling van Chinese Academie van Wetenschappen (CZBZX-1 en ZSSB-004) en door subsidies van de National Science Foundation of China) 81401640) en Shanghai natuurwetenschappen Fonds (14ZR1434800).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hu HLA-DR FITCBD560944antilichaam voor FACS
Hu CD4 FITCBD555346antilichaam voor FACS
Hu/NHP CD8 PEBD557086antilichaam voor FACS
Hu CD3 PEBD555340antilichaam voor FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406antilichaam voor FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31BD556647antilichaam voor FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728antilichaam voor FACS
human IL-2Roche11147528001
human serumMRCCCC118-125
CO2 incubatorSANYO
CentrifugeTechcompCT6TCentrifugatie
microscopeOLYMPUS CKX53CKX53
Geautomatiseerde celtellerCountstarIC 1000Voor celtelling
24 wel celkweekclusterCorning Incorporated3524Polystyreen platen
25cm2 celkweekflesNest707001Polystyreen
FBSGibco10270Component van celmedium
RPMI Medium 1640life22400089Voor celmedium
L-GlutamineAmresco374Component van celmedium
100 x streptomycine penicilline oplossing BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Component van celmedium
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Voor in vitro isolatie van lymfocyten
DMSOSigmaD2650Voor het invriezen van cellen
flow cytometerBDBD FACSAria II
softwareBDBD FACSDiva softwareFACS analyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NK T cellijnenchronisch actieve EBVmononucleaire cellen uit perifeer bloedrecombinant menselijk IL 2flowcytometrische analysegradi ntcentrifugatieonderhoud van celculturenfenotypebepalingmonitoring van celproliferatiecryopreservatietechniek

Gerelateerde artikelen