We illustreren een straight-forward methode om te ontlenen lymfkliertest primaire macrofagen van beenmergcellen en een eenvoudige methode om te bereiden BSA-vetzuur conjugaten. Dan tonen we dat verzadigde vetzuren leiden de dood van de cel van de macrofaag tot kan, en dergelijke celdood positief geassocieerd met cellulaire accumulatie van ceramide niveaus wordt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Verzadigde vetzuren induceren Ceramide-geassocieerde Macrophage celdood
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Macrofagen express zeer epidermale vetzuur-bindend-proteïne en obesitas vetzuur-bindend-proteïne. Zij actief opname verzadigde en onverzadigde vetzuren, die een cruciale rol spelen kan bij het reguleren van hun immuun functies. Talrijke studies hebben aangetoond dat verschillende vetzuren, verzadigde of onverzadigde, mei bezitten verschillende gevolgen voor celgroei en functie. Echter, de benaderingen die zijn gebruikt voor de voorbereiding van het vetzuur verschillen, die kan leiden tot niet-fysiologische resultaten. Serumalbumine, een natuurlijke drager voor vetzuren in perifeer bloed van zoogdieren, wordt aanbevolen voor het vormen van een conjugaat complex met het natriumzout van vetzuren te bestuderen van de functie van de vetzuren in de cellen van de zoogdieren, dus het minimaliseren van de toxiciteit van vetzuur zeep. Dus, is een eenvoudige, relatief snelle verwarming en sonicating methode ontwikkeld en gepresenteerd hier voor BSA-fatty acid geconjugeerde vorming. We beschrijven de verzadigde vetzuren, vooral stearic zuur veroorzaken ernstige celdood in muis beenmerg-afgeleide macrofagen die gebruikmaakt van een protocol. We zijn het er verder laten zien dat verzadigde vetzuren-veroorzaakte celdood positief geassocieerd met de geaccumuleerde cellulaire ceramide niveaus wordt. Deze methode kan worden uitgebreid voor studies van de gevolgen van vetzuur op andere cellen van zoogdieren.
Inleiding
Vetzuren spelen een cruciale rol in energiemetabolisme en de synthese van membraan fosfolipiden in verschillende soorten cellen. Vetzuren hebben een lage oplosbaarheid in water. Passende voorbereiding van vetzuur is van cruciaal belang voor het bestuderen van de biologische functies van vetzuren in zoogdiercellen. Wanneer vetzuren worden bereid met ethanol, kan veel vetzuren laten zien van hun giftige zeep (detergenten) effect op de celmembraan, zelfs op relatief lage concentraties1. Als een natuurlijke, grote vervoerder voor vrije vetzuren in het serum, serumalbumine wordt beschouwd als een goede drager voor vetzuur levering in vitro vetzuur functie testen2,3,4. De details van de voorbereiding van vetzuur en serumalbumine conjugaat zijn echter meestal niet beschikbaar alhoewel veel werkstukken met behulp van vetzuren zijn gepubliceerd.
Macrofagen express zeer epidermale vetzuur-bindend-proteïne en obesitas vetzuur-bindende eiwit5,6,7,8. Zij actief opname verzadigde en onverzadigde vetzuren die hun immuun functies kunnen reguleren. Om te bestuderen van de impact van vetzuren op de macrofagen en andere cellen, werden verschillende methoden van vetzuur voorbereiding toegepaste1,7,9. Het gebruik van op de juiste manier bereid vetzuur/serum albumine geconjugeerde te onderzoeken van het effect van vetzuren op macrophage functie is van cruciaal belang bij het verkrijgen van biologisch relevante gegevens. Studies over de invloed van vetzuren macrofaag-functie kunnen gebruikers basiskennis en potentiële therapeutische streefniveaus met betrekking tot de vetzuurstofwisseling in macrofaag-betrokken ziekten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
het protocol is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Louisville.
1. muis beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs)
- euthanaseren een 6 tot 8-weken oude, gezond wild type muis met behulp van CO 2. PIN het neer aan een Raad van schuim en spuiten met 70% ethanol totdat het is doorweekt. Verwijder de botten van de tibia/dijbeen met Tang en schaar. Leg ze in een petrischaal met 5 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Uitvoeren van alle procedures onder steriele omstandigheden.
- Opengesneden op beide uiteinden van het bot van het scheenbeen/dijbeen met een schaar in een steriele weefselkweek kap. Spoelen van het bot met een 25 G naald met PBS + 2% foetale runderserum (FBS) in een tube van 15 mL.
- Centrifugeer de beenmergcellen 4 ° C gedurende 5 min. 500 x g
- Resuspendeer de cel pellet in 1 mL rode bloedcellen lysis-buffermengsel lyse van rode bloedcellen (RBC) voor minder dan 1 min. Dilute onmiddellijk met 9 mL 1 x PBS. Centrifuge weer zoals in stap 1.3. Giet het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 10 mL 1 x PBS, filter de celsuspensie via een steriele 40 μm nylon gaas in een andere tube van 15 mL verwijderen cel puin/klontjes. Centrifuge weer zoals in 1.3. Giet het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 15 mL Roswell Park Memorial Instituut middellange (RPMI) 1640 met 5% FBS en 10 μg/mL gentamicine, plate die de cellen in een schaal van 100-mm weefselkweek op 37 o C incubator voor 60 min. zachtjes swirl de schotel, de drijvende nemen cellen, en ze tellen.
- 6 x 10 6 cellen in een schaal van 100-mm plaat met 12 mL macrofaag differentiëren media (RPMI 1640 met 5% FBS en 10 μg/mL gentamicine, vermengd met 30% L929 geconditioneerde media 10) met 10 ng/mL recombinante muis macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) voor 2 dagen.
- Na het kweken voor 2 dagen in een incubator 37 ° C met 5% CO 2, elk gerecht te voeden met 6 mL verse macrofaag differentiëren van media met 10 ng/mL M-CSF.
- Op dag 5, 8 mL van de oude media uit te nemen zonder verstoring van de cellen en toevoegen van 10 mL verse macrofaag differentiëren van media met 10 ng/mL M-CSF.
- Op dag 7, oogst het beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) met behulp van een cel lifter.
Opmerking: Bijgevoegde macrofagen kunnen ook los worden gezien met 5 mL 1 mM EDTA in 1 x PBS gedurende 5 tot 10 minuten na het verwijderen van de float cellen en uitwassen plaat tweemaal met 5 mL 1 x PBS. Centrifugeer de cellen zoals in stap 1.3. resuspendeer hen in verse macrofaag media te differentiëren en ze tellen met een hemocytometer.- Bevestigen de BMDMs ' fenotype door stroom cytometry als beschreven 5. Voorbereiden van de afgeleide muis macrofagen in een bepaalde concentratie voor de volgende studies.
2. BSA-fatty Acid conjugaat voorbereiding
- voorbereiden 2 mM BSA in steriele PBS. Bijvoorbeeld, weeg 6.65 g BSA, voeg toe 30 mL 1 x PBS te ontbinden, voegt u meer PBS tot 50 mL, schalen componenten zodat 2 mM BSA in 1 x PBS.
- Voorbereiden 5 mM individuele natriumzout van vetzuren in 2 mM BSA. Verhit tot 37 ° C of hoger, indien nodig, en bewerk ultrasone trillingen ten het mengsel van 2 mM BSA en natriumzout van vetzuren tot een duidelijke oplossing wordt verkregen.
Opmerking: Vergeleken met onverzadigde vetzuren, verzadigde vetzuren en nodig hebben een hogere temperatuur meer ultrasoonapparaat tijd voor ontbinding. - Filter de vetzuren-zuur-BSA oplossing door een 0,22 μm filter, aliquot in 1,5 mL steriele microcentrifuge buizen, en deze opslaan bij 4 ° C voor korte termijn gebruik of bij-20 ° C voor lange termijn opslag. Geen neerslag na opslag bij 4 ° C in de koelkast moet worden nageleefd.
3. Verzadigde vetzuren veroorzaken cel dood van muis beenmerg afgeleid macrofagen
- plaat van de BMDMs in een 24-well weefselkweek plaat met 0,4 x 10 6 /mL in macrofaag media differentiëren.
- De cellen met de 0,4 mM palmitinezuur en stearinezuur voor 16 tot 24 h bij een incubator 37 ° C met 5% CO 2 behandelen. BSA gebruiken als de negatieve controle.
- Oogsten van de cellen met een cel lifter na behandeling en spin down de cellen bij 4 ° C gedurende 5 min. 500 x g
- Vlek van de cellen met de Annexine V-Alexa 488 en 7-aminoactinomycin D (7-AAD) in 100 μl Annexine V bindende buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdunnen van het monster met 200 µL van Annexine-bindende buffer, meng voorzichtig, dan blijven de monsters op ijs na de incubatieperiode.
- Analyseren de gekleurde cellen zo spoedig mogelijk door stroom cytometry 5. Annexine V-Alexa 488 wordt gedetecteerd in de FITC-kanaal en 7-AAD in PerCP/PerCP-Cy5.5-kanaal is gedetecteerd.
4. Intracellulaire Ceramide kleuring
- na de behandeling van het vetzuur, oogst de cellen zoals in stap 3.3. Dan fix cellen in 4% paraformaldehyde voor 30 min.
- Wassen van het monster met 1 mL 1 x PBS, spin down als stap in 3.3 en giet het supernatant.
- De cellen met anti-ceramide primair antilichaam (1:200 verdunning) in 1 x 100 μl permeabilization een buffer voor 30 min. Stain
- Wassen en spin down de cellen opnieuw zoals in stap 4.2.
- De cellen met anti-muis IgM secundair antilichaam (1:500 verdunning) in 1 x 100 μl permeabilization een buffer voor 30 min. Stain
- Wassen en spin down de cellen opnieuw zoals in stap 4.2. Voeg 250 μL 1 x PBS en analyseren van de gekleurde cellen door stroom cytometry 5.
Opmerking: Zie de lijst van de gedetailleerde reagens in de tabel van apparatuur en reagentia.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Obesitas verhoogt vrije vetzuren concentraties in serum. Als professionele fagocyten duren macrofagen actief vetzuren host homeostase te handhaven. Tijdens deze processen veroorzaken overbelaste lipiden macrofaag celdood. Te dien einde gekweekte we BMDMs in vitro met obesitas niveaus van dieet vetzuren en gemeten macrofaag celdood met behulp van stroom cytometrische kleuring. In vergelijking met de controle van de BSA, verzadigde vetzuren, veroorzaakte in het bijzonder stearic zu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De juiste voorbereiding van vetzuur oplossing is van essentieel belang zijn voor het bestuderen van de biologische functie van vetzuren. De neutralisatie van vetzuur verhoogt de oplosbaarheid in waterige oplossing. Natrium zouten van vetzuren, vooral verzadigde vetzuren, zijn echter nog steeds van lage oplosbaarheid in water of PBS zoals we waargenomen. Een methode is het gebruik van 95-100% ethanol te ontbinden vetzuur1. Met behulp van deze methode, kan hogere toxiciteit voor cellen zelfs bij lag...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen financiële belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Louisville start-up fondsen en National Cancer Institute (Bethesda, MD) verleent R01CA177679, R01CA180986.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Opmerking: M.W. staat voor molecuulgewicht. |
Referenties
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
