We beschrijven een histochemische procedure die onthult karakteristiek laminaire en areal zink kleuring patronen in verschillende hersengebieden. Het patroon van zink-kleuring kan worden gebruikt in combinatie met andere anatomische markeringen op betrouwbare wijze onderscheiden lagen en regio's in de ontwikkelingslanden en volwassen brein.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gebruik van Synaptic zink histochemie onthullen verschillende regio's en Laminae in de ontwikkelingslanden en volwassen brein
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Karakterisering van de hersenen van de anatomische en functionele organisatie en ontwikkeling vereist nauwkeurige identificatie van afzonderlijke neurale circuits en regio's in de onvolwassen en volwassen brein. Hier beschrijven we een zink-histochemische kleuring-procedure die verschillen in kleuring patronen tussen verschillende lagen en hersengebieden onthult. Anderen hebben gebruikt deze procedure niet te onthullen van de verdeling van de zink-bevattende neuronen en circuits in de hersenen, maar ook om af te bakenen met succes areal en laminaire grenzen in de ontwikkelingslanden en volwassen hersenen in verschillende soorten. Hier we illustreren dit kleuring procedure met beelden uit ontwikkelingslanden en volwassen ferret hersenen. We onthullen een zink-kleuring patroon dat als een anatomische markering van gebieden en lagen fungeert, en op betrouwbare wijze kan worden gebruikt om te onderscheiden van de visuele corticale gebieden in de ontwikkelingslanden en volwassen visuele cortex. Het hoofddoel van dit protocol is te presenteren een histochemische methode waarmee de nauwkeurige identificatie van lagen en regio's in de ontwikkelingslanden en volwassen hersenen waar andere methoden niet in slaagt om dat te doen. Subsidiair, in combinatie met densitometric beeldanalyse, deze methode maakt het mogelijk om te beoordelen van de verdeling van de synaptische zink te onthullen van eventuele veranderingen in de gehele ontwikkeling. Dit protocol beschrijft in detail de reagentia, instrumenten en stappen die nodig zijn om achtereenvolgens vlek bevroren hersenen secties. Hoewel dit protocol wordt beschreven met behulp van ferret hersenweefsel, kan het gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in knaagdieren, katten en apen ook zoals in andere hersengebieden.
Inleiding
Histologische vlekken hebben van oudsher gebruikt om te helpen bij de identificatie van de corticale gebieden in verschillende soorten door te onthullen van de verschillen in architectonische kenmerken. Het gecombineerd gebruik van histochemische technieken zoals voor Nissl-substantie, cytochrome oxidase (CO) reactiviteit of myeline kan afwerpen als ze soortgelijke areal grenzen in het volwassen brein onthullen. Echter, deze histochemische vlekken niet altijd adequaat onthullen duidelijke grenzen tussen corticale gebieden en lagen in de onvolgroeide hersenen.
In het centrale zenuwstelsel heeft zink verscheidene kritieke functies waarin het stabiliseren van de DNA-structuur, die fungeert als een enzym cofactor, deelnemen aan diverse regelgevende functie, en fungeert als een neuromodulator door haar aanwezigheid in synaptische vesikels 1. synaptic zink is uniek, omdat het kan worden gevisualiseerd met behulp van de methoden van het histologische, overwegende dat eiwit-gebonden zink niet gevisualiseerde2. Deze functie heeft benut om te onthullen het patroon van de synaptische zink in verschillende corticale gebieden, en synaptische zink histochemie is gebruikt in een aantal studies. Een subset van glutamaterge neuronen in de cortex cerebri bevatten zink in de presynaptische blaasjes binnen hun axon terminals3,4. Histochemische studies is gebleken een heterogene verdeling van synaptic zink in de hersenschors5,6,7. Er lijkt te zijn van een verschillende areal en laminaire verdeling van histochemically reactieve zink in verschillende corticale gebieden (bijvoorbeeldvisuele versus Somatosensorische cortex) of lagen (b.v.zink niveau in de supragranular en infragranular lagen van primaire visuele cortex zijn aanzienlijk hoger dan in thalamocortical invoerlaag IV met relatief lage synaptic zink niveaus)5,8,9. De heterogeniteit in synaptic zink kleuring waargenomen in de cortex is vooral voordelig als het vergemakkelijkt areal en laminaire identificatie.
Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een synaptic zink histochemische procedure, die een gewijzigde versie van Danscher van 1982 methode10 is. Deze methode maakt gebruik van seleniet geïnjecteerd intraperitoneally (IP) in dieren als een chelaatvormer. De seleniet reist naar de hersenen om te reageren met zwembaden gratis zink in de blaasjes van een subset van glutamaterge synapsen in de hersenen gevonden. Deze reactie resulteert in een neerslag die vervolgens kan worden verbeterd door zilveren ontwikkeling2,10,11.
Deze procedure blijkt laminaire en areal patronen van synaptische zink kleuring; densitometric analyse kan worden gebruikt ter beoordeling van deze patronen zowel kwalitatief en kwantitatief in de volwassen en onvolgroeide hersenen effecten van andere ingrepen, zoals zintuiglijke, milieu, farmacologische of genetische manipulaties te bestuderen. Bovendien kan een ook willen beoordelen van mogelijke ontwikkelings veranderingen in de distributie van synaptic zink in andere corticale en subcorticale structuren in andere modelsystemen. De kwantitatieve gegevens die densitometric analyse in deze methode verschaft kan nuttig zijn voor de volgende ontwikkeling van de hersenen na verloop van tijd. Dit protocol biedt een metgezel te andere immuno - histochemische markeringen te onthullen van laminaire en areal grenzen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
het volgende protocol volgt de richtsnoeren van de dierenverzorgers opgericht door de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) aan het City College van New York, die aan alle passende staat en federale richtlijnen voldoen. Narcose is geschikt voor fretten, en moet worden gewijzigd volgens soorten studeerde.
Figuur 1: overzicht van de belangrijke stappen die betrokken zijn bij de 3 fasen van dit protocol stroomdiagram en de benodigde tijd voor het voltooien van elke stap. Perioden waarvoor secties volledig drogen staan in groene tekst cirkels, terwijl alle andere stappen in witte tekst kringen zijn. De groene diamant-vormige tekstvak is een beslissingspunt, terwijl de rode rechthoek een cruciale stap is en moet worden uitgevoerd met extra zorg. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
1. voorbereidende stappen (schuif Subbing en het maken van de oplossing)
- unsubbed dia's met een detergent in warm water te wassen en spoel verschillende malen in warm water volgde met een gedestilleerd water Spoel grondig verwijderen modder of gruis bevatten. Laat dia's te drogen bij kamertemperatuur of in een oven bij 37 ° C.
- Zodra de dia's zijn volledig droog, laag een dunne zelfs laag van ei-wit op elke dia met behulp van de vingers of een verfkwast. Laten drogen in de oven op 60 ° C gedurende 20-30 min. Voor een optimaal resultaat te voorkomen uitglijden uit secties, toevoegen van een tweede laagje ei wit en laten drogen nogmaals in de oven op 60 ° C.
- Bereid een 1% gelatine oplossing door ontbinding van 1 gram gelatine in 100 mL warm water (60 ° C) en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
- 200 mL van de oplossing van de ontwikkelaar te bereiden, zoals hieronder beschreven voor gebruik in sectie 4.
- Voorbereiden Arabische gom oplossing door langzaam toe te voegen 40 g in stappen aan 120 mL warm water (het oplost gemakkelijker op deze manier). Roer de oplossing om met een glas rod roeren blijven. Zodra de oplossing volledig is opgelost, haal het van het vuur en laat ze afkoelen gedurende een paar minuten staan, filtreer vervolgens door 6-8 lagen van gaas doek in een trechter.
- Voorbereiden citraat buffer door toevoeging van 5.04 g citroenzuur plus 4.7 g Natriumcitraat in 20 mL dH 2 O en ontbinding van het mengsel. Ervoor zorgen dat de pH van deze oplossing 4.0 op 25 ° C. aanpassen de pH zo nodig door toevoeging van natriumhydroxide- of zoutzuur aan de oplossing.
- Bereid de Hydrochinon-oplossing door verwarming van 30 mL dH 2 O en ontbinding van 1,7 g Hydrochinon.
Opmerking: Opwarmen van de Hydrochinon oplossing is essentieel om te kunnen gemakkelijk oplossen in water, zoals Hydrochinon geen gemakkelijk oplosbaar in water op kamertemperatuur is. Wees voorzichtig om te houden van de temperatuur van het water lager dan 60 ° C, anders Hydrochinon kan worden geoxideerd. Als de oplossing omslaat naar geel, negeren en bereid een ander vers oplossing. - Voorbereiden zilver lactate oplossing door ontbinding van 0,22 g in 30 mL dH 2 O.
- Vermeng de oplossingen (1.4.1 - 1.4.4) in de volgorde waarin ze worden beschreven als u klaar bent voor het uitvoeren van de reacties (dat wil zeggen, na afdelen, drogen en vaststelling) ( Figuur 2). De zilveren lactaat oplossing aan het einde toevoegen. Waarborgen dat deze stap snel afgewerkt is en de ontwikkelaar-oplossing wordt geplaatst in het donker totdat het tijd om te reageren de secties zoals Zilveren lactaat lichtgevoelige is.
Figuur 2: schematische voorstelling ter illustratie van de volgorde van de stappen betrokken bij het de reagentia te mengen in de zink-histochemie periode van het protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
2. dier behandeling en anesthesie
- voorafgaand aan het dier, sederende bereid een 1% natrium seleniet (nb 2 SeO 3)-oplossing door het oplossen van 10 mg Natriumseleniet in 1 mL dH 2 O.
- Anesthetize het dier met een intramusculaire injectie van ketamine (25 mg/kg) en xylazine (2 mg/kg).
Opmerking: Zorg ervoor dat een passend niveau van de verdoving wordt bereikt met behulp van de pedaal reflex reactie. - Inject zink complexvormer natrium seleniet oplossing (15 mg/kg) intraperitoneally (IP).
Opmerking: De toxiciteit van Natriumseleniet op verschillende leeftijden of in andere soorten kan variëren. - Laat 60 tot 90 min voor de Natriumseleniet om te reizen naar de hersenen. Tijdens deze periode, is het noodzakelijk om te zorgen dat het dier is goed verdoofd en niet-reagerende is, dus check diepte van anesthesie elke 5 min.
- Deperiode seleniet, terwijl het dier wordt verdoofd, ervoor zorgen dat de ogen worden gesloten ter voorkoming van droogte, of beheren van oogheelkundige zalf om ze te houden vochtige.
3. Weefsel voorbereiding en Staining
- het dier door het toedienen van een overdosis van natrium pentobarbital (100 mg/kg, i.p) euthanaseren.
- Uitvoeren transcardial perfusie met normale zoutoplossing voor 1 min en 4% paraformaldehyde voor 20 min. ten slotte beheren een oplossing met 4% paraformaldehyde en 10% sacharose (een totale fixatie periode van 1U).
- Het hoofd met behulp van een paar grote schaar verwijderen.
- Maken van een incisie van de middellijn met behulp van een scalpel vanaf de neus naar de nek om bloot van de schedel.
- Verwijder voorzichtig de hersenen en het scheiden van de hemisferen met een mes.
- Blokkeren het posterieure deel van de hersenen en postfix in 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) voor enkele uren.
- Plaats van de blokken in een 30% sacharoseoplossing in 0,1 M PB en laat de hersenen te zinken.
Opmerking: De 4% paraformaldehyde en 30% sacharoseoplossing vervangen door 30% sacharoseoplossing in 0,1 M PB te zinken van de hersenen beperkt de hersenen ' s blootstelling aan paraformaldehyde als dit kan invloed hebben op weefsel kleuring kwaliteit. - Eens de hersenen putten, gesneden semi-tangentiële 40 µm dik secties door middel van de visuele cortex of regio van rente op een bevriezing, glijdende microtoom of cryostaat. Dit kan worden bereikt door het plaatsen van het blok met het mediale oppervlak neer en zachtjes afvlakken met een glasplaatje.
- Verzamelen secties met een penseel en winkel in een doos van de pakken met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Scheiden de secties in afzonderlijk genummerde reeks. Direct monteren een of twee reeksen van hersenen secties op ei-wit subbed dia's (sectie 1), laat droog 's nachts bij kamertemperatuur, en verwerken van secties histochemically voor synaptic zink.
Opmerking: Andere series mogen worden verwerkt voor andere merkers voor vergelijking, zoals myeline 12 of cytochroom oxidase met behulp van de gewijzigde protocol 13: Incubeer gedurende 2-8 h bij 40 ° C met 3 gewichtspercenten sacharose, 0,015% cytochroom C, katalase 0,015% en 0,02% diaminobenzidine in 0,1 M PB. Nissl stof kan ook worden gebruikt als een histologische merker voor de visuele corticale gebieden onderscheiden. Deze andere histologische vlekken vereisen niet dat de hersenen secties zijn gemonteerd op ei-wit subbed dia's, zodat de traditionele gelatine bedekt dia's kunnen worden gebruikt in plaats daarvan.
4. Synaptic zink histochemie
- Fix dia gemonteerd secties in absolute alcohol gedurende 15 minuten en laten drogen volledig bij kamertemperatuur voor 1 h. < lik > kort onderdompelen secties voor 10 s in een oplossing van 1% gelatine (sectie 1) en laat het droge overnachting bij kamertemperatuur.
- Meng de oplossingen zoals beschreven in stap 1.8 zodra secties zijn klaar om te worden gereageerd.
- Reageren de secties door de dia's naast elkaar in een glas of plastic lade rangschikken en gieten de ontwikkelende oplossing in de dia's. Controleren of dia's zijn volledig ondergedompeld in de oplossing en breng de lade in een donkere ruimte, of bedek met een licht-strakke vak.
Opmerking: Een kunststof dienblad thats ongeveer 12 inches long door 8 inch breed inzetbaar, die past precies 18 dia's. Een totaal volume van 200 mL ontwikkelaar oplossing is voldoende om volledig onderdompelen van de dia's, dus zorg ervoor dat het juiste volume wordt gebruikt voor het aantal dia's worden gereageerd en het recept dienovereenkomstig aan te passen. Gebruik van een plastic of glas lade in plaats van een metalen lade is aan te raden als er een zekere mate van grensoverschrijdende reactiviteit tussen de zilveren lactaat in de oplossing van de ontwikkelaar en het ijzer is of andere gevonden in metalen dienbladen metalen.
- Reageren de secties door de dia's naast elkaar in een glas of plastic lade rangschikken en gieten de ontwikkelende oplossing in de dia's. Controleren of dia's zijn volledig ondergedompeld in de oplossing en breng de lade in een donkere ruimte, of bedek met een licht-strakke vak.
- Toezicht op de ontwikkeling van de reactie door visueel inspecteren de secties elke 30 min. De secties in het algemeen vereisen 120-180 min voor volledige ontwikkeling.
- Als secties worden overstained (Zie Figuur 3a), onderscheid maken in 2% boer ' s oplossing (9 delen 2% natrium thiosulfate in dH 2 O en 1 deel 2% kalium Hexacyanoferraat in dH, 2 O) voor 1-2 min.
Opmerking: Monster-sectie die is slecht gekleurd wordt weergegeven in Figuur 3b. - Zodra de gewenste intensiteit bereikt is, de reactie beëindigen door het verwijderen van de dia gemonteerd secties uit de lade en het plaatsen van de dia's op een dia rek.
- Plaats de dia rek in een grote glazen schotel kleuring en wassen van de dia's in warm (40-50 ° C) stromend water gedurende 10 minuten om de vacht van de gelatine en de buitenste zilveren storting.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te doorroeren het dia-rek om te voorkomen dat secties uit uitglijden. De gewenste intensiteit van de sectie wordt bereikt wanneer voldoende laminaire variatie duidelijk is en secties donker genoeg maar niet overdreven (Zie figuur 4a zijn). - Laat de dia's te drogen bij kamertemperatuur, en vervolgens uitdrogen in 100% EtOH (5 min), duidelijk in xyleen (5 min) en cover slip met een montage-medium. U kunt ook plaats de dia's in een oplopende reeks van alcohol en vervolgens uitdrogen, duidelijk, en dekglaasje aan.
- Gebruik secties van dieren zonder eerdere seleniet behandeling om te dienen als een negatieve controle. Zilveren versterking van deze secties moet opleveren, geen kleuring.
Opmerking: Voor optimale resultaten kunt u secties te droog 's nachts. Secties te droog 's nachts waardoor levert betere weefsel kleuring.
Figuur 3: Synaptic zink vlekken in de hersenen van het jonge ferret. Photomicrographs van semi-tangentiële zink gebeitste secties die a) overstained en b) understained in de hersenen van het jonge ferret. Areal grenzen zijn moeilijk te onderscheiden zoals laminaire variatie ontbreekt. Witte stof is ook sterk gekleurd. Ssy Suprasylvian cortex, WM White matter, een anterior, D dorsale. Schaal bar = 500 µm (a-b). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
5. onderscheiden Areal grenzen en beeldacquisitie
- gebruik architectonische kenmerken van verschillende hersengebieden voor areal en laminaire identificatie.
Opmerking: bijvoorbeeld, in de ontwikkelingslanden rat retrosplenial cortex 14, de auteurs bleek een voorbijgaande modulariteit gekenmerkt door zware kleuring voor zink, die is niet aanwezig in de volwassene, maar kan worden gebruikt om te beschrijven corticale organisatie tijdens de ontwikkeling in deze soort. In een andere studie 15 bleek de auteurs specificiteit in de synaptische zink-verdeling van de verschillende kernen gevonden in de makaak monkey amygdala, die de identificatie van deze verdeeldheid te vergemakkelijken. Visuele corticale gebieden in de ontwikkelingslanden en volwassen ferret hersenen geweest eerder beschreven 16 , 17 , 18, architectonische onderverdeling van de neocortex in de grijze eekhoorn werden beschreven 19. Bovendien, zink histochemie werd eerder gebruikt om te onderscheiden tussen verschillende gebieden van de volwassen aap visuele cortex 8, ontwikkelen en volwassen kat visuele cortex 5, ontwikkeling van rat Somatosensorische cortex 9 , 20 en volwassen muis Somatosensorische cortex 6 , 21. Indien beschikbaar, vergelijk de kleuring patroon in myeline bevlekt, cytochrome oxidase (CO) gekleurd en synaptische zink gekleurd hersenen secties, om te bevestigen areal grenzen in de volwassene. In semi-tangentiële secties van de visuele cortex ferret gekleurd voor synaptic zink, zijn er opvallende verschillen tussen de visuele corticale gebieden die areal identificatie te vergemakkelijken. Bijvoorbeeld onthullen gebieden 17 en 18 van de volwassen ferret dat synaptic zink kleuring hoog in lagen III is en V. laag VI minder intens, vlekken terwijl laag IV bijna zink mist. Het opvallende gebrek aan zink kleuring in laag IV of gebieden 17 en 18 staat in contrast met het donker gekleurde band gevonden in laag dat IV in CO gekleurd secties. Echter laag IV van gebied 17 in CO gekleurd secties onderhoudt een scherpe grens met lagen III en V, maar laag IV in het gebied 18 wordt gekenmerkt door een subtiele afname van de kleuring van de intensiteit en de bovenste grens gevonden in laag III is minder te onderscheiden. - Onderzoeken van secties helderveld microscopie met de doelstelling van een laag energieverbruik (2 X of 4 X vergroting) en gebieden van belang fotograferen.
- Verfraaien contrast en de helderheid van de photomicrographs met behulp van beeld processing software. Beelden verkregen voor extinctie metingen niet mag worden getornd geenszins.
Figuur 4: Synaptic zink vlekken in het brein van volwassen ferret onderscheidt verschillende visuele corticale gebieden. Photomicrographs van aangrenzende semi-tangentiële secties gekleurd voor (een) synaptic zink of (b) cytochroom oxidase (CO) in de volwassene. Pijlen mark areal grenzen. Ssy Suprasylvian cortex, een anterior, D dorsale. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
6. densitometrie (optioneel)
Opmerking: Densitometric analyse kan worden gebruikt ter beoordeling van de verdeling van de synaptische zink in de hersenen door het meten van de extinctie van representatieve zink gekleurd secties in de regio's van belang. Deze methode is ook nuttig voor het opsporen van eventuele veranderingen in synaptic zink niveau van ontwikkeling.
- Gebruiken geselecteerd zink gebeitste secties, kiezen willekeurig corticale kolommen (in kolomvorm photomicrographs) van passende breedte (een 450 µm brede kolom kan worden gebruikt) verworven photomicrographs van de regio van belang. Een corticale kolom is een gebied dat alle corticale lagen van het pial oppervlak aan de witte stof.
- Een passend aantal monster kolommen kiezen uit meerdere verschillende hersenen secties in elk gebied van belang.
- Pipetteer sample images van representatieve kolommen in een beeldverwerkingssoftware.
- Gebruik van het gereedschap rechthoekige selecteren te omvatten de gehele corticale kolom.
- Gebruiken omkeren om te maken dat een contrast omgekeerd beeld lijkt op een fotografische negatief van de kolom.
Opmerking: Contrast inversie van de beelden is zodanig dat deze hoge optische dichtheid voor hoge synaptic zink niveaus en lage extinctie waarden voor laag synaptic zink niveaus uitgevoerd. Dit is een meer intuïtieve manier om te renderen perceel profiel grafieken vergelijkbaar met degene die gezien in Figuur 5. - Profielen van de optische dichtheid van deze beelden te produceren met behulp van het gereedschap Tekengebied profiel voor het genereren van een tweedimensionale grafiek van de pixel intensiteiten langs een lijn.
- Plot-opties gebruiken om de plot profiel grafiek omzetten in een verticaal profiel en klik op perceel profile eenmaal meer.
Opmerking: De x-as vertegenwoordigt afstand langs de lijn en de y-as geeft de intensiteit van de pixel. Dus, de waarde van elk perceel profiel weerspiegelt de waarde van de gemiddelde grijstinten op iedere diepte over de breedte van de kolom. - Open perceel profiel waarden als tekstbestanden in werkblad, normaliseren, en plot als grafieken (Zie Figuur 5).
Opmerking: Het is raadzaam om het gebruik van de relatieve dichtheid van synaptic zink voor vergelijking van kwantitatieve metingen, zoals resultaten kunnen worden verward door variatie in totale kleuring intensiteit als gevolg van verschillende reactietijden, stainability van weefsel, alsmede andere variabelen. - Relatieve zink dichtheid berekenen door het uitvoeren van een gemiddelde boxcar van de plot profiel waarden om de gegevens te glad.
Opmerking: Dit wordt bereikt door het gemiddeld, bijvoorbeeld elke opeenvolgende 20 of 30 pixels (1 pixel = 2,5 µm) in de diepte, en vervolgens naar maximale intensiteit voor elk monster normaliseren. Dus, elke gemiddelde perceel profielwaarde geeft de waarde van de gemiddelde grijstinten op die diepte (grijstinten waarden variëren van 0 tot 255). Een verschillende normalisatie-methode kan worden gebruikt door eerste verwervende witte stof (WM) optische dichtheid waarden uit monster regio's waaronder de onderliggende witte stof in de gebieden van belang. In het ideale geval Kies verschillende regio's, dat zijn zo licht mogelijk te verkrijgen van een gemiddelde waarde van de WM gekleurd. Gemiddelde extinctie waarden worden vervolgens gedeeld door gemiddelden om WM genormaliseerde waarden te verkrijgen in de WM. - Bepalen gemiddelde waarden van de optische dichtheid in bepaalde lagen van regio's van belang voor de vergelijkingen van de kwantitatieve.
Opmerking: bijvoorbeeld de waarde van de gemiddelde minimale optische dichtheid in laag IV van visuele corticale gebieden voor de ferret worden bepaald door de minste gebeitst regio omvat ±5 pixels. - Berekenen gemiddelde optische dichtheid waarden in de supragranular en infragranular lagen van visuele corticale gebieden voor de ferret door omvat de donkerste gebeitst regio ±5 pixels om te bepalen van de gemiddelde maximumwaarde.
- Zorg ervoor dat de gemiddelde waarden van de optische dichtheid worden verkregen binnen bepaalde lagen.
Opmerking: Het is noodzakelijk om te controleren of de grenzen van deze lagen in het contrast ondersteboven afbeeldingen door ze te vergelijken aan de oorspronkelijke photomicrographs evenals de aangrenzende CO-sectie. Dit garandeert dat een niet op aangrenzende lagen uitsteken doet.
Figuur 5: laminaire verdeling van synaptic zink in verschillende visuele corticale gebieden in de volwassen ferret. Representatieve photomicrographs van kolommen door alle corticale lagen met bijbehorende genormaliseerde extinctie profielen in een volwassene. Lage synaptic zink dichtheid in laag IV van volwassen gebieden 17 en 18 wordt aangegeven door de trog in de plot van het profiel. In elk perceel-profiel geven gevulde ovalen in de trog van laag IV de waarden gebruikt om te bepalen van de gemiddelde minimale intensiteit pixelwaarde. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De grote stappen die betrokken zijn bij dit protocol om vlek hersenen secties voor synaptic zink worden gepresenteerd in een stroomdiagram in Figuur 1. Het protocol kan worden onderverdeeld in drie fasen: 1) perfusie en weefsel collectie 2) weefsel voorbereiding en kleuring en 3) zink histochemie. Kort, tijdens de eerste fase van het protocol, het dier wordt verdoofd en IP met de juiste dosis Natriumseleniet geïnjecteerd. Na een voldoende lange tijdsperiode (...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De huidige studie maakt gebruik van een histochemische techniek gebaseerd op een gewijzigde versie van de Danscher (1982) methode10, waarbij de lokalisatie van de synaptische zink kan worden gedetecteerd en gevisualiseerd in de hersenen. Deze methode werkt in wezen door het injecteren van het dier met de zink complexvormer Natriumseleniet (nb2van SeO3) (15 mg/kg). Na injectie, de seleniet reist naar de hersenen en bindt aan gratis zink die is gelokaliseerd aan de presynaptisc...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Center for onderzoeksmiddelen (2G12RR03060-26A1); Het National Institute on minderheid gezondheid en gezondheid verschillen (8G12MD007603-27) van de National Institutes of Health; Professioneel personeel Congres-City University of New York (PSC-CUNY); en faculteit Research Grant (FRG II) Amerikaanse Universiteit van Sharjah. Wij danken Vidyasagar Sriramoju voor het introduceren van ons aan deze methoden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Euthasol (Euthanasie-oplossing) | Henry Schein | 710101 | |
| Natriumseleniet | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectieflacons |
| Xylazin (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectieflacons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Verdund tot 4% |
| Gom arabicum | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citroenzuur | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Natriumcitraat | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydrochinon | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Zilverlactaat | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Visgelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochroom c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, uit paardenhart) |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| XYleen | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Gebruikt voor dehydratie voorafgaand aan het ophangen van de dia |
| Dekglasjes | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Mat glazen dia's | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtoom | American Optical Company | 860 | |
| Microscoop | Olympus | BX-60 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | Voor het samenstellen van afbeeldingen | |
| ImageJ | Gratis software kan worden gedownload op http://rsb.info.nih.gov/ij/ | Voor densometrische metingen | |
| Kunststof lade | Elke standaard kunststof lade kan worden gebruikt | om dia's in ontwikkelingsoplossing te onderdompelen | |
| Verwarmingsplaat | Elke standaard verwarmingsplaat kan worden gebruikt |
Referenties
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
