Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

Samenvatting

Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.

Samenvatting

De celmembraan extensie repertoire moduleert verschillende kwaadaardige gedrag van kankercellen, met inbegrip van hun potentieel zelfklevende en trekvogels. De mogelijkheid om nauwkeurig te classificeren en te kwantificeren cel extensies en te meten van het effect op van een cel zelfklevende capaciteit is van cruciaal belang om te bepalen hoe cel-signalering gebeurtenissen effect kanker cel gedrag en agressie. Hier beschrijven we de in vitro ontwerp en het gebruik van een cel kwantificering uitbreidingsmethode in combinatie met een hechting capaciteit test in een vastgestelde in vitro model voor adrenocortical carcinoom (ACC). Specifiek, testen we de effecten van DKK3, een vermeende tumor suppressor en een Pro-differentiatie factor, op het membraan extensie fenotype van de ACC cellijn, SW-13. Stellen wij voor deze tests om relatief eenvoudige, betrouwbare en makkelijk interpreteerbaar maatstelsel meet deze kenmerken onder verschillende experimentele omstandigheden.

Inleiding

Dysregulated WNT signalering speelt een cruciale rol in adrenocortical maligniteiten¹. De methoden die worden gebruikt in deze studie onderzoeken of zwijgen van DKK3, een negatieve regulator van de WNT signalering, vertegenwoordigt een dedifferentiation gebeurtenis in de bijnierschors en bevordert de vorming van de tumor in het kader van cel-extensie repertoire wijzigingen. DKK3 is een 38 kDa glycoproteïne met een N-terminal signaal peptide afgescheiden en vorige studies hebben aangetoond dat haar gedwongen meningsuiting in de arrestatie van de celcyclus resulteerde, geremd agressief gedrag van de kwaadaardige en omgekeerd epitheliale-mesenchymale overgang².

Het maligne gedrag van adrenocortical carcinoom (ACC) en andere vormen van kanker is, gedeeltelijk beïnvloed door het vermogen van tumorcellen met de omringende oppervlakken, met inbegrip van de extracellulaire matrix, wat op zijn beurt tumor cel invasie vergemakkelijkt en migratie³. De rol van specifieke celmembraan extensies in de progressie van kanker wordt steeds worden aangetoond in verschillende contexten, vooral via de vorming van filopodia. Bijvoorbeeld, is overexpressie van L-type calcium kanalen gebleken dat induceren filopodia vorming te bevorderen van tumor cel invasie⁴. Ook Fascin, een bindende eiwit minimaal actine uitgedrukt in normale weefsel, is ook overexpressie in kankercellen i.s.m. filopodia formatie⁵. Lobopodia formatie laat niet-maligne fibroblasten effectief migreren door middel van de extra-cellulaire matrix, echter het heeft aangetoond dat fibrosarcoma cellen vertrouwen op metalloproteinase activiteit in plaats van lobopodia te vergemakkelijken van cel migratie en invasie⁶. We hebben aangetoond dat tumor suppressors, met inbegrip van de Ras vereniging domein familie 1 isovorm een (RASSF1A) en DKK3, kan functioneren te veranderen cytoskeletal elementen en bevordering van de vorming van de lamellipodia en invasieve eigenschappen^7,8te belemmeren.

Als zodanig, is het cruciaal voor het karakteriseren van de effecten van genen betrokken bij carcinogenese en hun relatie tot de celmembraan extensie, wijzigingen specifiek beoordeling van filopodia, lobopodia en lamellipodia vorming onder testomstandigheden. Huidige state-of-the art technieken omvatten het gebruik van steeds geavanceerdere Microscopie methodes, fluorescerende labelen en/of complexe algoritmes voor data-acquisitie en interpretatie. Hoewel deze methoden nieuwe en krachtige analytische instrumenten bieden, beperkt hun complexiteit hun wijdverbreid gebruik en aanpassingsvermogen in cel biologie-experimenten. Bovendien, de precieze kwantificering en de observatie van veranderingen in cel extensie morfologie is niet typisch gemeten^9,10. In tegenstelling, introduceren we een techniek hier die nauwkeurig kwantificeert cel extensie wijzigingen met behulp van standaard microscopische technieken en gemakkelijk aanpasbaar in vitro methoden. Deze methoden ook kwantificeren van elk celtype uitbreiding gelijktijdig voor elke cel geanalyseerd en algemene wijzigingen in het celmembraan extensie repertoire vaststellen. Ook laten we zien hoe deze veranderingen kunnen betrekking hebben op de eigenschappen van de hechting van de cel.

Als een experimentele voorbeeld gebruiken we een eerder gemaakte cellijn van SW-13, aangewezen SW-DDK3, die heeft zijn stabiel transfected met pCMV6-post/DKK3 plasmide vectoren en constitutively overexpresses DKK3, een onderscheidende factor in de bijnier. Non-transfected cellen van het SW-13 en SW-13 cellen stabiel transfected met lege vector (pCMV6-Entry), aangewezen SW-Neo, zal dienen als experimentele besturingselementen.

Protocol

1. mobiele extensie kenmerken

1. Handhaven van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 cellen in een standaard bevochtigde incubator bij 37.0 ° C en 5% CO,₂ in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium aangevuld met 10% foetale runderserum en 10.000 U/mL penicilline en streptomycine (uitgeroepen tot 'groeimedium').
   1. Cellen met behulp van een hemocytometer, tellen en plaat 5.000 cellen per putje voor SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 lijnen in aparte 6-Wells-platen en 's nachts groeien in groeimedium op steriele glazen coverslips.
2. Nadat overnachting groei, voor elk putje, gecombineerd het groeimedium, wassen van cellen met 1 mL warme-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en vervolgens het herstellen van de cellen met 1 mL van 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten.
3. Aspirate formaldehyde en vlek cellen in elk putje met 1 mL 0,05% kristalviolet voor 30 min. Wash overmaat kleurstof weg met behulp van drie wasbeurten van 1 mL gedeïoniseerd water.
   Opmerking: Afhankelijk van het niveau van opname van kleurstof, verschillende extra wasbeurten kunnen nodig zijn om achtergrond kleuring ter bevordering van de cel visualisatie te verwijderen.
   1. Met behulp van fijn omver te werpen pincet, ophalen van coverslips en leg hen gezicht naar beneden in een gelabelde glasplaatje met een daling van duidelijke montage reagens.
4. Onder een lichte Microscoop, willekeurig 20 weergave van niet-overlappende cellen te kiezen uit elke dekglaasje aan voor de cel extensie assay.
   1. Neem photomicrographs bij 400 x vergroting van elke gezichtsveld. Direct het aantal elk type extensie voor elk van de 20 representatieve cellen.
      Opmerking: zo 20 geïsoleerde cellen moeten worden onderzocht voor elke geteste voorwaarde om betrouwbare resultaten te waarborgen. Filopodia werden gedefinieerd door cellulaire extensies met een base van 5 micron of minder en een enkele apex. Lobopodia werden gedefinieerd door cellulaire extensies met een basis van 5 tot 20 micron van lengte met extensies met meerdere apices. Lamellipodia werden gedefinieerd door cel extensies die groter zijn dan 20 micron in lengte en met of zonder apices. Afhankelijk van de geteste celtype, de grootte van de cel extensies afwijken en verfijning van de identificatie van de parameters kunnen vereisen.
5. Bepaal het gemiddelde aantal de extensie van elke cel in elk celtype (d.w.z., SW-13, SW-Neo, SW-DDK) over de 6 putten onderzocht.
6. Met behulp van een statistische toets van one-way variantieanalyse (ANOVA), vergelijk verschillen in het gemiddelde percentage van de celmembraan extensies onder de verschillende test celtypes.

2. hechting Assay

1. Handhaven van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 cellen in een standaard bevochtigde incubator bij 37.0 ° C en 5% CO₂ in groeimedium.
   1. Met behulp van een hemocytometer, tellen en plaat 100.000 cellen van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 per putje in aparte 6-Wells-platen en 's nachts groeien in groeimedium.
   2. Zaad 6-Wells-platen voor elk celtype getest, met behulp van één plaat voor elk van de 6 punten van de aangewezen tijd getest onder.
      Opmerking: De tijdstippen kunnen variëren voor verschillende soorten cellen.
2. Na een incubatieperiode van overnachting, cellen met warme PBS keer wassen dan Voeg 0,5 mL 1 x niet-enzymatische cell dissociatie oplossing aan elk putje.
   1. Swirl de plaat om te verspreiden van de cel dissociatie oplossing. Gecombineerd de aangewezen plaat op bepaalde tijdstippen (bijvoorbeeld 1, 2, 3, 5, 10 en 15 min) en daarna wassen met 1 mL warme PBS driemaal.
   2. Tussen de wasbeurten, tik zachtjes op de platen als u wilt loskoppelen van losjes gekoppelde cellen.
3. Gecombineerd eventuele resterende PBS en fix de resterende cellen gekoppeld aan de plaat met 1 mL van 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten.
4. Vlekken van cellen met 1 mL 0,05% kristalviolet voor 30 min dan wassen van overtollige kleurstof weg met 1 mL gedeïoniseerd water. Titreer wassen ter bevordering van de visualisatie van de cel.
   Opmerking: Afhankelijk van het niveau van opname van kleurstof, verschillende extra wasbeurten kunnen nodig zijn ter bevordering van de visualisatie van de cel.
5. Met behulp van een lichte Microscoop op 100 x vergroting, graaf bevestigd de resterende cellen in elk putje voor elke plaat.
   Opmerking: Gebruik van transparante linialen of markering fijne pen gidsen aan de onderzijde van de plaat zal helpen om te voorkomen dat herhaalde tellen van dezelfde cellen.
6. Het gemiddelde aantal gekoppelde cellen per putje voor elke plaat bepaalt.
7. Vergelijk het tarief van onthechting van de cel tussen SW-13, SW-Neo en SW-DDK3 cellen gedurende de bepaalde periode met behulp van een two-way ANOVA statistische toets.

Resultaten

Met behulp van de bovenstaande testen, werden de gevolgen van DKK3 overexpressie voor cel extensie morfologie en eigenschappen van cel adhesie getest in de gevestigde ACC cellijn SW-13, in vitro. Overexpressing van DKK3 cellen werden gegenereerd door stabiel transfecting SW-13 cellen met Myc-DDK tagged pCMV6-post/DKK3 plasmide vectoren en uitgeroepen tot SW-DKK3. Stabiel met lege vector pCMV6-Entry transfected cellen werden op dezelfde manier gemaakt als een transfectie en passag...

Discussie

Hier beschrijven we een in vitro kwantitatieve methode karakteriseren cel extensies met gemak, paar pit-watervallen en betrouwbare reproduceerbaarheid die kan worden toegepast voor de verschillende testomstandigheden. Eenvoudige, kwantificeerbare hechting en/of beweeglijkheid testen kunnen bovendien gelijktijdig worden uitgevoerd om te correleren potentiële functionele betekenis van waargenomen veranderingen in celmembraan extensies.

Deze methoden kunnen echter enkele mogelijke beperk...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Aangevuld met foetaal runderserum en penicilline en streptomycine
Deulbeco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	1X oplossing, direct gebruikt
3,7% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Verdunde stamoplossing
0,05% kristalviolet	Harleco	192-12	Verdunde stamoplossing
De-geïoniseerd water	NA	NA	NA
Microscoop met 400X vergroting	NA	NA	NA
6-well platen	Corning	353046	NA
Celdissociatie-oplossing niet-enzymatische 1X	Sigma-Aldrich	C5914	1X oplossing, direct gebruikt