Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor gelijktijdige beeldvorming van thalamocortical axon vertakking en de synapse formatie in organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri. Individuele thalamocortical axonen en hun presynaptische terminals worden gevisualiseerd door een eencellige electroporation techniek met DsRed en synaptophysin van GFP-gelabeld.

Samenvatting

Axon vertakking en de synapse formatie zijn cruciale processen voor de vaststelling van nauwkeurige neuronale circuits. Tijdens de ontwikkeling vormen de sensorische thalamocortical (TC) axonen takken en synapsen in bepaalde lagen van de hersenschors. Ondanks de voor de hand liggende ruimtelijke correlatie tussen axon vertakking en de synapse formatie, is de causale relatie tussen hen slecht begrepen. Om aan te pakken dit probleem, ontwikkelde we onlangs een methode om gelijktijdige beeldvorming van vertakking en de synapse formatie van individuele TC axonen in organotypic cocultures.

Dit protocol beschrijft een methode die uit een combinatie van een organotypic coculture en electroporation bestaat. Organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri vergemakkelijking van genetische manipulatie en waarneming van axonale processen, behoud van de karakteristieke structuren zoals laminaire configuratie. Twee verschillende plasmiden codering DsRed en EGFP-gelabeld synaptophysin (SYP-EGFP) waren samen transfected in een klein aantal thalamus neuronen door een electroporation techniek. Deze methode konden we visualiseren van individuele axonale morphologies van TC neuronen en hun presynaptische sites tegelijk. De methode ook ingeschakeld op lange termijn waarneming waaruit bleek het oorzakelijk verband tussen de axon vertakking en de synapse formatie.

Inleiding

De projectie van de thalamocortical (TC) in de hersenen van zoogdieren is een geschikt systeem om axon begeleiding en gericht op mechanismen te onderzoeken. Tijdens de ontwikkeling groeien sensorische axonen van de TC in de corticale plaat, en de takken van de vorm en de synapsen bij voorkeur in laag IV van de primaire sensorische gebieden in de hersenschors^1,2. Zelfs na de oprichting van fundamentele verbindingen, zijn axonale arbors en synaptische terminals verbouwd afhankelijk van milieuveranderingen^3,4. Hoe de TC axon morfologie wordt dynamisch gewijzigd is echter slecht begrepen. Een van de belangrijkste redenen is het ontbreken van een adequate techniek te observeren van structurele veranderingen op het niveau van een enkele cel. Hoewel recente ontwikkelingen in microscopie, zoals twee-foton microscopie, hebben directe observatie van levende corticale neuronen in vivois toegestaan, zijn er nog steeds technische beperkingen voor het vastleggen van de algemene TC trajecten^{5, 6}. Daarom, in vitro methoden voor live beeldvorming van TC axonen zou bieden krachtige hulpmiddelen voor structurele analyses van axon vertakking en de synapse formatie.

Onze fractie voor het eerst vastgesteld een statische segment cultuur methode met permeabel membraan⁷. Met deze methode een rat corticale segment was cocultured met een zintuiglijke thalamus blok en lamina-specifieke TC verbindingen werden gerecapituleerd in deze^7,, organotypic cocultures⁸. Sparse labelen met een fluorescente proteïne verder konden we observeren TC axon groei en tak vorming^9,10,11. Onlangs hebben we een nieuwe methode voor gelijktijdige beeldvorming van vertakking en synapse formatie van individuele TC axonen in de organotypic cocultures¹². Om te visualiseren TC axonen en presynaptische sites tegelijk, waren DsRed en EGFP-gelabeld synaptophysin (SYP-EGFP) samen transfected in een klein aantal thalamus neuronen door electroporation van de organotypic coculture. De huidige methode morfologische analyse van TC axonen vergemakkelijkt en zorgt voor lange termijn waarneming, die kan worden gebruikt om het oorzakelijk verband tussen de axon vertakking en de synapse formatie.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren die zijn vastgelegd door de commissies van het dierenwelzijn van Universiteit van Osaka en de neurowetenschappen Society van Japan.

1. Organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri

Opmerking: Voor de gedetailleerde procedure, verwijzen naar de oorspronkelijke publicaties^7,8,13. Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Sprague-Dawley (SD) ratten worden gebruikt voor neuronale culturen.

1. Preparaten van reagentia
   Opmerking: Volumes van de volgende reagentia zijn voor een rat hersenen.
   1. Voorbereiden 10 x gemodificeerde N2 Supplement ¹³: insuline (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hydrocortison (200 nM), Natriumseleniet (300 nM), transferrine (1 mg/mL), als putrescine (1 mM), glucose (60 mg/mL)
   2. Serum-bevattende kweekmedium voorbereiden (10 mL): 85% DMEM/F12, 10% 10 x bewerkt N2 supplement, 5% foetale runderserum (FBS)
   3. Serumvrij cultuurmedium voorbereiden (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% 10 x bewerkt N2 supplement
   4. Bereid rat staart collageen oplossing (0,5 mL). Kortom, neem tedere vezels uit de staart van een rat onder steriele omstandigheden en na een nacht bebroeden in azijnzuur-oplossing. Na het centrifugeren, verzamelen het supernatant (een paar mg/mL) en opslaan in een koelkast-¹³.
2. Bereiding van gerechten van de cultuur
   1. Plaats een membraan invoegen in een 35 mm petrischaal.
   2. 40-50 μl van rat staart collageen oplossing toevoegen aan het membraan, en verspreiden de collageen oplossing rond het centrum.
   3. Lucht drogen het membraan volledig in een schone bankje.
   4. Zet 1,5-2 mL serum-bevattende gestolde voedingsbodem in de schotel, zodat het membraan doorweekt met het medium is.
   5. Zet de schotel van cultuur in een incubator (37 ° C, bevochtigde lucht van 95% en 5% CO₂) voordat plating.
3. Voorbereiding van corticale segmenten
   1. Steriliseren alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol gedurende 10 minuten of langer.
   2. Ontleden van de hele hersenen snel uit een postnatale dag (P) 2 rat onder ijskoud verdoving (ondergedompeld in ijs-chips voor een paar minuten).
   3. Plaats de hersenen in een 100 mm petrischaal met 100 mL koude Hanks evenwichtige zoutoplossing.
   4. Verwijder de pia zaak van de hersenen met een fijne Tang, en corticale segmenten (300-400 μm dikte) uit de visuele en Somatosensorische cortex met microchirurgische schaar geknipt (voor detail, Zie Figuur 1).
      Opmerking: De dikte van de corticale segmenten is ruwweg geschat door de omvang van rasters onder een verrekijker Microscoop.
      Opmerking: Anderzijds kunnen de corticale segmenten worden gemaakt met een vibratome onder steriele omstandigheden.
   5. Breng een paar corticale segmenten op het membraan invoegen met een disposable plastic pipet.
   6. Aanpassen van de posities van de segmenten in de buurt van het centrum van het donormateriaal cultuur met een brand-gepolijst Pasteur Pipet (voor meer informatie, Zie^8,13) en verwijder overtollige medium van het inzetstuk.
      Opmerking: Het niveau van het medium iets onder de oppervlakte van de segmenten aanpassen zodat de plakjes een toereikend aanbod van zowel de gas- en middellange kunnen ontvangen. Dit is essentieel voor de levensvatbaarheid van de cellen.
   7. Gedurende de segmenten in het kweekmedium serum-bevattende bij 37 ° C in een omgeving van bevochtigde 95% lucht en 5% CO₂, en cultuur alleen al een dag voordat een thalamus blok is genomen en naast het geplaatst.
4. Voorbereiding van de thalamus blokken
   1. Steriliseren alle chirurgische instrumenten met 70% ethanol gedurende 10 minuten of langer.
   2. Anesthetize een zwangere rat (embryonale dag 15) door intraperitoneale injectie van pentobarbital (50 mg/kg) met verdoving.
   3. Ontleden van elk embryo uit de baarmoeder horens, en plaats de embryo's in een petrischaal met 100 mL koude Hanks evenwichtige zoutoplossing van 100 mm.
   4. Onder een binoculaire loep, verwijderen de hersenen uit elk embryo en snijd thalamus blokken waarin vooral het ventrobasal complex en laterale geniculate nucleus (ongeveer 0.5 mm x 3)⁷ gebruik van microchirurgische schaar (Zie Figuur 1).
5. Cultuur en onderhouden van organotypic cocultures
   1. Met behulp van een pipet van Pasteur, plaats de thalamus blok naast de ventriculaire oppervlak van de corticale segment die in het membraanfilter heeft gebracht.
   2. Het handhaven van de cocultures in het serum-bevattende kweekmedium bij 37 ° C in een klimaat van bevochtigde lucht van 95% en 5% CO₂.
   3. Wisselen van helft van het medium met de serumvrij cultuurmedium na twee dagen in cultuur. Daarna wisselen het medium elke 2-3 dagen.
      Opmerking: Het niveau van het medium moet worden gecontroleerd na de middellange exchange, want het is belangrijk voor de overleving van de cel.

2. Electroporation

Alle procedures worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.

Opmerking: Uitvoeren electroporation één dag na de voorbereiding van de thalamus blokken om te voorkomen dat de onthechting van de blokken.

1. Plasmiden
   1. Maak een mengsel van plasmiden, als volgt: pCAGGS-DsRed 2 μg/l; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      Opmerking: Zuiveren van de beide plasmiden met behulp van een endotoxine-vrije Maxiprep kit en los op in Hanks evenwichtige zoutoplossing.
2. Electroporation apparatuur installatie
   De elektrische instrumenten zoals een stimulator en een isolator moeten worden aangesloten, zoals weergegeven in Figuur 2.
   1. Sluit de stimulator aan de tweefase isolator.
   2. Verbind een elektrode (een zilveren 0.2 mm draaddiameter) met de negatieve aansluitklem van de isolator.
   3. Sluit een elektrode (een zilveren draad 1 mm doorsnede) in serie met een weerstand van 100 Ω en de positieve aansluitklem van de isolator.
   4. De versterker verbinden met de oscilloscoop om te controleren of de elektrische stromen worden doorgegeven via de weerstand door het meten van de spanning met de versterker.
3. Voorbereiding van glas pipetten
   NB: Twee soorten glas pipetten worden gebruikt voor het uitwerpen van de plasmide-oplossing en toepassing van elektrische pulsen.
   1. De pipetten van glas haarvaten met een trekker van de elektrode te maken.
   2. Breken de tip voor de pipet uitwerpen (de tip diameter moet 20-50 μm).
   3. Slijpen en polijsten van het uiteinde van de pipet elektrode met schuurpapier gevolgd door brand-polijsten (de binnendiameter moet 50-200 μm).
      Opmerking: De tip van de elektrode moet vlak en glad, als het rechtstreeks het weefsel raakt.
4. Procedure van electroporation
   1. De ejectie en elektrode pipetten verbinden met de manipulatoren.
   2. Steek een zilver draad (0.2 mm doorsnede) in de pipet elektrode.
   3. De ejectie pipet hechten aan een injectiespuit 1 mL met een plastic buis.
   4. Oppakken > 5 μL van plasmide oplossing in de pipet uitwerpen door spuit afzuigen.
   5. Zet de coculture op het podium electroporation, en de 1 mm diameter elektrode invoegen het kweekmedium.
   6. Plaats de pipet uitwerpen op de thalamus explant.
   7. Duw de spuit handmatig na de tip het oppervlak van de thalamus blok raakt.
      Opmerking: Over 0,5 μL van de plasmide wordt oplossing meestal gebruikt per één blok van de thalamus.
   8. Plaats de pipet elektrode op de thalamus blok onmiddellijk na intrekking van de pipet uitwerpen.
   9. Leveren elektrische pulsen (50-400 μA, 3 tot en met 5 treinen van 200 vierkante pulsen van 1 ms duur bij 200 Hz). Toezicht op de amplitude en het aantal treinen op de oscilloscoop.
      Opmerking: De amplitude van elektrische stromen, is afhankelijk van de binnendiameter van een elektrode Pipetteer¹³.
   10. Intrekken van de elektrode pipet en terugkeren van de schotel naar de incubator.
5. Microscopische waarneming
   1. Zet de schotel cultuur op een microscopische fase van een rechtop confocal microscoop uitgerust met twee filter sets voor EGFP (excitatie, 488 nm, emissie, 515 nm) en DsRed (excitatie, 514 nm, emissie, 565 nm).
   2. Neem beelden van 10-25 optische secties op 1-7 µm-stap maten met een 20 X lang-werkende afstand objectief. Selecteer individueel te onderscheiden gelabelde axonen die zowel DsRed als SYP-EGFP uitdrukken.
      Opmerking: De geconstateerde oppervlakte bedraagt ongeveer 0.7 x 0,7 mm (1024 x 1024 pixels, oftewel correspondeert, 0.68 μm/pixel).
   3. Elke 24 uur per dag voor dagelijkse imaging beelden vastleggen. Vul binnen 10 minuten bij kamertemperatuur en de culturen terug te keren naar de incubator. Voor korte-interval tijd vervallen imaging, houden de cultuur in de kamer van een cultuur, die onderhoudt dat de omgeving van bevochtigde 95% lucht en 5% CO₂ bij 37 ° C.

Resultaten

Het experiment beschreven hier is gericht op het onthullen van de relatie tussen TC axon vertakking en de synapse formatie. Om te visualiseren gelijktijdig axonale trajecten en locaties van exocytose sites, één of een paar thalamus cellen in organotypic cocultures transfected waren met twee plasmiden codering SYP-EGFP en DsRed met behulp van electroporation. Tijdens de tweede week in cultuur, zijn individueel te onderscheiden TC axonen duidelijk gemarkeerd door DsRed (

Discussie

Het huidige protocol is ook een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de ontwikkelingsaspecten van groeiende axonen anders dan van de TC projectie¹¹. Bijvoorbeeld, kunt een combinatie van corticale segment cultuur en de techniek electroporation visualiseren van individuele axonale morfologie van corticale neuronen en lange termijn waarneming^9,18.

Met behulp van het huidige protocol, kunnen de rol van inter...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
Hanks’ balanced salt solution (HBSS)	Nissui	5905
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Scientific	SH30396-03	Hyclone
Insulin	Sigma	I6634
Progesteron	Sigma	P8783
Hydrocortison	Sigma	H0888
Natriumseleniet	Wako Pure Chemical Industries	192-10843
Transferrine	Sigma	T1147
Putrescine	Sigma	P5780
Glucose	Wako Pure Chemical Industries	16806-25
35 mm petrischalen	Falcon	351008
Millicell-CM insert	Millipore	PICMORG50
100 mm petrischalen	BIO-BIK	I-90-20	petrischaal steriiel
HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	K210006
Steriele wegwerp plastic pipetten		202-IS	transfer pipetten sterieel
Glas capillair: OD 1,2 mm	Narishige	G-1.2	binnendiameter, 1,2 mm
Zilverdraad: 0,2 en 1 mm	Nilaco	AG-401265 (diameter, 0,2 mm), AG-401485 (diameter, 1,0 mm)
1 mL spuit	Terumo	SS-01T
Stimulator	A.M.P.I	Master 8
Bifasische isolator	BAK ELECTRONICS	BSI-2
Versterker	A-M Systems	Model 1800
Oscilloscoop	Hitachi	VC-6723
Manipulator	Narishige	SM-15
Micromanipulator	Narishige	MO-10
Stereomicroscoop	Olympus	SZ40
Universele standaard	Olympus	SZ-STU2
Lichtverlichtingssysteem	Olympus	LG-PS2, LG-DI, HLL301
Elektrodetrekker	Narishige	PC-10
Confocale microscoop	Nikon	Digital eclipse C1 laser
x20 objectief	Nikon	ELWD 20x/0.45
Kweekkamer	Tokai Hit	UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rat	Japan SLC and Nihon-Dobutsu
Microchirurgie schaar	Natsume	MB-54-1