Methodenartikel

Analyse van immuuncellen in één ischiadicus zenuwen en achterwortelganglia Ganglion uit een enkele muis met behulp van Stroom Cytometry

11.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56538

⸱

6 december 2017

 ,  , 
1Department of Medicine I and Clinical Chemistry, University Hospital of Heidelberg, 2Institute for Diabetes and Cancer IDC Helmholtz Center Munich, Germany & Joint Heidelberg-IDC Translational Diabetes Program, 3German Center for Diabetes Research (DZD)

In dit artikel

Samenvatting

Kwantitatieve analyse van de inhoud van de cel binnen de nervus ischiadicus lymfkliertest is moeilijk te wijten aan de schaarste van het weefsel. Dit protocol beschrijft een methode voor de vertering van het weefsel en voorbereiding waarmee voldoende cellen voor stroom cytometry analyse van individuele muizen immuun cel populaties van zenuwen.

Samenvatting

Zenuw-ingezeten immune cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS) zijn essentieel voor het behoud van de integriteit van de neuronale in een gezonde zenuw. De immuun cellen van de PNS worden beïnvloed door letsel of ziekte, die de functie van de zenuw en de capaciteit voor regeneratie. Neuronale immuuncellen worden vaak geanalyseerd door immunofluorescentie (IF). Terwijl als is essentieel voor het bepalen van de locatie van de immuuncellen in de zenuw, of ligt op semi-kwantitatieve en de methode is beperkt tot het aantal markeringen die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd en de mate van expressie van de oppervlakte. In deze studie, werd stroom cytometry gebruikt voor de kwantitatieve analyse van infiltratie van de leukocyten in de ischiadicus zenuwen of achterwortelganglia ganglion (DRG) van individuele muizen. Eencellige analyse werd uitgevoerd met behulp van de DAPI en verschillende eiwitten gelijktijdig werden geanalyseerd voor oppervlakte of intracellulaire expressie. Beide ischiadicus zenuwen van een muis die werden behandeld volgens dit protocol gegenereerd ≥ 30.000 één genucleëerde gebeurtenissen. Het aantal leukocyten in de ischiadicus zenuwen, bepaald door de uitdrukking van CD45, was ongeveer 5% van de inhoud van de cel Totaal in de nervus ischiadicus en ongeveer 5-10% in de Deutsche Reichsbahn. Hoewel dit protocol richt zich vooral op het immuunsysteem celpopulatie binnen de PNS, betekent de flexibiliteit van cytometry van de stroom te meten een aantal markeringen gelijktijdig dat de andere cellen populaties aanwezig zijn binnen de zenuw, zoals de cellen van Schwann, pericytes , fibroblasten, endotheliale cellen, en kunnen ook worden geanalyseerd met behulp van deze methode. Deze methode biedt daarom een nieuw middel voor de studie van systemische effecten op de PNS, zoals neurotoxicology en genetische modellen van neuropathie of in chronische ziekten, zoals diabetes.

Inleiding

Immune cellen die de PNS uit de omloop genomen invoeren, bijdragen zoals gedefinieerd door de uitdrukking van CD45 en CD11b, tot de integriteit van de zenuw te behouden en spelen een rol, zowel in regeneratie en degeneratie1. Macrofagen (gedefinieerd door hun uitdrukking van CD68 in muis) kunnen worden scheefgetrokken naar een inflammatoire fenotype, uiten meer MHC klasse II en CD86 op hun oppervlakte (M1), of naar een anti-inflammatoire fenotype, uiting geven aan meer intracellulaire CD206 (M2)2 . Scheeftrekken van de macrofaag fenotype is een dynamisch proces geregeld via Akt3signalering, als gevolg van de verschillende taken van macrofagen in de verdediging tegen ziekteverwekkers (M1) en de rol in weefselregeneratie (M2). Regeneratie van een gewonde zenuw vereist eerst fagocytose van myeline puin door macrofagen in de zenuw4,5, en anti-inflammatoire (CD68+CD206+) macrofagen M2 is aangetoond dat het bevorderen van axon uitgroei in de PNS6. Aanwerving of macrofagen teruggebracht tot de PNS, of verminderde capaciteit voor fagocytose kan leiden tot verminderde regeneratie en handhaving van de integriteit van de zenuw. Inflammatoire M1 macrofagen, uitdrukken van de MHC klasse II, zijn minder geschikt voor fagocytose dan M2 macrofagen en neuronale ontsteking is betrokken bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten7.

De veranderingen die aan de resident zenuw-immuunsysteem als gevolg van schade optreden kunnen worden kwantitatieve, manifesteren in verlies van CD45+ leukocyten (of verhoogd infiltratie van CD45+ leukocyten in de zaak ontsteking), of kwalitatieve, zoals wijzigen van macrofaag fenotype van M2 in M1 fenotype. De immuun cellen van de PNS hebben traditioneel zijn geanalyseerd door middel van IF, met behulp van bevroren secties of paraffine-ingebedde materiële8. Indien nodig voor de bepaling van de lokalisatie van de cellen van belang is. Echter kwantificering met behulp van als vaak is gebaseerd op het tellen van een relatief klein aantal cellen in een smalle gedeelte van het weefsel, waardoor kwantificering onbetrouwbaar en kwetsbaar voor selectie bias. Voor de identificatie van specifieke deelverzamelingen van immune cellen is het gelijktijdige detecteren van merkers van extracellulaire en/of intracellulaire vereist, terwijl de vaststelling van het fenotype van de macrofaag vereist ten minste ten minste twee markers, specifiek CD206 en MHC klasse II. Zoals meestal beschikbaar microscopen zijn beperkt tot ten minste twee-kleurkanalen, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en phycoerythrin (PE), kunnen omvat de karakterisering van de specifieke subsets van immune cellen door als beperkend en onvolledig, waarvoor de noodzaak om meerdere dia's, afgeleid van het zelfde gebied van belang, die zijn gekleurd en geanalyseerd in parallel. Dit tijdrovende aspect daarom niet nodig zich leent voor de analyse van grote steekproef sets. Bovendien, zoals de meeste van de markers van belang zijn extracellulaire, de detectie in weefsel, dat is ofwel ingebed in paraffine of cryoconserved, kunnen problematisch vanwege de verstoring van de membraan integriteit en het maskeren van epitopes, alsmede het verlies van de antigenen van belang van het gebruik van oplosmiddelen, zoals aceton en methanol9.

Daarentegen stroom cytometry, die optische meet en fluorescentie kenmerken van afzonderlijke cellen in suspensie als ze passeren een lichtstraal, biedt een meer praktische en uitgebreide middelen voor analyse van de populaties van de cel. Stroom cytometry, in plaats van het produceren van een digitaal beeld van het weefsel, biedt een geautomatiseerde kwantificering van instellen van parameters, waaronder de relatieve omvang en reflecterende index, hierna aangeduid als de voorwaartse scatter (FSC), granulariteit/interne complexiteit van een cel of zijde-scatter (SSC), en de intensiteit van de relatieve fluorescentie, verstrekken dat de cel heeft het label met een geschikte fluorophore, zoals een geconjugeerd antilichaam. Een typisch stroom-cytometer bestaat uit twee, luchtgekoelde lasers; een laser argon produceert blauw licht op 488 nm en een helium neon laser produceert licht aan 633 nm. Deze combinatie kan voor de detectie en meting, gelijktijdig, van ten minste vijf doelstellingen op het oppervlak of binnen het intracellulaire compartiment. Meer geavanceerde flow cytometers kan bestaan uit meerdere lasers, die voorzien in de opsporing van maximaal acht verschillende fluorochromes tegelijk, bieden dat de piek emissie golflengten van de geselecteerde fluorochromes niet aanzienlijk overlappen.

Voor het analyseren van stroom cytometry, moet het weefsel van belang eerst worden enzymatisch verteerd, meestal met collagenase, voor het genereren van een eencellige schorsing. De analyse van lymfkliertest ischiadicus zenuwen eerder moeilijk geweest als gevolg van de kleine hoeveelheid weefsel verkregen elke muis. Bovendien, het hoge vetgehalte van de myeline rond de axonen cel herstel belemmert en produceert grote hoeveelheden puin. De methode voor de voorbereiding van de nervus ischiadicus en spijsvertering hierin beschreven werd aangepast van het protocol van de isolatie van Schwann cel van Barrette et al. 7en wil isoleren genoeg cellen uit zenuwen van individuele muizen voor stroom cytometry analyse, teneinde de variatie tussen muizen. Met behulp van de DAPI voor de identificatie van afzonderlijke cellen in de ruwe weefsel digest omzeilt de noodzaak om te verwijderen van axon puin, die vaak tot verlies van de cel leidt. Wassen meerdere malen met een wasmiddel-rijke buffer aids in de release van cellen gevangen binnen het vette puin, waardoor het rendement. Vertering van beide full-length ischiadicus zenuwen van een enkele muis volgens dit protocol genereert ≥30, 000 één genucleëerde evenementen en ten minste 3 keer dat nummer was ontvangen van de Deutsche Reichsbahn. Het aandeel van de CD45+ leukocyten was ongeveer 5% van de inhoud van de cel Totaal in de nervus ischiadicus digest en ongeveer 5-10% in de DRG-digest. De meerderheid van de CD45+ cellen in de nervus ischiadicus uitgedrukt de macrofaag markers, CD68 en CD206.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Wild-type C57BL/6 muizen (mannetjes; 10-12 weken) hielden in standaard 12 h licht/donker cyclus en vrije toegang tot de standaard chow voeding en water werden verstrekt. Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtsnoeren door het lokale Animal Care en gebruik Comité en goedgekeurd door het lokale Animal Care en gebruik Comité bij de regionale autoriteit in Karlsruhe, Duitsland (G216/10).

1. perfusie van de muis

  1. Offer de muis (C57BL/6; Males; 10-12weeks) met behulp van CO2 of in overeenstemming met lokale regelgeving.
    Opmerking: Retro-orbitaal bloeden kan worden uitgevoerd om het verkrijgen van controle leukocyten, met behulp van 1,5 mL EDTA-gecoate buizen. Deze methode van bloeden is alleen efficiënt onmiddellijk na het offer. Verdere, peritoneale holte lavage (PCL) kan worden uitgevoerd om het verkrijgen van controle macrofagen, met voorverwarmde PBS bij 37 ° C te vermijden koude agglutinatie van het bloed, die perfusie belemmeren kan.
  2. Desinfecteer de muis door de vacht spuiten op de buik royaal met 70% v/v ethanol en herhaaldelijk vegen met een weefsel met katoen gaas. Met behulp van botte schaar, opengesneden de buikhuid door een longitudinale incisie.
  3. De spouw van Pleurale bloot doordat een insnijding in het middenrif met behulp van gebogen, botte schaar en vervolgens uit te breiden de incisie langs de gehele lengte van de ribbenkast. Maak een soortgelijk knippen aan de contralaterale zijde tot het borstbeen kan zorgvuldig weg worden opgeheven.
  4. Met een duidelijk beeld van het hart en de grote schepen, invoegen een dagvlinder 23¾ meten naald, aangesloten op een 50 mL spuit gevuld met ijskoude PBS, in de linker kamer van het hart.
  5. Maken van een incisie aan de juiste atrium van het hart met iris schaar te maken zo groot van een stopcontact mogelijk zonder beschadiging van de aflopende aorta en dan zachtjes drukken de spuit te duwen door ongeveer 30 mL PBS. De afgescheiden moet duidelijk worden uitgevoerd. Het opruimen van de lever en/of de nieren kan worden gebruikt als een indicator van een goede perfusie.

2. dissectie van de nervus ischiadicus en DRG

Opmerking: Voor de dissectie van de ischiadicus zenuwen, de huid boven de gluteus maximus wordt verwijderd en de muis is gepositioneerd ventrale zijde omlaag terwijl het strekken van de onderste ledematen.

  1. Bilateraal ontleden de hele ischiadicus zenuwen door het scheiden van het spierweefsel van de dorsale bovenbeen, en volgen de zenuw langs de wervelkolom. Snijd de zenuw waar het verlaten van de wervelkolom en onmiddellijk boven de knie aan de andere kant.
    Opmerking: Vermijd buitensporige behandeling van de zenuw zoals breken of trekken met een tang.
  2. Met behulp van Tang, breng de verwijderde nerve(s), ongeveer 2 cm per zenuw, tot een 1,5 mL koker met 1 mL ijskoud PBS en winkel op ijs.
    Opmerking: De zenuw kan worden opgeslagen 's nachts op het ijs.
    Opmerking: Voor de DRG dissectie, gebruik pincet en een scalpel, loskoppelen de huid van de onderliggende weke delen door voorzichtig peeling uit de resterende terug huid bloot van de cervicale, thoracale en lumbale spinale regio's. Verwijder het hoofd door te snijden aan de onderkant van de schedel met behulp van een botte schaar.
  3. Delen van de ribben parallel met en dicht bij de wervelkolom aan beide zijden, voordat de ingewanden loskoppelen op de voorste kant van de wervelkolom aangesloten. Knip het dijbeen en het verwijderen van de wervelkolom door een dwarse snede op het niveau van het dijbeen. Met behulp van iris schaar, knip weg elke spier, vet en andere zachte weefsels van de wervelkolom.
  4. Plaatsen van de wervelkolom met de dorsale zijde naar boven en opent u het, vanaf caudal eind, door een tip van de schaar te glijden naar het vertebral kanaal om de drie uur positie en het bot geknipt. Herhaal de procedure op de negen uur positie.
    Opmerking: Het is belangrijk om te snijden precies in het midden om te voorkomen beschadiging van de Deutsche Reichsbahn.
  5. Herhaal het snijden van links-naar-rechts totdat de rostraal einde is bereikt en het ruggenmerg is volledig blootgesteld. Met behulp van een Microscoop dissectie, verwijder het ruggenmerg om de spinale zenuwen, die kunnen worden gebruikt om te zoeken van de DRG binnen de wervelkolom bloot te stellen.
  6. De lumbale DRG verwijderen door zachtjes te trekken op de achterwortelganglia te trekken van de DRG in de vertebral grachten, vervolgens de zenuwen en bindweefsel met iris schaar te verwijderen van de DRG knippen.
    Opmerking: Het is mogelijk om te beperken van de collectie aan de L4-L6 DRG, die een bijdrage leveren aan de nervus ischiadicus.
  7. Met behulp van Tang, de DRG overbrengen in een tube van 1,5 mL met ongeveer 1 mL ijskoud PBS, en sla op ijs.
    Opmerking: De zenuw kan worden opgeslagen 's nachts op het ijs.

3. de vertering van de nervus ischiadicus en DRG

  1. De spijsvertering media (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1,6 mg/mL collagenase Type 4) aangevuld met 100 µg/mL deoxyribonuclease, en winkel op ijs bereiden.
    Nota: Het bedrag van spijsvertering medium nodig per muis (ischiadicus zenuwen + DRG) is 1 mL. Zodra voorbereid, kunnen aliquots van de spijsvertering-media worden opgeslagen bij-20 ° C.
  2. De ischiadicus zenuwen en de DRG overbrengen van een muis in aparte 1,5 mL buizen met 500 µL van spijsvertering media. Voor de ischiadicus zenuwen, snijd het materiaal in 15-20 stukken met behulp van voorjaar schaar en vervolgens uit te broeden de schorsingen weefsel in een schudden incubator bij 37 ° C gedurende 20 minuten met zachte agitatie (≤ 450 rpm).
  3. Herhaaldelijk triturate de celsuspensie door 1.000 µL Pipetteer tip om mechanisch distantiëren van eventuele onvolledig verteerd weefsel.
    Opmerking: Als de schorsing moeilijk is te Titreer, knip het uiteinde van de pipet met een schaar een botte uiteinde maken. Incubeer de opschorting van de weefsel bij 37 ° C gedurende 20 minuten met zachte agitatie (≤ 450 rpm).
  4. Herhaal de verpulvering via een 1.000 µL pipette uiteinde en incubeer gedurende een verdere 10 minuten bij 37 ° C met zachte agitatie (≤ 450 rpm).
  5. De FACS buffer (PBS aangevuld met 10% FCS en 1 mM EDTA) voor te bereiden en op te slaan op het ijs. Spoel en geniet van een scherm van roestvrij staal met een maaswijdte van 140 µm met FACS buffer in 60 x 15 mm petrischaal op ijs.
    Opmerking: Nylon scherm filters moeten worden vermeden omdat het leidt tot een aanzienlijk verlies in de oogst van genucleëerde cellen.
  6. Herhaaldelijk passeren de schorsingen weefsel het 140 µm scherm filter, zoals het wordt gehouden over de petrischaal, met een botte Tang, op ijs. De celsuspensie van de petrischaal verzamelen en overbrengen naar een nieuwe 1,5 mL-buis op ijs opgeslagen.
  7. Duw een onvolledig verteerd weefsel dat op het filter via door herhaalde verpulvering met een 1.000 µL pipette uiteinde blijft. Spoel het scherm filter tweemaal met 500 µL van FACS buffer en verzamelen de resulterende celsuspensie in de petrischaal te combineren met de celsuspensie uit stap 3.6.
    Opmerking: Als de cytometer van de stroom gebruikt gevoelig voor vuil is, kan de celsuspensie uit stap 3.7 worden doorgegeven door een 70 µm scherm filter; Dit kan echter leiden tot een verlies in de oogst van genucleëerde cellen.
  8. Centrifugeer de schorsingen van de cel bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL FACS buffer. Deze wassen stap eenmaal herhaald.
  9. Resuspendeer de pellet cel in 150-350 µL van FACS buffer, afhankelijk van het aantal kleuring die zijn vereist (150 µL FACS buffer per kleuring paneel).

4. vlekken van de nervus ischiadicus en DRG met Fluorescently gelabelde antilichamen voor stroom Cytometry

  1. Pipetteer 100 µL van de nervus ischiadicus of DRG celsuspensie in een V-vormige goed in een 96-wells-plaat op ijs.
    Opmerking: Single-gekleurde cellen nodig zijn voor alle antilichamen gebruikt als zij voor de nodige controles zorgt voor het instellen van de stroom cytometry ten aanzien van fotomultiplicator buizen (PMT) spanning winsten en compensatie, ook om te helpen onderscheiden van specifieke niet-specifieke binding. Als gevolg van de beperkte materiaal beschikbaar zijn vanaf de nervus ischiadicus en DRG, bloed leukocyten en macrofagen van de PCL (stappen 1.1-1.2) kunnen worden gebruikt als de single gebeitste besturingselementen, de kleuring voor die moet worden uitgevoerd in parallel met de kleuring van de ischialgie zenuwen en DRG.
  2. Zwembad de resterende cellen schorsingen (ongeveer 50 µL per monster) uit de ischiadicus zenuwen of DRG monsters, om te dienen als een onbevlekt besturingselement.
  3. Centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat over een opslaglocatie en het toepassen van een scherpe beweging van de pols, en zachtjes Tik op keukenpapier droog.
  4. Voor oppervlakte kleuring, elk van de cel pellets resuspendeer in 20 µL van FACS buffer met de antilichamen van belang (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 en MHC Class II-Biotine) en uit te broeden, beschermd tegen licht, op ijs gedurende 30 minuten.
    Opmerking: (1) de optimale antilichaam verdunning moet worden bepaald vóór gebruik door het uitvoeren van een verdunningsreeks volgens product-informatie van de fabrikant; (2) niet-specifieke technieken kan worden verminderd door incubatie met Fc-blok bij deze stap, volgens de instructies van de fabrikant; en (3) Isotype controle technieken zijn over het algemeen niet nodig bij gebruik van primaire antilichamen direct geconjugeerd met een fluorophore en/of wanneer de antigen(s) van belang verschillende populaties produceren.
  5. 130 µL van FACS buffer toevoegen aan elk putje en centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant zoals eerder beschreven (stap 4.3) en wassen van de cel pellets tweemaal met 150 µL van FACS buffer.
    Opmerking: Als een unconjugated primair antilichaam of een primair antilichaam geconjugeerd met biotine, vervolgens een geschikt secundaire reagens, geconjugeerd met een fluorophore, op dit punt kan worden toegevoegd en stappen 4.4-4.5 worden herhaald. In het geval van dit protocol, werd streptavidine-PE/Cy7 of streptavidine-PerCP gebruikt voor het detecteren van MHC klasse II in combinatie met CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, of in combinatie met CD68-APC en F4/80-PE/Cy7, respectievelijk.
  6. Voor fixatie, na de laatste stap van het wassen, resuspendeer de cel pellets in 100 µL van 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.4). Incubeer de plaat op het ijs gedurende 10 minuten en vervolgens Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant als eerder beschreven (stap 4.3) en wassen van de cel pellets eenmaal met 150 µL van FACS buffer.
    Let op: Paraformaldehyde is giftig; Draag passende bescherming zoals handschoenen en bril, enz.
    Opmerking: Resuspendeer de cel pellets in 150 µL van FACS buffer en winkel beschermd tegen het licht, bij 4° C voor maximaal twee dagen. Als geen intracellulaire kleuring vereist is, ga dan naar stap 4.11 na centrifugeren van de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  7. Voor het intracellulaire kleuring, resuspendeer de cel pellets in 150 µL van FACS buffer+0.5% wasmiddel en Incubeer bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht voor 15 min. Centrifuge de plaat 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant als eerder beschreven (stap 4.3) en de cel pellet eenmaal met 150 µL van FACS buffer + 0,5% wasmiddel wassen. Resuspendeer de pellet cel in 20 µL van FACS buffer+0.5% detergenten die de antilichamen van belang (CD68-APC, CD206-PE) en uit te broeden, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  8. 130 µL van FACS buffer+0.5% wasmiddel toevoegen aan elk putje en centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant zoals eerder beschreven (stap 4.3) en de cel pellets tweemaal met 150 µL van FACS buffer + 0,5% wasmiddel wassen.
    Opmerking: Als een unconjugated primair antilichaam of een primair antilichaam geconjugeerd met biotine, vervolgens een geschikt secundaire reagens, geconjugeerd met een fluorophore, kan worden toegevoegd op dit punt en stappen 4.9-4.10 herhaald.
  9. Resuspendeer de cel pellets in 150 µL van FACS buffer + 0,5% wasmiddel en winkel, beschermd tegen het licht, bij 4 ° C voor maximaal twee dagen.
  10. Resuspendeer de cel pellets met 150 µL FACS buffer + 0,5% wasmiddel aangevuld met 5 µg/mL DAPI en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht. Centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant zoals hiervoor is beschreven (stap 4.3).
  11. Resuspendeer de cel pellets in 150 µL van PBS en overdracht aan een adequaat gelabelde FACs buis. Bewaren bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht, tot klaar voor analyse.
    Opmerking: Na hersuspensie in PBS, de cellen moeten worden geanalyseerd binnen enkele uren, aangezien de DAPI langzaam van het DNA distantiëren zal, wat leidt tot een verlies van signaal.

5. installatie van Cytometry van de stroom en de werking van monsters

  1. Zorgen dat de stroom cytometer is uitgerust met het passende lasers en/of filter ingesteld voor het meten van de fluorophores gebruikt om de cellen vlek. Dit kan worden bepaald onder de standaardconfiguratie van de cytometer op het systeem. In het geval van dit protocol, werden cellen geanalyseerd met behulp van een cytometer van de stroom uitgerust met drie lasers (405 nm, 488 nm en 633 nm) waardoor voor de detectie van ≤ 5 fluorophores.
  2. Selecteer de passende kanalen voor de detectie van de fluorophores van belang. Alle fluorescerende signalen zijn best met logaritmische amplificatie ontdekt.
  3. Selecteer een geschikte debiet voor de monsters. Deze parameter kan variëren afhankelijk van het gebruikte systeem en empirisch moet worden bepaald. In het geval van dit protocol, werd een debiet van MED-aan-HI (35-60 µL/min) gebruikt om te voorkomen dat de verstopping van de naald.
  4. Selecteer het totale aantal gebeurtenissen/cellen worden verzameld per monster. Het minimum aantal gebeurtenissen moet 1.000.000.
  5. Maken van scatter percelen onder een globale werkblad van het SSC-A versus FSC-A, alsmede voor elke fluorophore van belang versus FCS-A. Een statistische weergave maken waarmee het aantal gebeurtenissen en de gemiddelde TL intensiteit (MFI's) voor de geselecteerde fluorophores wordt weergegeven.
  6. De spanning van de FSC-A en WS-A kanalen, zo ingesteld dat de kleinste cellen in de onderste linker 10% van de scatterplot passen. Bepalen de achtergrond fluorescentie en minimaal een steekproef fluorescentie van de onbevlekt besturingselementen uit de ischiadicus zenuwen of DRG. bepalen de ouders (P1)-poort op basis van de scatter van alleen-DAPI plot kleuring besturingselementen.
    Opmerking: Dit is niet een collectie gate, die gedeeltelijk aan de heterogene aard van de DAPI + bevolking in de PNS.
  7. Met behulp van het FSC-scatter percelen voor elk van de fluorophores van belang, de spanningen aan te passen, zodat de cellen van het Onbevlekt besturingselement vallen binnen het lagere kwartaal van hun respectieve scatter percelen. Poorten worden dan gemaakt boven deze regio te definiëren van de cellen die positief voor elk van de respectieve markeringen/fluorophores zijn. De plaatsing van een poort wordt bevestigd door het uitvoeren van het besturingselement één gebeitste (stap 4.1).
    Opmerking: Compensatie voor overlappende emissie spectra kan worden uitgevoerd op dit punt of met terugwerkende kracht toegepast met de juiste analysesoftware.
  8. Nadat de stroom cytometer heeft ingesteld, zoals wordt beschreven, kunnen de monsters worden uitgevoerd.
  9. Na de run, de resterende monstermateriaal kan worden afgevoerd en de FCS-bestanden kunnen worden geëxporteerd voor nadere analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Cel schorsingen van zowel full-length ischiadicus zenuwen en alle belangrijke DRG waren voorbereid, volgens het protocol van zes gezonde C57BL/6 muizen en onderverdeeld in drie gelijke porties voor kleuring. Teller kleuring met DAPI, die vlekken van DNA, zorgt voor de detectie van een enkele cel bevolking (figuur 1A-B, bovenste deelvenster). Spoelen van de DAPI, vóór de analyse door stroom cytometry, daalde tot op zekere hoog...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ischiadicus zenuwen bevatten een groot aantal lipiden, zoals cholesterol, als gevolg van de inhoud van myeline rond de axonen. Aangezien de eigenschappen van lipiden met temperatuur veranderen, kunnen verschillende resultaten bij verschillende temperaturen worden verkregen. Conservering van de cel, werden alle stappen in dit protocol na de spijsvertering uitgevoerd op het ijs. Terwijl de consistentie wordt aanbevolen omwille van de reproduceerbaarheid van de resultaten, is het wellicht mogelijk om het rendement te verhog...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten van belang met betrekking tot deze studie.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). De auteurs bedank Axel Erhardt voor allermeest naar de dissectie uitvoeren en behulpzaam het overbrengen van deze kennis, en Dr. Volker Eckstein voor het assisteren in het technische aspect van de cytometer van de stroom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C57BL/6 MuisCharles RiverC57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)Thermo31885023De bron van dit materiaal is niet belangrijk
HEPESSigma-AldrichH3375
Bovine serum albumine (BSA)Sigma-AldrichA2153
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corp., VSLS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I uit bovien pancreas ISigma-AldrichDN25-1g
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma-AldrichE6758
Foetaal runder serum (FCS), hitte-geïnactiveerdSigma-AldrichF4135
Antilichaam tegen CD11b-PerCP/Cy5.5Biolegend101228Clone M1/70
Antilichaam tegen MHC klasse II, gebiotinyleerdBiolegend107603Clone M5/114.15.2
Antilichaam tegen CD45-A647Biolegend107603Clone 30-F11
Antilichaam tegen CD68-APCBiolegend137007Clone FA/11
Antilichaam tegen CD206-PEBiolegend141706Clone C068C2
Antilichaam tegen F4/80-PE/Cy7Biolegend123113Clone BM8
Streptavidine-PE/Cy7Biolegend405206Wordt gebruikt om MHCII-biotine te detecteren met CD45-A647 en CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidine-PerCPBiolegend405213Wordt gebruikt om MHCII-biotine te detecteren met CD68-APC en F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787
DAPISigma-AldrichD9542-1MGVerdun in PBS tot een 50x en bewaar bij 4 °C in het donker
Celdissociatiezeef - weefselmolenkitSigma-AldrichCD1
V-vormige, 96-well platenGreiner/SigmaM8185
5ml polystyreen buisje met ronde bodem, 12x75mmBD Biosciences352008
60x15mm petrischaalGreiner/SigmaZ643084
BD LSR II Flow CytometerBD Biosciences

Referenties

  1. DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
  2. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
  3. Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
  4. Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
  5. Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
  6. Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
  7. Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies? Glia. 64, 475-486 (2016).
  8. Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
  9. Leong, T. Y. -M., Leong, A. S. -Y. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
  10. Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
  11. Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
  12. Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262(2016).
  13. Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nervus ischiadicusanalyse van immuuncellensingle cell analysecelisolatieweefseldigestieCD45 expressieleukocyteninfiltratieperifeer zenuwstelsel

Gerelateerde artikelen