Een chirurgische methode te beheren van drugs aan het binnenoor van een niet-menselijke primaten, de gemeenschappelijke Hapalomys (Callithrix jacchus), rapporteren we via het membraan van het ronde venster.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een chirurgische ingreep voor de administratie van Drugs aan het binnenoor in een niet-menselijke primaten gemeenschappelijk Hapalomys (Callithrix jacchus)
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoorzitting onderzoek heeft lang bevorderd door knaagdieren modellen, hoewel in sommige ziekten, menselijke symptomen kunnen niet worden gerecapituleerd. De gemeenschappelijke Hapalomys (Callithrix jacchus) is een kleine, gemakkelijk te bedienen Breedneusapen heeft een soortgelijke anatomie van de temporale-bone, met inbegrip van het middenoor ossicular kettingen en binnenoor voor de mens, dan in vergelijking met die van knaagdieren. Hier, wij brengen verslag een reproduceerbare, veilige, en rationele aanpak van chirurgische de niche cochleair ronde venster voor de levering van de drug aan het binnenoor van de gemeenschappelijke Hapalomys. Wij aangenomen posterieure tympanotomy, een procedure die klinisch gebruikt in menselijke chirurgie, om te voorkomen dat manipulatie van het tympanic-membraan die geleidende gehoorverlies kunnen veroorzaken. Deze chirurgische ingreep leiden niet tot een aanzienlijke gehoorverlies. Deze aanpak werd mogelijk dankzij de grote bulla structuur van de gemeenschappelijke Hapalomys, hoewel de laterale semicircular canal en verticale gedeelte van de nervus facialis moeten zorgvuldig worden overwogen. Deze chirurgische methode laat voor het uitvoeren van de veilige en nauwkeurige administratie van drugs zonder verlies van het gehoor, dat van groot belang is bij het verkrijgen van de pre-klinisch bewijs van concept voor translationeel onderzoek.
Inleiding
Sensorineural gehoorverlies (SNHL) komt voornamelijk voort uit schade of gebreken in het slakkenhuis. Voorkomende oorzaken van SNHL zijn veroudering (bijvoorbeeld Presbyacusis), genetische afwijkingen, blootstelling aan lawaai, infectie en ototoxisch geneesmiddelen1. De World Health Organization (WHO) geschat dat meer dan 360 miljoen mensen, 5.3% van de wereldbevolking, lijden verlies2te horen. Ook geschat wordt dat 1 in 900 tot 1 in 2.500 pasgeborenen hebben matige, ernstige en diepe aangeboren permanent gehoorverlies, en ongeveer één op de drie volwassenen ouder dan 65 jaar een zekere mate van gehoor verlies3 hebben. Er is echter geen effectieve klinische behandeling van gehoorverlies voor deze patiënten.
Hoorzitting onderzoek heeft lang is uitgevoerd met behulp van knaagdieren of cavia modellen en vele benaderingen, zoals gentherapie en regeneratieve therapie, zijn voorgesteld als een nieuwe behandeling voor gehoorverlies. Echter, er is een groot verschil tussen mens en knaagdieren in termen van het auditieve systeem, en het is zeer moeilijk te vertalen van diermodellen om de toepassing op de mens. De gemeenschappelijke Hapalomys (C. jacchus), een nieuwe wereld aap die afkomstig zijn uit de Amazone, uitgegroeid tot een aantrekkelijke niet-menselijke primaten model voor diverse basisonderzoek studies om verschillende redenen. Ten eerste, de anatomie en fysiologie zijn meer vergelijkbaar zijn met die van de mens in plaats van knaagdieren. Ten tweede, de biologische basisinformatie over deze soorten, met inbegrip van ziekten, neurale netwerken, het gedrag en het genoom, wordt goed gekenmerkt. Auditieve en vocale verwerking, de corticale codage van de periodiciteit, de vertegenwoordiging van de toonhoogte en de auditieve-vocal interacties van gemeenschappelijke zijdeaapjes geweest ook gemeld4,5,6,7 , 8 , 9 , 10. in recente histologische studies, onderzoekers onderscheidend expressiepatronen van 20 doofheid genen en anion wisselaars in het slakkenhuis van de gemeenschappelijke Hapalomys geïdentificeerd en vonden dat vijf genen die oorzakelijke van progressieve doofheid, en drie zijn anion warmtewisselaars, had verschillende expressiepatronen van die van knaagdieren11,12. Deze profielen leiden ons te geloven dat de gemeenschappelijke Hapalomys een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van de hoorzitting is.
De meest duidelijke kenmerken van de gemeenschappelijke Hapalomys als een proefdieren zijn als volgt:
- Eenvoudige bediening met een kleine lichaamslengte in vergelijking met sommige soorten van de oude wereld apen: volwassen zijdeaapjes weeg 300-400 g en zijn ongeveer 60 cm hoog, die vergelijkbaar met ratten is.
- Zeer reproductieve primate: zijdeaapjes seksuele rijpheid te bereiken op een leeftijd van 18 maanden en kunnen twee keer per jaar dragen en produceren van 4 tot en met 6 nakomelingen jaarlijks.
- Genetische modificaties zijn beschikbaar: Sasaki E et al. geslaagd in het creëren van transgene13 en14 van de knock-out primaten zijdeaapjes via genetische modificaties betrokken bij neurologische aandoeningen (bijvoorbeeld Parkinson de ziekte en de ziekte van Alzheimer).
- Zowel de embryonale stamcellen (ES) en de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) zijn gevestigde15,16. Hoewel het is nogal moeilijk om te houden van hetzelfde aantal zijdeaapjes ten opzichte van knaagdieren, biedt de beschikbaarheid van stamcellen of iPS cellen in vitro testen die minder van in vivo tests vereist.
Om te vergemakkelijken beter translationeel onderzoek op het gebied van doofheid en zijn potentiële therapie, we een imaging studie-protocol met behulp van CT en MRI, algemene anesthesie en hoorzitting tests met behulp van auditieve hersenstam Reacties (ABR's) opgericht. Deze experimentele systemen kunnen ons voorzien van betere kansen voor pre-klinisch bewijs van concept studie die essentieel zijn voor het overbruggen van de kloof tussen knaagdier studies en klinische proeven. Wij rapporteren hier een chirurgische methode te beheren van drugs aan het binnenoor van de gemeenschappelijke Hapalomys via het membraan van het ronde venster. Voor het verkrijgen van een duidelijk zicht rondom het ronde venster zonder het manipuleren van het tympanic-membraan die een geleidende gehoorverlies zou kunnen veroorzaken, is het nuttig om aanpak uit de mastoid holte. Klinisch, hierna deze aanpak, "posterieure tympanotomy" is goed ingeburgerd en meestal gebruikt voor cochleaire implantatie en Cholesteatoom chirurgie. Wij zijn van mening dat posterieure tympanotomy laat ons toe om de nauwkeurige administratie van drugs uitvoeren zonder verlies van het gehoor.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd aan de Jikei Universiteit van Tokio. Dierlijke behandeling en experimentele procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruiken van het Comité van de Jikei-Universiteit (goedkeuring geen: 26-060) en uitgevoerd overeenkomstig de institutionele richtsnoeren voor het gebruik van proefdieren in de Jikei Universiteit, die eens met de richtsnoeren voor goede voeren van dier experimenten van de wetenschap Raad van Japan (2006). Verzorging van de dieren werd uitgevoerd overeenkomstig de aanbevelingen van de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (Instituut van laboratorium dier Resources, 1996).
1. het preoperatieve onderzoek
- Neem een cranial berekend tomografie (CT) scan van dieren (gemeenschappelijk zijdeaapjes) ter vergemakkelijking van de identificatie van individuele anatomische structuren ten minste één maand voor de operatie.
- Een audiometrisch test ten minste één maand voor de operatie uitvoeren.
Opmerking: Hier, we gewend de ABR hoorzitting status controleren. Een positieve elektrode was kort, subcutaan geplaatst op het hoekpunt en een negatieve referentie-elektrode aan de dorsale basis van het oor gestimuleerd. De elektrode grond werd subcutaan geplaatst op het dorsale gedeelte van de nek. 17 , 18 ABR's werden opgeroepen met tone-burst (1.0 ms Toon barsten duur met 0,1 ms stijging en tijd vallen). Het geluidsniveau van het programmawerdteruggebracht vervolgens in 10 dB stappen van zijn maximale amplitude. Op elk geluidsniveau, waren 512 reacties gemiddeld (met stimulans polariteit afgewisseld). ABR drempel werd gedefinieerd als het laagste geluidsdrukniveau (SPL) op die elke golf kon worden opgespoord.
2. anesthesie
- Snelle dieren van de nacht voor de operatie onder algemene verdoving.
- 4% Isofluraan en de lucht op 5-6 mL/min beheren met masker-to-face ventilatie of in een zaal van de inductie voor langzame inductie (figuur 1A). Bevestigen dat het dier niet op de pijnlijke stimuli, zoals het knijpen van de teen reageert.
- Anesthestize gemeenschappelijk zijdeaapjes met intramusculaire injectie (in de femorale spier) uit een combinatie van medetomidine (0,04 mg/kg), midazolam (0,4 mg/kg) en Butorfanol (0,4 mg/kg).
- Subcutaan injecteren van ampicilline (0,08 mg/g) 30 min of meer vóór de huid incisie als een preoperatieve antibioticum.
- Plaats de Hapalomys in de liggende positie met het hoofd naar boven, en het hoofd en de nek uit te breiden. Herstellen van de maxilla aan de tabel met een nylondraad, en trek de tong om een goed beeld te krijgen of een Laryngoscoop gebruiken om te visualiseren van het strotklepje en de toetreding van het strottenhoofd alternatief (figuur 1B).
- Plaats een Endotracheale tube langs het laryngeal oppervlak van het strotklepje.
Opmerking: Het is mogelijk om te gebruiken van een 16-gauge intraveneuze katheter, of 6-Frans meten vultrechter, als een Endotracheale tube (Figuur 1 c). - Controleer de EtCO2 van de Endotracheale tube om te bevestigen dat het goed is zijn geplaatst in de luchtpijp. Nadat de buis heeft zijn geplaatst en respiratoire gas beweging is gecontroleerd, herstellen van de Endotracheale tube van de Hapalomys geconfronteerd met tape.
- Anesthesie tussen 1-3% Isofluraan tijdens de operatie te handhaven.
- Controleren van de SpO2, EtCO2, lichaamstemperatuur en rectale temperatuur tijdens operaties. Voer alle procedures op een verwarmingsmat ter voorkoming van een afname van de lichaamstemperatuur.
3. preoperatieve voorbereiding
- Bereiden de Hapalomys in een liggende positie, en de hellingshoek van het hoofd tot een hoek van 30-45 graden aan de kant van de niet-operatieve (figuur 2A).
- Scheren van de post auricular regio van de operationele kant.
- Desinfecteer het chirurgische gebied met alcohol en Povidon jodium, zowel in de post auricular regio en het externe auditieve kanaal.
- Leg een vel van de chirurgische draperen met een rond gat op de Hapalomys (figuur 2B).
4. chirurgische Procedures
- Injecteren van 1% van lidocaïne hydrochloride (met 1:100,000 epinefrine, 0,1-0,2 mL) subcutaan in de huid incisie site. Maak een incisie in de postauricular huid met een nr.15 ronde-vormige mes.
- Toepassing voor hemostase, druk aan het bloeden gebied met behulp van een gaas gedrenkt in 1:5,000 verdunde epinefrine. Bipolaire cauterisatie is ook effectief (figuur 2C).
- Open het zachte weefsel van de post auricular regio dus dat auricular kraakbeen (c) en post auricular spier (m) kan worden herkend. Bloot het externe auditieve canal bot die diep in het kraakbeen (figuur 3A) zichtbaar moet zijn.
- Om te bevestigen de diepte van het tympanic-membraan, bloot het benige gedeelte van de tympanic velg die kan worden herkend als de hechting van de huid en bot in het diepste deel van de posterieure gehoorgang.
Opmerking: Deze stap stelt ons in staat om te erkennen hoe diep het laterale deel van het middenoor holte is (figuur 3A). - Schil de post auricular spieren (sternocleidomastoideus, musculus splenius capitis spier en posterieure buik van digastric spier) richting de caudal aspect, gescheiden van de temporale-bot. Dan bloot het laterale oppervlak van de temporale-bot (sterretje in figuur 3B).
- Maak een gat van ongeveer 5 mm achter het externe auditieve kanaal met een 1,0 mm diamant Ceulen (Figuur 3 c). Gebruik een boor snelheid van 1.000-8000 rpm Afhankelijk van de boren site.
Opmerking: Een langzame snelheid is voldoende voor delicate manipulatie in de buurt van het semicircular-kanaal of de nervus facialis. Druppelen de zoutoplossing in boren site goed de thermische om letsel te voorkomen. - Het gat vergroten door het boren en bevestig de positie van het horizontale semicircular kanaal (HSC), die naar de mastoid Holte (figuur 3D) uitstulpingen.
- Bevestig de positie van de nervus facialis waarvan het verticale deel anterior van HSC loopt. Boren en verwijder alle de bot septa, als ze bestaan, om het verkrijgen van een duidelijk beeld van het gezicht reces, die gelegen in het midden van het driehoekige gebied tussen de nervus facialis en de chorda-pauken is.
- Maak een klein gaatje door het boren tussen het verticale deel van de nervus facialis en de tympanic rand (sterretje in figuur 4A) met een 0,6 mm diameter diamant bur bij 1000 omwentelingen per minuut.
- Verplaats de bur parallel aan de muur van de achterste kanaal ter voorkoming van schade aan de nervus facialis, die kan worden gezien als een roze lijn die door het verdunde bot. Stop het boren onmiddellijk voordat de zenuw is blootgesteld als een witte lijnstructuur (figuur 4B).
- Zorg ervoor dat de niche van het ronde venster kan worden gevisualiseerd door het gat (figuur 4C). Vervolgens beheren drugs in de niche met een 25-meter of dunnere naald. Om te behouden van drugs in de niche van het ronde venster, plaatst u een viskeuze oplossing op de niche (Figuur 4 d).
- Nadat u hebt bevestigd dat hemostase veilig is gecontroleerd, sluit de lagen (epidermale laag en dermale) met eenvoudige onderbroken hechtdraad met 6-0 absorberend threads.
- Bevestigen van gaas op de chirurgische wond en brengt een pleister.
5. de postoperatieve zorg
- Atipamezole hydrochloride (0,15 mg/kg) intramuscularly beheren in de femorale spier jent medetomidine.
- Als spontane ademhaling begint, verwijdert u de Endotracheale tube.
- Het handhaven van de gemeenschappelijke Hapalomys op een intensive care op 30% O2, 29 ℃ totdat de verdoving slijt af om te voltooien van opwinding.
- Bevestigen dat er geen bevindingen suggestief van vestibulaire dysfunctie zoals nystagmus zijn, en het dier terug naar de fok kooi.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Achterste tympanotomy werd uitgevoerd zonder enige complicaties zoals infectie van chirurgische site, bloeden met vasculaire verwonding of vestibulaire dysfunctie, die soms optreedt met middenoor manipulatie. We posterieure tympanotomy uitgevoerd op de rechter oor van 7-jarige gemeenschappelijk Hapalomys en 1 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing aan de ronde venster niche toegediend. ABR's werden gemeten vóór en twee maanden na de operatie (Figuur 5A-B<...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het volume van de cochleaire bloedstroom is extreem klein, naar schatting in de orde van 1/1000000 van de totale cardiale output bij de mens, en de toegang is beperkt door de aanwezigheid van de bloed-slakkenhuis barrière die het binnenoor van de grote bloedsomloop19 scheidt ,20. Om deze redenen is drugs of virale vector beheer in het binnenoor gunstig, niet via systemische toediening maar door directe administratie. In muizen en cavia experimenten, verschillend...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het werk wordt ondersteund door subsidies M.F. van de Japanse regering MEXT KAKENHI (24592560, 15 H 04991 en 15 K 15624) en de Takeda Science Foundation naar M.F. en de Jikei Universiteit strategische prioriteren onderzoeksfonds te H.J.O.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| common marmoset | CLEA Japan | EDM:C.Marmoset(Jic) | |
| isofluraan | Phizer | ||
| medetomidine | ZENOAQ | ||
| midazolam | astellas | ||
| butorphanol | Meiji Seika | ||
| ampicillin | Meiji Seika | ||
| lidocaïne hydrochloride | AstraZeneca | ||
| 6-0 absorberende draad | ETHICON | RD-1 | |
| atipamezole hydrochloride | ZENOAQ | ||
| fosfaat gebufferde zoutoplossing | Wako | 045-29795 | |
| Surge Wave | Morita | TR-900-OR | |
| Diamond Bar 006 | Morita | 14070057 | |
| Diamond Bar 010 | Morita | 14070081 | |
| intensive care unit | Menix | P-100 |
Referenties
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hear Res. 349, 138-147 (2017).
- World Health Organization. Deafness and hearing loss (Fact sheet N8300). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs300/en/ (2015).
- Thompson, D. C., et al. Universal newborn hearing screening: summary of evidence. JAMA. 286 (16), 2000-2010 (2001).
- Wang, X. Neural coding strategies in auditory cortex. Hear Res. 229 (1-2), 81-93 (2007).
- Wang, X. On cortical coding of vocal communication sounds in primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (22), 11843-11849 (2000).
- Bendor, D., Wang, X. The neuronal representation of pitch in primate auditory cortex. Nature. 436 (7054), 1161-1165 (2005).
- Bendor, D., Wang, X. Neural coding of periodicity in marmoset auditory cortex. J Neurophysiol. 103 (4), 1809-1822 (2010).
- Eliades, S. J., Wang, X. Sensory-motor interaction in the primate auditory cortex during self-initiated vocalizations. J Neurophysiol. 89 (4), 2194-2207 (2003).
- Eliades, S. J., Wang, X. Dynamics of auditory-vocal interaction in monkey auditory cortex. Cereb Cortex. 15 (10), 1510-1523 (2005).
- Eliades, S. J., Wang, X. Neural substrates of vocalization feedback monitoring in primate auditory cortex. Nature. 453 (7198), 1102-1106 (2008).
- Hosoya, M., Fujioka, M., Ogawa, K., Okano, H. Distinct Expression Patterns Of Causative Genes Responsible For Hereditary Progressive Hearing Loss In Non-Human Primate Cochlea. Sci Rep. 6, 22250(2016).
- Hosoya, M., Fujioka, M., Kobayashi, R., Okano, H., Ogawa, K. Overlapping expression of anion exchangers in the cochlea of a non-human primate suggests functional compensation. Neurosci Res. 110, 1-10 (2016).
- Sasaki, E., et al. Generation of transgenic non-human primates with germline transmission. Nature. 459 (7246), 523-527 (2009).
- Sato, K., et al. Generation of a Nonhuman Primate Model of Severe Combined Immunodeficiency Using Highly Efficient Genome Editing. Cell Stem Cell. 19 (1), 127-138 (2016).
- Sasaki, E., et al. Establishment of novel embryonic stem cell lines derived from the common marmoset (Callithrix jacchus). Stem Cells. 23 (9), 1304-1313 (2005).
- Tomioka, I., et al. Generating induced pluripotent stem cells from common marmoset (Callithrix jacchus) fetal liver cells using defined factors, including Lin28. Genes Cells. 15 (9), 959-969 (2010).
- Harada, T., Tokuriki, M. Effects of click intensity and frequency on the brain-stem auditory evoked potentials in the common marmoset (Callithrix jacchus). J Vet Med Sci. 59 (7), 561-567 (1997).
- Harada, T., Tokuriki, M., Tanioka, Y. Age-related changes in the brainstem auditory evoked potentials of the marmoset. Hear Res. 128 (1-2), 119-124 (1999).
- Juhn, S. K., Hunter, B. A., Odland, R. M. Blood-labyrinth barrier and fluid dynamics of the inner ear. Int Tinnitus J. 7 (2), 72-83 (2001).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Res Brain Res Rev. 43 (1), 17-28 (2003).
- Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane. J Vis Exp. (97), (2015).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac. Hum Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The functional and structural outcome of inner ear gene transfer via the vestibular and cochlear fluids in mice. Mol Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Nakagawa, T., et al. Topical insulin-like growth factor 1 treatment using gelatin hydrogels for glucocorticoid-resistant sudden sensorineural hearing loss: a prospective clinical trial. BMC Med. 8, 76(2010).
- Piu, F., et al. OTO-104: a sustained-release dexamethasone hydrogel for the treatment of otic disorders. Otol Neurotol. 32 (1), 171-179 (2011).
- Plontke, S. K., et al. double blind, placebo controlled trial on the safety and efficacy of continuous intratympanic dexamethasone delivered via a round window catheter for severe to profound sudden idiopathic sensorineural hearing loss after failure of systemic therapy. Laryngoscope. 119 (2), 359-369 (2009).
- Wenzel, G. I., Warnecke, A., Stover, T., Lenarz, T. Effects of extracochlear gacyclidine perfusion on tinnitus in humans: a case series. Eur Arch Otorhinolaryngol. 267 (5), 691-699 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
