Method Article

Met behulp van een Microfluidics apparaat voor mechanische stimulatie en hoge resolutie Imaging van C. elegans

DOI:

10.3791/56530

⸱

February 19th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, The Institute of Photonic Sciences (ICFO)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieuwe hulpmiddelen voor het mechanobiology onderzoek nodig zijn om te begrijpen hoe mechanische spanning activeert biochemische paden en lokt biologische reacties. Hier presenteren we een nieuwe methode voor selectief mechanische stimulatie van geïmmobiliseerdet dieren met een val van de microfluidic waardoor hoge resolutie beeldvorming van cellulaire reacties.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een centrale doelstelling van mechanobiology is te begrijpen van de wederzijdse invloed van mechanische belasting op eiwitten en cellen. Ondanks het belang ervan, is de invloed van mechanische belasting op cellulaire functie nog slecht begrepen. Gedeeltelijk bestaat deze kenniskloof omdat enkele hulpmiddelen gelijktijdige vervorming van weefsels en cellen, beeldvorming van cellulaire activiteit in levende dieren en efficiënte beperking van de beweeglijkheid in anders zeer mobiele modelorganismen, zoals de nematode kunt Caenorhabditis elegans. De kleine grootte van C. elegans maakt ze een uitstekende match op microfluidics gebaseerde onderzoek apparaten, en oplossingen voor immobilisatie zijn aangebracht met behulp van microfluidic-apparaten. Hoewel deze apparaten toestaan voor hoge resolutie beeldvorming, is het dier volledig ingekapseld in Polydimethylsiloxaan (PDMS) en glas, het beperken van fysieke toegang voor de levering van de mechanische kracht of elektrofysiologische opnames. Onlangs, we hebben een apparaat dat integreert pneumatische aandrijvingen met een overlapping design die compatibel is met hoge-resolutie fluorescentie microscopie. Het kanaal van de bediening wordt gescheiden van de worm-overlapping kanaal door een dunne PDMS diafragma. Dit membraan wordt afgebogen in de zijkant van een worm door druk uit te oefenen vanuit een externe bron. Het apparaat kan richten op individuele mechanosensitive neuronen. De activering van deze neuronen is beeld op hoge resolutie met genetisch-gecodeerde calcium indicatoren. Dit artikel presenteert de algemene methode met behulp van C. elegans spanningen uiten calcium-gevoelige activiteitsindicator (GCaMP6s) in hun aanraking receptor neuronen (TRNs). De methode is niet beperkt tot TRNs noch tot calcium sensoren als een sonde, maar kan worden uitgebreid tot andere mechanisch-gevoelige cellen of sensoren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gevoel van aanraking biedt dieren met cruciale informatie over hun omgeving. Afhankelijk van de toegepaste kracht, wordt aanraking waargenomen als onschuldig, plezierig of pijnlijk. De vervorming van de weefsel tijdens aanraking wordt gedetecteerd door gespecialiseerde mechanoreceptor cellen ingebed in de huid die uitdrukken van receptor eiwitten, meestal ionenkanalen. De stappen die kracht perceptie koppelen tot activering van het kanaal van de ion tijdens touch en pijn zijn niet volledig begrepen. Nog minder is bekend over hoe het huidweefsel filters mechanische vervorming en of mechanoreceptors opsporing van wijzigingen in spanning of stress1<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. apparaat Fabrication

  1. Download het bestand van de bijgevoegde masker (aanvullende bestand 1) en genereren van een chrome-masker met een commerciële dienst of in-house faciliteit. Als de kleinste dimensie op het apparaat is 10 µm (dikte van de membraan van de bedieningssleutel), ervoor zorgen dat het masker voldoende hoge resolutie, binnen ± 0,25 µm, tot de functies betrouwbaar.
  2. Volg SU-8 fotolithografie standaardmethoden (bijvoorbeeldverwijst naar24,25,26) te fabriceren van de mal voor ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SU-8 lithografie en Chip binding
Het protocol van de lithografie en PDMS molding Volg standaardprocedures. Details kunnen worden gevonden elders23,24,25,26. De PDMS moeten afschilferen van de wafer zonder problemen na het uitharden. Als de SU-8 functies tijdens PDMS peeling bestelen, was de SU-8 hechting laag of de silanization ontoereikend. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol wordt een methode voor het leveren van nauwkeurige mechanische stimulatie aan de huid van een rondworm gevangen in een microfluidic chip gedemonstreerd. Het is bedoeld ter vergemakkelijking van de integratie van fysieke stimuli voor het beantwoorden van de vragen van de biologische en wil stroomlijnen mechanobiology onderzoek in biologische laboratoria. Deze methode breidt vorige tests om te beoordelen van de functie van de mechanosensory neuronen in C. elegans. Vorige kwantitatieve en semi-kwantita.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty en Veronica Sanchez voor ondersteuning in ontwerp en productie van mutant dieren. Dit onderzoek werd gesteund door de NIH subsidies R01EB006745 (BLP), R01NS092099 (naar MBG), K99NS089942 (aan MK), F31NS100318 (aan de ALN) en ontvangen financiering van de Europese Onderzoeksraad (EOR) onder de Horizon 2020 onderzoek en de innovatie van de Europese Unie program () subsidieovereenkomst No. 715243 aan MK).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chrome maskCompugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome maskMitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome maskKuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4'' Silicon wafer (B-test)Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002MicroChem
SU-8 2050MicroChem
Spin-coaterLaurell TechnologiesWS-400BZ-6NPP/LITE
Exposure timerOptical Associates, IncOAI 150
Illumination controllerOptical Associates, Inc2105C2
SU-8 developerMicroChem
2-PropanolFisher ScientificA426F-1GAL
AcetoneFisher ScientificA18-4
Trichloromethylsilane (TCMS)Sigma-Aldrich92361-500MLCaution: TCMS is toxic and water-reactive
Sylgard 184 Elastomer KitDow CorningPDMS prepolymer
Biopsy punch, 1 mmVWR95039-090
Oxygen Plasma AsherBranson/IPC
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TWNew England Small Tube CorporationNE-1300-01
Nalgene syringe filter, 0.22 μmThermo Scientific725-2520to filter all solution, small particles would clog the chip
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm IDSolomon ScientificBPE-T50
Syringe, 1 mlBD Scientific309628for worm trapping and release
Syringe, 20 mlBD Scientific309661for gravity-based flow
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pumpGilsonto suck solutions and worms out of the chip
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channelElveflowOB1 MK3pressure delivery
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm ODMcMaster-Carr5195 T52connection from house air to pressure pump
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm ODMcMaster-Carr5195 T51connect pressure pump to small tubng
Push-to-Connect Tube Fitting for AirMcMaster-Carr5111K468metric - imperial converter
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube ODMcMaster-Carr5779 K258
Leica DMI 4000 B microscopy systemLeica
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objectiveLeica506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS cameraHamamatsuC11440-42U
Lumencor Spectra X light engineLumencorWith cyan and green/yellow light source
Excitation beam splitterChroma59022bsin the microscope
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting opticsHamamatsuA12801-01to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip
Emission beam splitterChromaT570lpxrin the image splitter
Emission filters GCamp6sChromaET525/50min the image splitter
Emission filters mCherryChromaET632/60min the image splitter

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ChipMechanical StimulationC ElegansHigh Resolution ImagingGCaMP6sTouch Receptor NeuronsPneumatic ActuatorsPressure ActuationFluorescence MicroscopyWorm Trapping

Related Articles