Methodenartikel

Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose

8.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56537

⸱

19 februari 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

In dit artikel

Samenvatting

Osmotische stress beïnvloedt exocytose en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens dit proces. We laten zien hoe elektrochemische methoden samen met transmissie-elektronenmicroscopie combineren kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van extracellulaire osmotische druk op exocytose activiteit, blaasje quantal grootte en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven tijdens exocytose.

Samenvatting

Amperometry opname van cellen die zijn onderworpen aan osmotische schok Toon die secretoire cellen op deze fysieke stress reageren doordat de exocytose activiteit en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgelaten uit de blaasjes in één exocytose gebeurtenissen. Er is gesuggereerd dat de vermindering in neurotransmitters verdreven als gevolg van wijzigingen in de membraan biofysische eigenschappen is wanneer cellen in reactie op osmotische stress krimpen en met aannames gemaakt dat secretoire blaasjes in het cytoplasma van de cel ondervinden geen problemen door extracellulaire osmotische stress. Amperometry opname van exocytose controleert wat wordt vrijgelaten uit de cellen het moment een blaasje combineert met het plasma-membraan, maar levert geen informatie over de inhoud van het vesikel voordat de fusie blaasje wordt geactiveerd. Daarom biedt opname met andere aanvullende analytische methoden die kunnen karakteriseren de secretoire blaasjes voordat exocytose op cellen wordt geactiveerd door het combineren van amperometry een breder overzicht voor de behandeling van hoe secretoire blaasjes en de Exocytose proces worden beïnvloed door osmotische schok. We beschrijven hier hoe aanvulling amperometry opnemen met intracellulaire elektrochemische cytometry en Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beeldvorming kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de wijzigingen in de grootte en neurotransmitter inhoud secretoire blaasjes op chromaffin cellen ten opzichte van exocytose activiteit voor en na blootstelling aan osmotische stress. Door de koppeling van de kwantitatieve gegevens die experimenten met behulp van alle drie de analytische methoden, werden conclusies eerder gemaakt dat secretoire blaasjes op extracellulaire osmotische stress reageren door inkrimping in grootte en het blaasje quantal grootte te verminderen het handhaven van een constante vesikel neurotransmitter concentratie. Vandaar, dit geeft duidelijkheid over waarom blaasjes, in reactie op osmotische stress, vermindering van de hoeveelheid neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose release. De amperometrische opnames hier blijkt dit een omkeerbaar proces en dat blaasje nadat osmotische schok worden nagevuld met neurotransmitters wanneer geplaatste cellen zijn teruggekeerd in een isotone milieu.

Inleiding

Chromaffin cellen in de bijnieren zijn neuro-endocriene cellen die release neurotransmitter moleculen in de bloedstroom. Dit gebeurt door een cellulaire proces waarbij de docking en de fusie van de neurotransmitter gevulde blaasjes, resulterend in de release van de inhoud van blaasjes aan de extracellulaire ruimte in een proces genaamd exocytose. De neurotransmitters (adrenaline en noradrenaline) in chromaffin cellen worden actief getransporteerd door membraaneiwitten in grote dichte kern blaasjes (LDCVs) en opgeslagen bij hoge concentraties (~0.5-1 M)1,2. Accumulatie van neurotransmitters in de LDCVs wordt bereikt door de affiniteit van catecholamine moleculen naar de intravesicular dichte kern eiwit matrix bestaat uit chromogranin eiwitten (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, en een intravesicular cocktail oplossing met belangrijke onderdelen voor catecholamine laden en opslag in het vesikel zoals ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM in de oplossing en een ~ 40 mM gebonden aan de eiwit matrix)8Mg2 + (5 mM)9, ascorbaat (10-30 mM)10en een pH van ~5.511,12. De LDCVs handhaven een iso-osmotische voorwaarde met de cel cytoplasma (310 mOsm/kg)13, hoewel de theoretische opgeloste concentratie binnen de blaasjes optellen tot meer dan 750 mm bedraagt. De samenstelling van de intravesicular componenten is niet alleen essentieel voor het laden en opslaan van catecholamines, maar ook voor samenvoeging van opgeloste stoffen naar de dichte kern eiwit matrix. Dit vermindert het installatieprogramma de osmolariteit van de blaasjes aanzienlijk verminderd en kan invloed hebben op het bedrag catecholamine die is uitgebracht tijdens exocytose5,6.

Studies over het effect van extracellulaire osmotische druk op het proces van exocytose door amperometrische opname hebben gemeld dat hoge extracellulaire osmotische druk remt exocytose activiteit en vermindert het aantal neurotransmitters uitgescheiden door één vesikel compartimenten4,14,15,16,17,18,19. De uitleg van deze opmerkingen hebben gespeculeerd over de mogelijke verbetering van macromoleculaire verdringing in de cel cytoplasma remmende vesikel fusion gebeurtenissen, en een wijziging in de membraan biofysische eigenschappen waardoor het aantal neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose. Deze gedachten verondersteld dat hoge extracellulaire osmotische stress niet afdoet aan het blaasje quantal formaat, waarin het aantal moleculen van de neurotransmitter opgeslagen in een blaasje compartiment voorafgaande stadium van geactiveerde exocytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. in amperometrische metingen van exocytose release in afzonderlijke cellen, een koolstofvezel schijf micro-elektrode in nauw contact met het celoppervlak, maken een experimentele opgericht nabootsen van de configuratie van de synaps wordt geplaatst waar de amperometrische elektrode fungeert als een postsynaptisch detector (Figuur 1)22,23. Door het stimuleren van een cel exocytose, kan een neurotransmitter gevulde blaasjes te smelten met de celmembraan van plasma en vrijgeven van de volledige vesikel inhoud geheel of gedeeltelijk in de extracellulaire ruimte veroorzaken. Deze neurotransmitter moleculen vrijgegeven aan het oppervlak van de elektrode kunnen elektrochemisch worden gedetecteerd als de neurotransmitters electroactive (bijvoorbeeld, catecholamines zijn) door toepassing van een redoxpotentiaal meet van +700 mV vs een Ag/AgCl-elektrode . Daarom een aantal huidige spikes markeren de detectie van individuele exocytose gebeurtenissen. Van de huidige versus tijd traceren in een amperometrische-opname, het gebied onder elke één amperometrische spike vertegenwoordigt de lading per exocytose evenement gedetecteerd en kan worden geconverteerd naar het molletje van neurotransmitters uitgebracht, met behulp van de vergelijking van Faraday. Vandaar, de opnames amperometrische kwantitatieve informatie verschaffen over de hoeveelheid neurotransmitters verdreven uit één exocytose gebeurtenissen en verslag over de frequentie van exocytose gebeurtenissen, maar vertonen geen kwantitatieve informatie over de secretoire blaasjes inhoud voordat vesikel fusion en neurotransmitter release is ingeleid.

Dus, om een beter begrip van hoe secretoire blaasjes in de cel cytoplasma reageren op extracellulaire osmotische stress voordat de cel wordt geactiveerd om te ondergaan exocytose, andere aanvullende analytische methoden kunnen worden gebruikt om deze informatie te verrijken. Bijvoorbeeld, om te onderzoeken als osmotische stress vesikel volume verandert, kan transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) imaging analyse worden gebruikt voor het meten van het vesikel grootte van cellen na chemische fixatie. Om te onderzoeken of osmotische stress beïnvloedt vesikel quantal grootte, een techniek van de onlangs ontwikkelde amperometrische genaamd intracellulaire elektrochemische cytometry, kan worden toegepast voor de kwantificering van vesikel neurotransmitter inhoud op secretoire blaasjes in hun geboortestaat toen nog woonachtig in het cytoplasma van levende cellen26. In de intracellulaire elektrochemische cytometry techniek, een nanotip cilindrische koolstofvezel elektrode zachtjes wordt ingevoegd in het cytoplasma van levende cellen en door het toepassen van een potentieel +700 mV op deze elektrode (versus een Ag/AgCl referentie elektrode), de Catecholamine inhoud in blaasjes kan worden gekwantificeerd door de detectie van een redox huidige piek van enkele blaasjes botsen, adsorberend, en vervolgens stochastically te bezwijken aan de elektrode oppervlakte en daardoor het vrijgeven van hun inhoud tegen de elektrode oppervlakte26. Vandaar, in de huidige versus tijd trace amperometrische, elk één vesikel rupturing evenement kan resulteren in een huidige voorbijgaande aard en door de integratie van het gebied van elke huidige spike, de vesikel quantal grootte kan worden berekend met behulp van Faraday´s-wet.

Dus door het koppelen van de kwantitatieve informatie opgedaan vesikel grootte metingen met behulp van TEM imaging samen met blaasje quantal grootte analyse, zoals geregistreerd door intracellulaire elektrochemische cytometry, kan blaasje neurotransmitter concentratie ook worden bepaald. Dit maakt de karakterisering van het vesikel wanneer cellen worden blootgesteld aan verschillende osmotische omstandigheden en biedt een betere blik op hoe de blaasjes op extracellulaire osmotische stress in het stadium vóór de exocytose reageert. De resultaten van combinatie van deze methoden hebben aangetoond dat in aanwezigheid van extracellulaire hoge osmotische druk, blaasjes krimpen en hun quantal grootte aanpassen en vergelijken van de kwantitatieve informatie over de relatieve veranderingen van deze metingen dat blijkt tijdens het krimpen wijzigen blaasjes hun inhoud en het formaat te handhaven van een constante neurotransmitter concentratie24. Dus, dit inzicht is waardevol bij het aansluiten van de opmerkingen over neurotransmitter vrijlating in cellen die zijn blootgesteld aan osmotische stress. In deze protocollen beschrijven we het gebruik van deze drie complementaire methoden waarmee de karakterisatie van hoe secretoire blaasjes in hun oorspronkelijke omgeving reageren op extracellulaire osmolaliteit en de gevolgen van deze reactie op de exocytose proces. Naast onze eerdere opmerkingen over het effect van hoge osmotische druk op exocytose24presenteren we extra experimenten die cel herstel na osmotische schok en het effect van meerdere barium stimulaties in chromaffin beschrijven cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. de celcultuur van boviene Chromaffin cellen geïsoleerd door enzymatische spijsvertering van de bijnieren

  1. Isoleren chromaffin cellen verkregen boviene bijnieren, steriliseren cellen met 70% ethanol oplossing. Trim weg vet en bindweefsel met behulp van een scalpel. Om het bloed te verwijderen, spoel de bijnier aderen met behulp van Locke's oplossing (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) 5,6 mM met een pH van 7,4) die al waterbaden tot 37 ° C.
  2. Te verteren van het weefsel, opblazen van elke klier door het injecteren van ongeveer 2,5 mL warme steriele gefiltreerd 0,2% collagenase P oplossing door de bijnier ader met een injectiespuit en Incubeer het weefsel gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Onderzoeken van de klieren om ervoor te zorgen dat de spijsvertering van de medulla is voltooid. Het weefsel moet zacht en niet gespannen aanvoelen.
  3. Verzamelen de medulla verteerd door het knipprogramma uit de klieren in de lengterichting. Mince de medulla weefsel met behulp van een scalpel. Filteren van de weefsel-schorsing over een stalen zeef en Verdun met Locke's oplossing voor ongeveer een 50 mL volume om de activiteit van collagenase P.
  4. Pellet de cellen bij 300 x g in een centrifuge gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en in 50 mL steriele reageerbuisjes verzamelen. Resuspendeer de pellet verkregen in 20 mL Locke de oplossing en filtreer de oplossing over een steriele 100-µm nylon gaas in buizen.
  5. Meng de chromaffin celsuspensie met steriele Percoll (1:1) en centrifugeer de cell oplossing bij 18,600 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verzamelen van de bovenste laag van het verloop van de dichtheid en filtreer de oplossing over een 100-µm nylon gaas in buizen.
  6. Als u wilt uitsluiten van Percoll, Verdun de celsuspensie met Locke's oplossing en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voordat opnieuw de pellet in Locke's oplossing wordt verbroken. De geschatte celdichtheid van de geïsoleerde celsuspensie is ongeveer 4 miljoen cellen/mL.
  7. Voor amperometrische opname van exocytose en intracellulaire cytometry metingen, plaat chromaffin cellen in collageen IV gecoat 60 mm kunststof gerechten bij een dichtheid van ongeveer 17,5 × 10-3 -cellen/cm2 en Incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 milieu. De elektrochemische experimenten uitvoeren binnen 1-3 dagen van celkweek.
  8. Voor de TEM imaging experimenten, plaat chromaffin cellen in 75 cm2 cel cultuur kolven bij een dichtheid van 7-8 miljoen cellen per kolf en Incubeer bij 37 ° C in een omgeving met 5% CO2 voor 1 dag.

2. eencellige exocytose Amperometry experimenten24

  1. Om koolstofvezel microelectrodes voor deze experimenten, nemen een glazen capillair met een buitendiameter geschikt voor de elektrode-houder het hoofd stadium die zal worden gebruikt in deze experimenten. Gebruik een borosilicaatglas capillair met een buitendiameter van 1.2 mm en een inwendige diameter van 0,69 mm.
    1. Een van de capillaire uiteinden verbinden met een buis water aspiratie. Plaats 5 µm diameter carbon vezels op iets, zoals een stuk wit papier, ter verbetering van visualisatie.
    2. Identificeren van een enkele koolstofvezel en de vezel onderdruk aan de ene kant met een vinger de koolstofvezel in plaats te houden terwijl de positionering van het open uiteinde van het capillair in nabijheid van het vrije uiteinde van de koolstofvezel. Zachtjes de koolstofvezel in de glazen capillaire gecombineerd, zodat de koolstofvezel door beide uiteinden van het capillair steekt. Opzijschuiven de aspiratie-kracht.
  2. Plaats het capillair met de koolstofvezel in een micropipet trekker en trek de glazen capillaire in twee aparte glazen pipet tips. Gebruiken als u wilt verbreken van de koolstof-vezel dat is aangesloten tussen de twee glazen tips, een paar van schaar te snijden de koolstofvezel en twee koolstofvezel microelectrodes krijgen.
  3. Onder een Microscoop, plaats de koolstofvezel bovenop een dikkere microscoopglaasje waarmee handmatig snijden van de koolstofvezel aan de rand van waar de vezel breidt uit de glazen capillaire coating met behulp van een scalpel.
  4. Na het snijden van de koolstof-vezel, verlaten van een glas gecoate koolstofvezel tip, kunt u het een paar mm van de elektrode tip invoegen door een Epoxy-oplossing voor 10 min te trekken van epoxy en verzegelen alle mogelijke open ruimte tussen de koolstofvezel en het omliggende glas. Til de elektroden langzaam uit de epoxy-oplossing om te voorkomen dat omvangrijk lijm druppels vormen aan het uiteinde van de elektrode.
  5. Plaats de elektroden op een houder (bijvoorbeeld, een houten platte stok) met twee-kant hittebestendig plakband waarop elektroden aangesloten kunnen worden. Bak de epoxy behandeld elektroden 's nachts in een oven bij 100 ° C. De elektrode tips gemakkelijk breken als ze in contact met een oppervlak komen, dus zorg ervoor de elektroden altijd veilig worden opgeslagen met behulp van een houder waar de elektroden worden opgelost in plaats en tips doen niet het risico lopen geraakt.
  6. Voor het verkrijgen van een platte schijf elektrode oppervlakte, plaats van de elektrode in de houder van een microgrinder en schuine elke koolstofvezel elektrode op een engel van 45°. Na afschuining, markeren het capillair aan de bovenzijde met behulp van een permanent marker later weten hoe om te zoeken van de schijf elektrode oppervlakte onder een hoek van 45°, bij het plaatsen van de elektrode in de buurt van cellen voor de meting van exocytose.
    Opmerking: Deze stap is belangrijk in deze experimenten, de ovale schijf elektrode moet plat op cellen met haar oppervlakte parallel aan het oppervlak van de petrischaal worden geplaatst. Afschuining elektroden zijn ook dezelfde dag als experimenten om een frisse en schone elektrode oppervlakte gedaan.
  7. Vóór gebruik, door elke koolstofvezel micro-elektrode in een blanco-oplossing (bijvoorbeeld, 0,1 mM dopamine in PBS buffer (pH 7.4)) als u wilt controleren van de huidige cyclische voltammetrie met steady-state te plaatsen. Voor een cyclische voltammetrie scan, gelden de potentiële golfvorm van een driehoek -0,2 V tot 0,8 V vs een Ag/AgCl-elektrode op 100 mV/s om goede reactie kinetica gegevens worden verkregen die zijn in overleg met de theoretisch berekende waarden voor een schijf van 5 µm diameter koolstofvezel micro-elektrode25.
  8. Voor de opname van de amperometry van exocytose, plaats de petrischaal met gekweekte chromaffin cellen op een omgekeerde Microscoop. Het is belangrijk om te beschermen de Microscoop opgericht met een kooi van Faraday om elektronische storingen tijdens de opname, als gevolg van de zeer kleine stromen wordt gemeten amperometry te elimineren. Een Microscoop verwarming fase gebruiken om een temperatuur van 37 ° C tijdens de experimenten van de cel.
  9. Gebruik een geluidsarme patch klem instrument toe te passen van een constante potentieel van +700 mV op de elektrode werken ten opzichte van een referentie-elektrode Ag/AgCl die ook in de petrischaal uit de buurt van de werken-elektrode is geplaatst. Voor opname exocytose van chromaffin cellen, digitaliseren van het signaal op 10 kHz en toepassing van een interne low-pass Bessel-filter op 2 kHz voor het filteren van het opgenomen signaal.
  10. Mount standaardinteracties amperometrische opname op afzonderlijke cellen, de schijf vers schuine en geteste koolstofvezel micro-elektrode in de elektrode-houder van de hoofd etappe die wordt gebruikt met de potentiostaat.
    1. Voorzichtig plaats van de elektrode met de vlakke ovale schijf vorm elektrode oppervlakte naar beneden richting het apicale oppervlak van de cel en plaats van de elektrode in contact met de celmembraan met behulp van een micromanipulator.
    2. Aanpassen van de afstand van de elektrode naar de cel door controle van de vervorming van de cel veroorzaakt door de elektrode na plaatsing op de top van de celmembraan en vervolgens zorgvuldig het intrekken van de elektrode tot op een afstand waar de cel een shape dicht bij de oorspronkelijke vorm van de cel herwint . Het ideaal voor kinetische en kwantitatieve opnemen is het creëren van een dunne vloeistof film van honderd nanometer te scheiden van de elektrode en de cel-oppervlakte, die soortgelijke voorwaarden postsynaptisch detectie voor chemische release in een synaps.
  11. Om te stimuleren van de cellen die moeten exocytose, plaatst u een glas micropipet met een grootte van de tip van 2-3 µm diameter, gevuld met 5 mM BaCl2 oplossing op een afstand van ten minste 20 µm ergens buiten de cel, om te voorkomen dat elke oplossing uit het uiteinde van de pipet om invloed uit te lekken de experimenteren en een 5 s injectie puls van 5 mM BaCl2 oplossing bij het celoppervlak ter stimulering van de cel exocytose van toepassing.
  12. De omkeerbare effecten van osmotische druk op het proces van exocytose studeren, bereiden een isotone bufferoplossing (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, glucose 5 mM, 10 mM HEPES, pH 7.4) met 310 mOsm/kg iso-osmotische druk en een hypertonic buffer gemaakt door aanpassing van de De concentratie van de NaCl isotone Bufferoplossing met een osmolaliteit overeenkomt met 730 mOsm/kg.
  13. Plaats van de cellen in de isotone buffer en de cel exocytose stimuleren door een puls van barium injectie toe te passen tijdens het opnemen van de huidige transiënten van amperometrische tijdens de ingewijden exocytose activiteit voor ongeveer 3 min.
    1. Om te vergelijken de exocytose reacties in isotone voorwaarden op hypertonic voorwaarden, Incubeer de cellen gedurende 10 minuten in hypertonic bufferoplossing en daarna een barium injectie puls stimuleren van exocytose en uitvoeren van 3 min van amperometrische opname toe te passen.
    2. Voor de omkeerbare reactie van cellen, cellen opnieuw gedurende 10 minuten in isotone bufferoplossing uit te broeden en cellen stimuleren door toepassing van een 5s barium injectie pulse en het uitvoeren van 3 min van de opname van de reactie van de exocytose van de cel.
  14. Als controle experimenten bij het vaststellen van het effect op exocytose activiteit door meerdere barium stimulaties, uit te voeren een amperometrische opname van exocytose release van drie opeenvolgende BaCl2 stimulaties op dezelfde cel geplaatst in isotone buffer en met behulp van de dezelfde tijd-protocol voor de opeenvolgende cel incubatie experimenten met verschillende osmolariteit.

3. de intracellulaire elektrochemische Cytometry24,26

  1. Om vesikel quantal grootte metingen-meet-elektroden, gebruiken de zelfde materialen en beginnen met de voorbereiding van een 5 µm in diameter koolstofvezel elektrode volgens de beschrijvingen in de punten 2.1 en 2.2 van de fabricage van de micro-elektrode voor amperometrische exocytose metingen.
  2. Onder een Microscoop, gebruik u een scalpel te snijden de koolstofvezel uitbreiden uit het puntje van het glas zodat er een koolstofvezel met een lengte variërend van 30 tot 100 µm overblijft van het glas puntje uitsteekt.
  3. Ter voorbereiding van een vlam geëtste tip van de elektrode koolstofvezel, gebruik een butaan vlam. Om te bereiken een gelijkmatig geëtst, cilindrische gevormde elektrode tip, houdt de cilindrische gevormde koolstofvezel elektrode terwijl draaien en plaats de koolstofvezel zich uitstrekt van het glas in de blauwe rand van de butaan vlam totdat het uiteinde van de koolstof een rode ontwikkelt Kleur. Dit duurt vaak minder dan 2 s. Als dat lukt, resulteert dit in een geëtste elektrode tip grootte van 50-100 nm in diameter (een SEM-beeld van zo'n tip is afgebeeld in Figuur 5B). Na vlam etsen, plaats de elektrode onder een microscoop te evalueren van de elektrode-tip.
  4. Plaats de cilindrische nanotip micro-elektrode in epoxy oplossing voor 3 min, gevolgd door een 15 s dompelen van de elektrode-tip in een oplossing van aceton. Hierdoor kan de epoxy te verzegelen van de potentiële ruimte van de kloof tussen de koolstofvezel en de isolerende glazen capillaire wand, terwijl de aceton de epoxy vandoor naar de geëtste koolstofvezel elektrode oppervlakte wist. Om te genezen van de epoxy, bak de elektroden in een oven's nachts bij 100 ° C.
  5. Vóór gebruik, testen de steady-state-stroom van elke koolstofvezel micro-elektrode, zoals uiteengezet in punt 2.7 met behulp van cyclische voltammetrie. Alleen gebruiken voor experimenten, elektroden die weer een plateau huidige rond 1,5 tot 2,5 NB27.
  6. Bij metingen van de intercellulaire amperometry, plaats van de cellen op de Microscoop als beschreven in 2.8 en gebruiken dezelfde experimentele instellingen van de potentiostaat zoals beschreven in 2.9.
  7. Intracellulaire amperometrische meting uitvoeren, en om te voorkomen dat aanzienlijke fysieke schade op de cel, de nanotip cilindrische micro-elektrode in de cel invoegen door het toevoegen van een zachte mechanische kracht, net genoeg om het duwen van de elektrode door middel van het plasma cel membraan en in het cytoplasma van de cel met behulp van een micromanipulator.
  8. Na inbrengen, en met de celmembraan rond de cilindrische elektrode verzegeld, de amperometrische opname ter plaatse bij de levende cel te starten. Op de oxidatie potentiële die is toegepast op de elektrode, blaasjes zal adsorberen aan de elektrode oppervlakte en stochastically scheuren.  Vandaar, is er geen behoefte aan enige vorm van stimulans om met dit proces begint.
  9. Om te bepalen van de osmotische effect op vesikel quantal grootte, de intracellulaire cytometry metingen van een groep cellen die hebben zijn geïncubeerd in isotone en hypertonic buffer met de experimentele conditie zoals beschreven in sectie 2.13 te verzamelen.

4. data-analyse van Amperometry opnames

  1. De opgenomen amperometry om gegevens te analyseren van exocytose en intracellulaire vesikel quantal grootte analyse, het gebruik van een softwareprogramma waarmee analyse van huidige transiënten in de opgenomen stroom versus tijd trace dus dat kinetische parameters van de piek en de geïntegreerde totale kosten voor individuele huidige pieken kan worden bepaald. Voor data-analyse, hebben we software die is ontwikkeld in het lab Sulzer die werd geschreven voor de data analyseprogramma Igor28gebruikt.
  2. Wanneer het analyseren van de amperometrische pieken, selecteert u een drempel voor pieken van drie maal de wortel-gemiddelde vierkante (RMS) standaardafwijking van het geluid voor elke opname.
  3. De spikes amperometrische verzamelen van elke cel opname handmatig om te voorkomen dat valse pieken die niet de Gaussiaanse vorm volgt, dubbele pieken die kunnen worden van het resultaat van samengevoegde exocytose gebeurtenissen, en accepteren alleen Gaussian gevormde aren met een drempel van driemaal hoger dan de RMS-geluid.
  4. Verzamel de gegevens voor de totale kosten per één amperometrische piek en Faradays wet gebruiken (N = QnF) om de molaire hoeveelheid catecholamine neurotransmitter gedetecteerd per exocytose of intracellulaire één vesikel breuk evenement, waarbij N staat voor de mol te berekenen neurotransmitters gaan door een redoxreactie op de elektrode oppervlakte, Q = de totale kosten gedetecteerd onder elke piek, n = aantal elektronen overgebracht in de redoxreactie (n = 2 voor catecholamines), en de Faraday´s constante F = 96485 C/mol.
  5. Het uitvoeren van statistische analyse van de gegevens verzameld door de eerste berekening van de gemiddelde kosten per gebeurtenis voor elke cel gedetecteerd. Vervolgens voor variantie tussen cellen, berekenen van de gemiddelde kosten tussen de cellen en een student t-test gebruikt tussen cellen uitgaande van ongelijke variantie. Deze studie gebruikt de MATLAB-programma voor statistische analyse.

5. TEM Imaging vesikel grootte p.a.

  1. Voor het uitvoeren van TEM beeldvorming van cellen op de verschillende osmotische voorwaarden, incubeer eerst de cellen in een isotone of hypertonic buffer gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 omgeving voordat chemische fixatie van de cellen.
  2. Fixatie van de cel met behulp van de Karnovsky kleefpoeders methode29uitvoeren Met behulp van deze methode, Incubeer de cellen met een oplossing die natriumazide 0,01%, 1% formaldehyde en 1,25% Glutaaraldehyde waarin het monster kan worden achtergelaten bij 4 ° C.
  3. Wassen na fixatie, de cellen met 0,15 M natrium cacodylate buffer.
  4. Om de cel vlek monsters post fixatie, en ter voorbereiding van TEM imaging, Incubeer de cellen met een oplossing van 1% osmium tetroxide gedurende 2 uur bij 4 ° C, gevolgd door 1 uur incubatie in 0,5% uranyl acetaat oplossing bij kamertemperatuur in het donker.
  5. In een laatste fixatie stap, de cellen eerst uitdrogen door het spoelen van de cellen in 100% ethanol en spoel cellen met aceton.
  6. De celsteekproeven insluiten in epoxyresin en daarna centrifugeren bij 4000 x g voor 30-40 min uitvoeren en het monster van de cel aan het polymeriseren bij 40 ° C gedurende 15 h gevolgd door 48 uur broedtijd bij 60 ° C.
  7. Voorbereiding voor imaging, sectie het monster cel ingesloten in Agar 100 hars in plakjes met dikte van 60 nm met behulp van een ultramicrotome.
  8. Onderwerp van de cellen tot een oplossing van 4% uranyl acetate/25% ethanol voor 4 min, gevolgd door 20 s van spoelen met water. Wassen van de cellen met Reynolds lood citraat gedurende 3 minuten, gevolgd door 20 s van spoelen met water.
  9. Transmissie Electronenmicroscopie beeldvorming van celsteekproeven uitvoeren In onze experimenten, hebben we gebruik gemaakt van een transmissie-elektronenmicroscoop die heeft geopereerd op 120 kV.
  10. Van elke geregistreerde afbeelding van een cel sectie illustreren de cel ultrastructuur waarin een bevolking van de blaasjes in het cytoplasma van de cel, eerst kalibreren de grootte van de pixel van de afbeelding door pixels die betrekking hebben op de bar van de opgenomen schaal in elke afbeelding TEM. Imaging software gebruiken voor het bepalen van de grootte van het vesikel op elk beeld van cellen die zijn blootgesteld aan isotone of hypertonic voorwaarden. In onze experimenten gebruikten we de software ImageJ voor beeldanalyse. Het is vermeldenswaard dat voor beeldanalyse van cellulaire ultrastructuur van TEM beelden van cellen, grootte aanpassing van deze metingen op basis van de dikte van de cel secties moet worden beschouwd en zijn eerder beschreven door Almers´s lab30.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We beschrijven hier het protocol voor hoe TEM imaging samen met twee elektrochemische methodologieën, koolstofvezel amperometry en intracellulaire elektrochemische cytometry, combineren kunt informeren die krijgt een bredere visie zinspeelt op het effect van extracellulaire osmotische druk op secretoire blaasjes en het proces van exocytose. Door het vergelijken van representatieve amperometrische opnames van exocytose release op één chromaffin cellen met behulp van de experimentele instellen (afgebeeld in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wij presenteren hier een protocol en de voordelen van de combinatie van drie elkaar aanvullende analytische methoden om secretoire blaasjes en het proces van exocytose te krijgen een beter begrip van hoe een fysieke kracht zoals osmotische druk secretoire blaasjes beïnvloeden kan te analyseren en het proces van exocytose in secretoire cellen. Deze methoden omvatten koolstofvezel micro-elektrode amperometry, die een gevestigde methode is voor het opnemen van exocytose activiteit, intracellulaire elektrochemische cytometry...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedank de Zweedse Onderzoeksraad (349-2007-8680) voor financiering en Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Zweden) voor donatie van boviene bijnieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NaClSigma AldrichS7653
KClSigma AldrichP9333
NaHCO3Sigma AldrichS5761
HEPESSigma AldrichH3375
MgCl2Sigma AldrichM-2670
GlucoseSigma AldrichG8270
Collagenase PRoche, Sweden11 213 857 001
100-µM Nylon meshFisher Sientific08-771-19
PercollSigma AldrichP1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dishVWR354416
CentrifugeAvanti J-20XP
Borosilicate glass capillarySutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette pullerNarishing Inc., JapanPE-21
Epoxy solutions (A and B)Epoxy technology, Billerica, MA
BevellerNarishing Inc.EG-400
Inverted MicroscopeOlympusIX81
Patch clamp InstrumentMolecular Devices, Sunnyvale, CAAxopatch 200B
MicromanipulatorBurleigh Instrument Inc., USAPCS-5000
Butane FlameMultiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopyOmegaLeo 912 AB

Referenties

  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33(1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633(1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Amperometrische registratieintracellulaire elektrochemische cytometrietransmissie elektronenmicroscopiechromaffiene cellenvesiculaire quantalgroottebariumchloride stimulatieisotone buffer

Gerelateerde artikelen