Dit protocol beschrijving van het gebruik van gekweekte Aorta-gonaden-Mesonephros voor expressie analyses, kolonie-vormende eenheden in de cultuur en milt, en op lange termijn reconstitutie om te bepalen van het effect van regelgevende factoren en signaalroutes op hematopoietische stamcellen cel ontwikkeling. Dit is aangetoond als een doeltreffend systeem voor het bestuderen van hematopoietische stamcelbiologie en functie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Toepassing van de Aorta-gonaden-mesonephros Explant cultuur System in Developmental Hematopoiesis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De beperking van het gebruik van de muis embryo's voor Haematopoiese studies is de toegevoegde overlast in operaties, die grotendeels te wijten aan de uteriene ontwikkeling van het embryo. Hoewel de genetische gegevens van knock-out (KO) muizen zijn overtuigend, is het niet realistisch voor het genereren van KO muizen voor alle genen zoals nodig. Bovendien uitvoeren in vivo redding experimenten te consolideren van de gegevens die zijn verkregen van KO muizen is niet handig. Deze beperkingen wilt opheffen, werd de Aorta-gonaden-Mesonephros (AVA) explant cultuur ontwikkeld als een passend systeem te bestuderen van hematopoietische stamcellen (HSC) ontwikkeling. Vooral voor redding experimenten, kan het worden gebruikt om te herstellen van de verminderde Haematopoiese in KO muizen. Door toevoeging van de juiste chemische stoffen in het medium, de verminderde signalering kan worden gereactiveerd of trajecten omhoog-geregeld kunnen worden geremd. Met het gebruik van deze methode, vele experimenten kunnen worden uitgevoerd om te identificeren van de kritische toezichthouders van HSC ontwikkeling, met inbegrip van HSC gerelateerde genexpressie bij mRNA en proteïne niveaus, kolonie vorming vermogen en reconstitutie capaciteit. Deze reeks experimenten zou nuttig zijn bij het vaststellen van de onderliggende mechanismen van essentieel belang voor de ontwikkeling van de HSC in zoogdieren.
Inleiding
Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn weefsel-specifieke adulte stamcellen die bezitten multilineage potentieel, met inbegrip van erythroid, myeloïde, en lymfoïde cellen, evenals de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen. Recente studies hebben aangetoond dat de vroegste HSCs voortkwam uit een gespecialiseerde endothelial bevolking, bekend als hemogenic-endotheel (HE), door middel van het endotheel hematopoietische overgang (EHT) bij de ventrale muur van dorsale aorta1,2 ,3,4. Eenmaal gevormd in de aorta-gonaden-mesonephros (AVA) regio van embryonale (E) 10.5 tot E12.5 in het embryo van de muis, zal HSCs migreren in de foetale lever voor uitbreiding en tot slot het koloniseren van het beenmerg om volwassen Haematopoiese gedurende iemands leven 5 , 6. Hoewel dit heeft onderzocht voor vele jaren, de onderliggende mechanismen van HSC opkomst en ontwikkeling blijven onvolledig begrepen.
In tegenstelling tot in vitro bevruchting en ontwikkeling van zebravis embryo's, anticonceptie ontwikkeling van muis embryo's maakt de studie van definitieve Haematopoiese tijdens de embryogenese veel meer lastig. Hoewel genetische experimenten met behulp van knock-out (KO) muizen vaak gebruikt zijn, beperkt het gebrek aan bepaalde KO muizen ook hun gebruik in de hematopoietische onderzoeksveld. Daarnaast worden in vivo redding experimenten niet gemakkelijk uitgevoerd in KO muizen. Sinds 1996, de AGM explant cultuur ontwikkeld voor hematopoietische studies door de pioniers in het veld7. Met de hulp van dit systeem van cultuur, zijn ventrale weefsels van de AVA-regio vastgesteld ter bevordering van HSC activiteit, terwijl de dorsale weefsels oefenen een tegenovergestelde effect8,9. De AVA explant cultuur systeem is ook toegepast voor het vaststellen van de rollen van serotonine, Mpl, SCF, BMP en Hedgehog signalering in HSC ontwikkeling10,11,12,13, 14. nog belangrijker is, het is ook een populaire methode gebruikt om te redden van hematopoietische gebreken in mutant embryo's13,15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
alle procedures met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de beoordeling in het Instituut voor Dierkunde, Chinese Academie van Wetenschappen, Peking, China.
1. materiaal voorbereiding
- Sterilize de 0.65 µm filters met ultraviolet stralen geproduceerd onder de UV lamp op de schone Bank voor 4 h Vleug en de filters omdraaien na de 2 h mark.
Opmerking: Bij het werken met UV-licht, draag gepaste bescherming. - De RVS mazen met de sterilisator autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten steriliseren.
Opmerking: Een bepaalde hoogte van roestvast stalen gaas is nodig ter ondersteuning van de filters op de interface van de lucht-vloeistof en dit kan worden gerealiseerd met de draad op de stalen gaas ( Figuur 1). - Fluoxetine verdunnen om een eindconcentratie van 10 µM in de M5300 op lange termijn cultuur medium en mix gelijkmatig.
Opmerking: Voor een zes-well plaat, 2 mL M5300 op lange termijn kweekmedium is geschikt voor elk putje. Hydrocortison op 10 -6 M selectief kan worden verdund tot de medium. - Overbrengen van het medium aangevuld met Fluoxetine bij 10 µM in zes-Wells-platen of schotels en zet de gesteriliseerde RVS mazen in het medium.
- Wassen de 0.65 µm filters met kokend water twee keer voor 3 minuten telkens in het glas cel cultuur schotel voor sterilisatie. Na elke wassen, brengen de filters fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor 2 minuten en plaats de natte op de roestvrijstalen filtert staande in de lucht-vloeistof-interface netten zoals aangegeven in Figuur 1 A [schematische in het midden].
Opmerking: Kokend water kan gegenereerd worden met de autoclaaf sterilisator te bereiken van de asepsis en apparatuur moet worden onttrokken autoclaaf sterilisator tijdig om te voorkomen dat een afname van de temperatuur.
2. AVA Explant cultuur
- scheiden zorgvuldig de AGM-regio's van de embryo's op E10.5 of E11 met een tang.
- Strippen van de uteruses van zwangere muizen met de ontleden schaar en scheiden van de embryo's van de uteruses.
- Veeg de dooierzak, navelstreng en ingewanden uit het lichaam embryo.
- Verwijder voorzichtig de dorsale zenuw weefsels en omliggende spierweefsels.
- Knippen uit de weefsels met de verlostang op de site van de voorste en achterste ledematen en scheiden de AGM-regio van het lichaam van het embryo. cijfers 1 B-C Toon de schematische weergave en morfologie van ontleed AVA.
- De ontleed AVA's afzonderlijk op de filters op de lucht-liquid interface ( Figuur 1 A) en de cultuur in 5% CO, 2 bij 37 ° C gedurende 2-3 dagen explant.
Opmerking: Plaats de ontleed AVA op de draad van het staal gaas niet en zorg dat de filters op de interface van de lucht-vloeistof tijdens cultuur zijn. Naast de AGM, dooierzak en foetale lever kunnen ook worden gekweekt met dit systeem 7.
3. Expressie Analyses
- mRNA niveau
- verzamelen de gekweekte AVA's in 1 mL PBS samen en centrifugeer bij 4 ° C, 310 x g voor 6 min.
- Na het verwijderen van de bovendrijvende substantie, totaal RNA wordt gewonnen uit de verzamelde AVA's met een monofasische oplossing van fenol, volgens de fabrikant ' s instructies.
- Totaal RNA (2 µg) wordt vervolgens via reverse transcriptie met behulp van M-MLV reverse-transcriptase verkrijgen van cDNA als de sjabloon. De kwantitatieve real-time PCR-tests worden uitgevoerd met SYBR Green en Gapdh wordt gebruikt als de interne controle.
- Eiwit niveau
- de gekweekte AVA verzamelen zoals hierboven beschreven in stap 3.1.1.
- Bereiden de proteïne van de gekweekte AVA met de lysis van de cel buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl en 0,5% NP-40) met proteaseinhibitor en gebruik voor het westelijke bevlekken voor het detecteren van de eiwit-niveau zoals eerder beschreven 13.
4. Kolonie-vormende eenheden in de bepaling van de cultuur (CFU-C)
- na het kweken voor 2-3 dagen, verzamelen de AGM-regio's in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifuge bij 4 ° C, 310 x g voor 6 minuten en distantiëren met 200 µL collagenase (0,1% in PBS) op 37 ° C.
Opmerking: De tijd die nodig is voor collagenase voor het genereren van één cel-schorsingen is ongeveer 20 min. Schudden van de buis met AVA kan elke 5 minuten versnellen het spijsverteringsproces. 200 µL 0,1% collagenase wordt gebruikt voor elke AVA en 200 µL 10% serum wordt gebruikt voor zet de reactie stop. - Cultuur één cel-schorsingen in ultra-lage bijlage 24-Wells-platen medium M3434.
Opmerking: Om besmetting te voorkomen, penicilline-streptomycine oplossing kan worden selectief toegevoegd in het medium. Omdat het M3434 medium visceuze, een 1.0 cc spuit zonder naald wordt gebruikt om te mengen van de cellen en middellange.
Het kweken van - na 7 - 10 dagen bij 37 ° C in 5% CO 2, het nummer voor elk type van kolonies, met inbegrip van Burst die eenheid--erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monocyt (CFU-GM) en CFU-granulocyt, vormen erytrocyt, macrofaag, Megakaryocyt (CFU-GEMM) worden onderscheiden op basis van de morfologie en scoorde met een omgekeerde Microscoop ( Figuur 2 C).
5. In Vivo Kwantitatieve analyse van transplantatie
- kolonie-vormende eenheden-milt (CFU-S) assay
- na 2 - 3 dagen van explant kweken, de AVA's verzamelen en bereiden van één cel-schorsingen door aan het broeden met 200 µL collagenase (0,1% in PBS) voor 20 min.
- Uitvoeren van dodelijke bestraling (9 Gy van x-stralen) van 8 - tot 10 - weken oude mannelijke C57BL/6 muizen 4-5 h vóór cel injectie.
- De bestraalde muis gestoken een afdekking te beperken zijn activiteit.
- Veeg de staart met behulp van een wattenstaafje doordrenkt in 75% alcohol ter bevordering van de ader vasodilatatie.
- Injecteren 0.5 embryo gelijkwaardig (ee) of 1 ee één cel-opschorting van AVA intraveneus in de ader van de staart van bestraalde muis met een spuit cc 1.0.
Opmerking: Cellen worden opgeschort met PBS en 0,5 mL PBS per ontvanger is een geschikt volume. Een naald van 25 meter of 26 gauge grootte wordt gebruikt voor injectie met een 1.0 cc spuit. Geen lucht kan worden ingevoerd in de spuit. Druk op de injectieplaats met een antiseptische doekje om te stoppen met bloeden. - Elf dagen post transplantatie, verzamelen en op te lossen van de milt van de ontvangende muizen in Bouin ' s oplossing (15 mL 1,22% pikrinezuur verzadigd waterige oplossing, 2 mL 40% methanol en 1 mL azijnzuur) voor 1-2 dagen en wassen met 80% alcohol voor een ander 1-2 dagen. Tellen de zichtbare kolonies in de milt macroscopisch en bepalen van het aantal kolonies per ee.
Opmerking: Bouin ' s fixeer, passende bescherming tegen motorslijtage.
- Op lange termijn analyse van transplantatie
- na 2-3 dagen explant kweken, de AVA's verzamelen en bereiden van één cel-schorsingen door met 200 µL collagenase (0,1% in PBS) voor 20 min. aan het broeden
- Uitvoeren van dodelijke bestraling (9 Gy van X-ray) van 8 - tot 10 - weken oude mannelijke C57BL/6 muizen 4-5 uur vóór cel injectie.
- De bestraalde muis gestoken een afdekking te beperken zijn activiteit.
- Veeg de staart met behulp van een wattenstaafje doordrenkt in 75% alcohol ter bevordering van de ader vasodilatatie. < lIk > injecteren 0.5 embryo gelijkwaardig (ee) of 1 ee enkelvoudige cel-schorsingen van AVA intraveneus in de ader van de staart van een bestraalde muis met een 1.0 cc spuit. AVA worden geïnjecteerd in een dosis van 1 ee per ontvanger met 2 × 10-5 beenmergcellen (CD45.1 achtergrond).
- Vier maanden na transplantatie, het beenmerg van de ontvanger verzamelen en gebruiken voor de reconstitutie assay door FACS. Alleen de geadresseerden met ≥ 10% donor afkomstige chimerism worden beschouwd als vertonen succesvolle reconstitutie.
Opmerking: Geen lucht kan worden ingevoerd in de spuit. Druk op de injectieplaats met een antiseptische doekje om te stoppen met bloeden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een recente publicatie gerapporteerd endothelial cel-afgeleide serotonine bevordert het voortbestaan van HSCs door remming van het pro-apoptotic traject in de AVA13. Om te bevestigen het bevorderen van effect van serotonine op HSC ontwikkeling, was Fluoxetine opgenomen. Als een selectieve serotonine re-opname inhibitor (SSRI), heeft Fluoxetine aangetoond dat serotonine opnieuw absorptie in de perifere weefsels16,...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is algemeen bekend dat volwassen HSCs in het beenmerg weer aan de bloed-systeem van bestraalde ontvangers toevoegen kunnen. In tegenstelling tot deze functionele HSCs zijn de nieuwe HSCs in de AVA van muis embryo's onvolwassen. Directe transplantatie resultaten toonden aan dat type ik (VE-CAD-+ CD45- CD41+) en type II (VE-CAD-+ CD45+) pre-HSCs bezitten geen reconstitutie vermogen20. Profiteren van de AVA explant cultuur systeem, de ontluik...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
Wij bedanken Suwei Gao voor hulp bij voorbereiding van de figuur. Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (81530004, 31425016) en het ministerie van wetenschap en technologie van China (2016YFA0100500). J.L. de experimenten uitgevoerd en opgesteld van het manuscript; F.L. bewerkt het manuscript. Beide auteurs lezen en het laatste manuscript goedgekeurd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantitative real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extractie |
| collagenase | Sigma | C2674 | vertering van AGM weefsels |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 muizen | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 muizen | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantatie | |
| fosfaatbuffer oplossing | Life Technologies | 8115284 | AGM Collectie |
| Penicilline-Streptomycine oplossing | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantatie |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantatie |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | vermogen: 30W |
| roestvrijstalen gaas | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | openingsdiameter: 2,5 mm |
| hydrocortison | Sigma | H0396 | selectief verdund in M5300 medium |
Referenties
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784(2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
