Methodenartikel

Synthese en evaluatie van een Ruthenium gebaseerde mitochondriale Calcium opname Inhibitor

DOI:

10.3791/56527

⸱

26 oktober 2017

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een protocol voor de synthese, zuivering en karakterisering van een ruthenium gebaseerde remmer van mitochondriale calcium opname wordt gepresenteerd. Een procedure voor de evaluatie van de werkzaamheid bij zoogdiercellen permeabel is aangetoond.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We detail de synthese en de zuivering van een mitochondriale calcium opname inhibitor, [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)]5 +. De geoptimaliseerde synthese van dit samengestelde begint uit [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1 M NH4OH in ongeopende verpakking, een groene oplossing oplevert. Zuivering wordt bereikt met catie-uitwisseling chromatografie. Deze compound is gekenmerkt en geverifieerd als puur door UV-vis en IR spectroscopie. De mitochondriale calcium opname remmende eigenschappen worden beoordeeld in permeabel HeLa cellen door fluorescentiespectroscopie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale calcium is een belangrijke regulator voor een aantal processen die essentieel voor normale cel functie zijn, met inbegrip van energieproductie en apoptosis. 1 , 2 , 3 de mitochondriale calcium uniporter (MCU), een ion vervoerder eiwit dat zich op de innerlijke mitochondriale membraan bevindt, regelt de toestroom van calciumionen in de mitochondriën. 4 , 5 , 6 chemische inhibitoren van de MCU zijn waardevolle hulpmiddelen voor de voortzetting van de inspanningen om de functie en cellulaire rollen van dit vervoer eiwit en mitochondriale calcium te studeren. De samengestelde [(HCO2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, is een van de enige bekende selectieve inhibitors voor het MCU met een gerapporteerde Kd waarde van 24 µM.7 ,8,9,10 dit complex een gemeenschappelijk onzuiverheid gevonden in commerciële formuleringen van ruthenium rood (RuRed), een triruthenium di-µ-oxo is hexacation van de formule [(NH3) overbrugd 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, die ook is gebruikt als een calcium opname inhibitor. Hoewel Ru360 commercieel beschikbaar is, is het zeer duur. Bovendien, de synthese en de isolatie van de Ru360 wordt uitgedaagd door moeilijk zuiveringsprocedures en dubbelzinnige karakteriseringsmethoden.

Alternatieve procedures voor toegang tot een Ru360 analoge, [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5hebben we onlangs gemeld. 11 deze stof remt de MCU met hoge affiniteit, vergelijkbaar met Ru360. In dit protocol beschrijven we onze meest effectieve synthese van dit samengestelde, die met [Ru (NH3)5Cl] Cl2 begint. Zuivering van het product met behulp van sterk zure kationenwisselingshars is gedetailleerd, samen met de gemeenschappelijke valkuilen voor deze procedure. Wij presenteren methoden voor karakterisering en evaluatie van samengestelde zuiverheid, en een eenvoudige benadering om te testen zijn werkzaamheid in het blokkeren van mitochondriale calcium opname af te bakenen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: geconcentreerde zuren en basen worden gebruikt in deze synthese. Gebruik van alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van de reactie met inbegrip van het gebruik van technische controles (zuurkast) en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) met inbegrip van veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en schoenen van gesloten-teen.

1. voorbereiding van [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. synthese van [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
    1. los 1,00 g van RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru gewichtsprocent, 4,1 mmol) in 5 mL H 2 O. Cool de donker bruine oplossing tot 0 ° C in een ijsbad. Toevoegen van 80% hydrazine hydraat 11 mL (0,23 mol) op een dropwise manier. De eerste reactie zal zijn krachtige met het gas van de evolutie, wat resulteert in een bruine oplossing. Laat de resulterende oplossing roer bij kamertemperatuur gedurende 16 uur; de uiteindelijke oplossing zullen donkere red.
      Let op: Hydrazine is acuut toxisch en kankerverwekkend. Daarnaast zijn de watervrije vormen van dit reagens explosieve. Zoals altijd, gebruik juiste PPE en fume hoods wanneer afhandelt. Deze oplossingen voor droogte niet doen concentreren.
    2. Toevoegen aan deze oplossing, ongeveer 5-10 mL geconcentreerde HCl om te Breng de pH op 2. Op dit punt, de oplossing zal zijn geel-bruine kleur.
    3. Warmte deze oplossing bij 105 ° C terwijl roeren gedurende 1-2 uur. Een gele vaste stof zal precipiteren uit oplossing. Wanneer niet meer neerslag zichtbaar formulieren, verwijder uit hitte.
    4. Laat de reactiemengsel afkoelen tot kamertemperatuur, en plaats dan in een ijsbad van 0 ° C voor 10 min. verzamelen de gele vaste stof door vacuüm filtratie en wassen met 5 mL ethanol en diethylether.
    5. Volledig los van het ruwe product in 15-25 mL warm water. 10 mL van een geconcentreerde HCl-oplossing in een filtreerkolf chill door deze te plaatsen in een ijsbad. Filtreer de gele oplossing in de gekoelde HCl-oplossing voor het opwekken van de neerslag van een bleke geel pure vast. Filteren van deze neerslag en wassen met elk 5 mL 0,5 M HCl, ethanol en ether.
    6. Characterize de samengestelde met behulp van IR spectroscopie. Controleer of zuiverheid door de identificatie van stretching frequenties op 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 en 801 cm -1. Een gemeenschappelijke kleine onreinheid bij 2069 cm -1 is toegewezen aan [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
  2. Synthese van 5 Cl [(OH 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)]
    1. los 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 in 50 mL 1 M NH 4 OH in een 200 mL zware muur Rondbodemkolf drukvat. Losjes cap de kolf met een stop en verwarm het reactiemengsel bij 75 ° C gedurende 6 h. verwijderen van het vuur en roer bij kamertemperatuur voor 4 dagen naar een donker groene oplossing opleveren.
      Let op! Verwarming een verzegelde vaartuig resulteert in een druk opbouw. Zorg ervoor dat u juiste druk-safe glaswerk. Voor deze reactie is het doel van de sluiting van het vaartuig te minimaliseren verlies van gasvormige NH 3. Daarom plaatst de stop losjes om vrijlating van overdruk.
  3. Zuivering door catie-uitwisseling chromatografie
    1. schorten In een bekerglas van 25 mL, 5 g kationenwisselingshars (bijvoorbeeld, Dowex 50WX2 200-400 mesh (H + formulier) in 10 mL 0,1 M HCl.
    2. Laden deze drijfmest in een kolom van 10 mL (diameter 10 mm, hoogte 15 cm) aangebracht met een 50 mL oplosmiddel reservoir. Wassen van de hars met ongeveer 20-30 mL 0,1 M HCl, totdat het eluaat kleurloze.
    3. Terug naar de oplossing van de groene reactie geïsoleerd in stap 1.2.1. Toevoegen aan deze oplossing, geconcentreerde HCl om Breng de pH op 2, op dat moment de kleur van de oplossing tot bruin verandert.
    4. Laden deze aangezuurde oplossing voor de catie-hars wisselingskolom bereid in stap 1.3.2 zachtjes waarbij het op de top van de hars. Laat het eluaat volledig drain, en doorgaan met het laden van de oplossing. Herhaal dit proces totdat de hele oplossing is toegevoegd. De top van de hars zal zijn donker bruin/zwart. De hars zal licht dalen in volume.
    5. Gebruik glaskralen ter dekking van de bovenkant van de hars. Dit zal verhinderen dat de hars worden verstoord wanneer nieuwe oplossingen worden toegevoegd.
    6. Elueer de kolom met 20 mL 1 M HCl.
    7. Elueer de kolom met een verhoogde HCl concentratie van 1,5 M (≈ 50 mL). Een gele oplossing zal beginnen te komen uit de kolom. Verhoog de HCl concentratie tot 2 M en blijf eluerende totdat het eluaat kleurloos is of een zeer groene-lichtgeel. Een totaal volume van 150-200 mL nodig zal zijn voor dit proces.
    8. Verhogen de HCl concentratie 2,5 m (20-50 mL). Het verzamelen van het eluaat als breuken in proefbuizen. Oplopen tot 3 M HCl. Het product zal Elueer uit de kolom als een groen-bruin-oplossing. Een rood-bruin-fractie kan ook beginnen te komen op de kolom. Aangezien deze breuken geoxideerde ruthenium rode onzuiverheden, doen niet zwembad met het groen-bruin-breuken.
  4. Karakterisering en controle op de zuiverheid van 5 Cl [(OH 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)]
    1. testen al de breuken uit stap 1.3.8. door UV-vis-spectroscopie. Deze taak volbrengen, voeg 100 µL van een bepaalde fractie in 2 mL 3 M NH3 en analyseren door UV-vis-spectroscopie. Breuken met puur product zal hebben een grote extinctie band op 360 nm en een minder intens extinctie op 600 nm. Absorptie bij 480 of 533 nm is indicatief van geoxideerde ruthenium rode en ruthenium rode onzuiverheden, respectievelijk.
    2. Pool van breuken met puur product en ingedampt tot droogte door roterende verdamping. Het product zal worden geïsoleerd als een groen-bruine vaste stof. Opbrengsten zijn meestal over de volgorde van 5-15 mg (10-20% rendement). Single-kristallen, geschikt voor röntgendiffractie, kunnen worden verkregen door de verspreiding van de damp van ethanol in waterige oplossingen van de compound.
    3. Om te controleren of de zuiverheid, analyseren de compound met UV-vis-spectroscopie in een oplossing van pH 7.4-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Zuiverheid kan worden beoordeeld door middel van de verhouding tussen de intensiteit van de 360 nm en 600 nm pieken. Deze verhouding is 31 voor een zuivere stof. Voor onzuivere verbindingen, zullen de ratio kleiner.
    4. Analyseren het monster in de solid-state door IR spectroscopie. Diagnostische bands zijn op 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 en 815 cm -1. Gemeenschappelijke onzuiverheid bands zijn gezien in 1762 cm -1 en 1400 cm -1, karakteristiek van NH 4 Cl. Ruthenium rood kan worden geïdentificeerd door balken 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 en 800 cm -1.
  5. Evaluatie van mitochondriale calcium opname remming door Fluorescentiespectroscopie
    Let op! De volgende procedures gebruiken zoogdiercellen. Werkzaamheden moet worden verricht in passende laminaire flow afzuigkappen die zijn gecertificeerd voor biologische veiligheid-niveau 2 (BSL2) onderzoek.
    ​ Opmerking: [(OH 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 zal worden genoemd als [Ru] in deze sectie
    1. Make gebufferd glucose-bevattende zoutoplossing (BGSS) de assay media. BGSS is een oplossing, bestaande uit 110 mM KCl, 1 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), 5 mM natrium succinaat, 30 µM ethyleen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA). Combineer alles behalve de EGTA, breng pH op 7.4. Voeg EGTA en pH aan 7.4 passen. Voor 50 mL assay media toevoegen 0,5 mL 1 mg/mL glucose.
    2. Cultuur HeLa cellen in 500 cm 2 petrischalen in Dulbecco ' s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C. Amplify HeLa cellen groeien in een 100 mm petrischaal door zaaien hen in een petrischaal van 500 cm 2. Het volume van de totale media in de grote schotel is 115 mL. Elke grote schotel zal opleveren ongeveer 18 miljoen cellen, genoeg voor twee fluorescentie spectroscopie experimenten.
      1. Groeien de cellen totdat ze bij 90-95% confluency. Media verwijderen, en spoel de cellen met 15 mL pH 7.4 PBS. Voeg toe 15 mL 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) in PBS en incubeer gedurende 10 min om de cellen los te maken. Overdracht van de cellen tot 14 mL ronde onderkant falcon buizen
    3. cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer met een omgekeerde Microscoop tellen, en het totale aantal cellen en de omvang van de media die nodig zijn voor het bereiken van 7,5 miljoen cellen per 1.8 mL volume berekenen van medium. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten op 5310 × g. Decant het supernatant en voeg de berekende hoeveelheid BGSS. Resuspendeer de cellen zachtjes.
      1. Voor deze assay, bereiden van stamoplossingen van 40 mM digitonin in dimethylsulfoxide (DMSO), 1 mM Calcium groen-5N in H 2 O en 10 mM CaCl 2 in H 2 O. [Ru] voorraadoplossingen, bereid in zuiver water, kan variëren van 1-3 mM.
        ​ Opmerking: Calcium groen-5N is lichtgevoelig. Opslaan in het donker en lichte blootstelling te minimaliseren.
    4. De fluorimeter setup om te prikkelen op 506 nm en lees de uitstoot op 532 nm met de cuvette-houder gecontroleerd op 37 ° C. voorbereiden een acryl Cuvet met een roer staaf- of wiel, 1.8 mL celsuspensie van 1.5.2 bovenstaande, 1.8 µL digitonin oplossing, 3.6 & #181; L Calcium groen-5N (oplossing), en 9 µL [Ru] (voor 1 mM stockoplossing, 5 µM eindconcentratie). Incubeer de cellen gedurende 15 min. in de fluorimeter.
      1. De gegevens lezen als de verhouding van de excitatie/emissie in plaats van de rauwe absorptie. Deze praktijk minimaliseert fouten die zijn gekoppeld aan de schommelingen in de intensiteit van de lichtbron.
      2. Uitvoeren van de eerste analyse van het monster in de afwezigheid van [Ru] voor het meten van het effect van de toevoeging van CaCl 2 op de reactie van de cellen.
      3. Begin analyse op de fluorimeter met de instellingen die zijn beschreven in 1.5.4. Wacht ongeveer 2 minuten om een stabiele emissie basislijn op en voegt 1.8 µL van CaCl 2 (eindconcentratie is 10 µM). De emissie-intensiteit onmiddellijk na de toevoeging van de CaCl 2 zal toenemen, en zal dan verval in de loop van minuten, terwijl de calciumionen de mitochondriën invoert. Wacht totdat het verval is voltooid (≈ 5 min). Toevoegen van extra calcium bolussen om te bepalen van de mitochondriale calcium opname reactie van cellen niet behandeld met [Ru].
    5. In een ander cuvette bevattende 5 µM [Ru], herhaal het experiment, zoals hierboven beschreven in 1.5.4.3. In aanwezigheid van de Inhibitor van de omwenteling, zal emissie-intensiteit toenemen, maar niet vergaan. Deze opmerking betekent geblokkeerd mitochondriale calcium opname.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode beschrijft een synthese van de mitochondriale calcium opname remmer [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] Cl2, vanaf een bekende ruthenium(III) grondstof. [Ru (NH3)5Cl] Cl-2 wordt gekenmerkt door IR spectroscopie, met vibrationele modi op 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1en 798 cm-1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mitochondriale calcium opname remmer [(OH2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(OH2)] Cl5 kan worden gesynthetiseerd uit [Ru (NH3)5Cl] Cl2, een bekende ruthenium(III) grondstof, zoals beschreven in deze procedure. De synthese van [Ru (NH3)5Cl] Cl2 wordt gemakkelijk bereikt met weinig moeite. Hydrateren na roeren RuCl3 voor 16u in hydrazine, de pH van de oplossing moet worden aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gesteund door de Cornell University. Dit werk maakte gebruik van de Cornell Center voor materialen gedeelde onderzoeksfaciliteiten, die worden ondersteund door de NSF MRSEC programma (Grant DMR-1120296). S.R.N. erkent ondersteuning via een NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) en Dr. Dave Holowka voor hulp bij de calcium-experimenten. Mening, bevindingen, en conclusies of aanbevelingen uitgedrukt in dit materiaal zijn die van de auteurs (s) en weerspiegelen niet noodzakelijk de standpunten van de National Science Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ruthenium Trichloride hydraatPressure Chemical3750
Geconcentreerd zoutzuurJ.T. Baker9535
Geconcentreerd ammoniumhydroxideMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Calcium Green 5NInvitrogenC3737
DigitonineAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
NatriumsuccinaatAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlucoseAldrichG5000
200 Ronde bodemkolvenChemGlassCG-1506-14
GlasdopChemGlassCG-3000-05
10 mm x 15 cm glazen kolom met reservoirsCustom - vergelijkbaar met Chemglass kolommenVergelijkbaar met CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Ronde bodem Falcon tubesFisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 petrischalenCorning431110
Trypan blauwThermoFisher Scientific15250061
HemacytometerAldrichZ359629
Acrylic CuvettesVWR 58017-875
UV-Vis spectrometerAgilent Model Cary 8454 
SpectrofluorimeterSLM Model 8100C
IR spectrometerBruker Hyprion FTIR met ATR-aansluiting
CentrifugeALC Model PM140R
Omgekeerde lichtmicroscoopVWR 89404-462

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ruthenium 360 analoogkationuitwisselingschromatografieUV Vis spectroscopieIR spectroscopiefluorescentiespectroscopiepermeabiliseerde HeLa cellenRuthenium Brown onzuiverhedengroenbruine fractiesammoniumhydroxidesynthese

Gerelateerde artikelen