Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down

Samenvatting

Dit is een tijd - en goedkoop cost-effective in vitro protocol van het onderzoek naar de mechanismen van verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, dat is een zeer onvervulde medische noodzaak in kanker beheer.

Samenvatting

De afgelopen twee decennia hebben gezien een verschuiving van cytotoxische medicatie naar gerichte therapie in de medische oncologie. Hoewel gerichte therapeutische agenten hebben aangetoond indrukwekkender klinische werkzaamheid en geminimaliseerde bijwerkingen dan traditionele behandelingen, is resistentie de belangrijkste beperking op hun uitkeringen geworden. Verschillende preklinische/in vitro/in vivo modellen van verworven resistentie aan gerichte agentia in de klinische praktijk hebben ontwikkeld voornamelijk met behulp van twee strategieën: i) genetische manipulatie voor de modellering van genotypen van verworven resistentie, en ii) in vitro / in vivo selectie van resistente modellen. In het huidige werk stellen wij een verenigende raamwerk, voor het onderzoeken van de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, uitgaande van de generatie van resistente cellulaire subklonen naar de beschrijving van Silencing procedures gebruikt voor het herstellen van de gevoeligheid aan de Inhibitor van de omwenteling. Deze eenvoudige tijd en goedkoop cost-effective benadering is breed inzetbaar en kan gemakkelijk worden uitgebreid voor het onderzoek naar resistentie-mechanismen tot andere drugs gerichte therapeutische in verschillende tumor histotypes.

Inleiding

In aansluiting op de cruciale ontdekkingen in de moleculaire en cellulaire biologie, zijn een aantal nieuwe gesynthetiseerde antikanker moleculen ontwikkeld om te selectief richten oncogene signaalroutes in een breed scala van soorten van de tumor. Met name twee categorieën van gerichte therapeutische agenten met unieke eigenschappen in oncologie, namelijk synthetische chemische verbindingen en recombinant monoclonal antilichamen, bekend is dat hebben bereikt klinische successen en drastisch veranderde kanker zorg in afgelopen decennia^1,2,3.

Niette....

Protocol

Opmerking: Dit protocol is specifiek afgesteld voor de analyse van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verworven resistentie aan trastuzumab van HER-positieve maagkanker cellijnen. Alle laboratoriuminstrumenten die nodig zijn worden gemeld in de Tabel van materialen.

1. generatie van gerichte therapie resistente subklonen

Nota: Dit is de meest kritische en moeilijk te standaardiseren stap in het protocol wijten aan het feit dat verschillende cellijnen verschillende gevoeligheden aan de gerichte therapeutische remmer onafhankelijk van hun histotype of drug-concentratie van de tumor verton....

Resultaten

Figuur 1 schetst het kader van de experimentele procedure. Drie maagkanker-cellijnen uiting van een hoog niveau van HER2 en gevoelig voor trastuzumab (IC₅₀ < piek plasma niveau van drug, figuur 2A, linker grafiek) waren gegroeid in kweekmedium dat de gerichte therapeutische agent. Een dosis 10-fold lager dan de piek plasma concentratie van trastuzumab (10 µg/mL) werd ingesteld als de startdosis, en geleidelijk verhoogd.......

Discussie

Terwijl de persoonlijke en gerichte therapieën hebben ontlokte groeiend enthousiasme, deze zogenaamde 'slimme' therapieën gezicht de dezelfde grote hindernis als traditionele chemotherapie drugs, dat wil zeggen, de snelle en onvoorspelbare verwerving van medicamenteuze resistentie. Ter verbetering van de resultaten van gerichte therapie, moeten-resistentie problemen worden opgelost door middel van een beter begrip van de mechanismen die ze veroorzaken. Hier voorgesteld hebben we een algemeen toegankelijk in .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is een reagens voor het isoleren van hoogwaardige totale RNA of het gelijktijdig isoleren van RNA, DNA en eiwitten uit verschillende biologische monsters
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	De iScript cDNA-synthesekit is een gevoelig en gemakkelijk te gebruiken kit voor de synthese van de eerste streng cDNA voor genexpressieanalyse met behulp van real-time qPCR.
TaqMan gene expressie assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expressie Assays bestaan uit een paar ongelabelde PCR-primers en een TaqMan-sonde met een Applied Biosystems FAM- of VIC-kleurmerker op het 5’-uiteinde en een minor groove binder (MGB) en een niet-fluorescerende quencher (NFQ) op het 3’-uiteinde.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagens is ontworpen om een zeer efficiënte extractie van totaal oplosbaar eiwit uit gekweekte zoogdiercellen te bieden.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) biedt de gemak van één oplossing met volledige bescherming van eiwitmonsters voor cel- en weefsellysaten.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	De Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is een tweecomponenten, hoogprecisie, detergent-compatibele assayreagensset om de totale eiwitconcentratie (A562nm) te meten in vergelijking met een eiwitstandaard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Gebruik 4x Laemmli Sample Buffer voor de bereiding van monsters voor SDS PAGE. Voor reductie van monsters, voegt u een reducerend middel zoals 2-mercaptoethanol toe aan de buffer voorafgaand aan het mengen met het monster.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels hebben een nieuwe formulering en kunnen worden gebruikt voor zowel standaard denaturerende eiwitscheidingen als voor native elektroforese.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards zijn verkrijgbaar in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope en Dual Xtra formaten. Alle vier hebben dezelfde gelmigratiepatronen, met 3 hoge-intensiteitsreferentiebanden (25, 50 en 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is een voorgemengde loopbuffer voor het scheiden van eiwitmonsters door SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs voor snelle, efficiënte overdracht van eiwitten van mini-gels met behulp van het Trans-Blot Turbo Transfer System. Elke vacuümverpakte, gebruiksklare overdrachtspack bevat twee bufferverzadigde ionenreservoirstacks en een voorbevochtigde PVDF-membraan.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugaat voor chemiluminescente of colorimetrische detectie van Precision Plus Protein Unstained Protein Standards of Precision Plus Protein WesternC Protein Standards op western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC oplossing, een methode voor eiwitdetectie, detecteert midden-femtogram hoeveelheden eiwit.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA heeft geen significante sequentie-overeenkomst met muis-, rat- of menselijke gensequenties. De controle is ook getest in cel-gebaseerde screenings en heeft bewezen geen significant effect te hebben op celproliferatie, levensvatbaarheid of morfologie.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is een verbeterd Minimum Essential Medium (MEM) dat een vermindering van de aanvulling met foetaal bovien serum met minstens 50% mogelijk maakt zonder verandering in groeisnelheid of morfologie.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interferentie (RNAi) is de beste manier om effectief genexpressie te onderdrukken om eiwitfunctie te bestuderen in een breed scala van celtypen.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfectiereagens biedt een geavanceerd, efficiënt oplossing voor siRNA-bezorging. Geen ander siRNA-specifiek transfectiereagens biedt zo gemakkelijke en efficiënte siRNA-bezorging in een breed scala aan cellijnen, waaronder gangbare celtypen, stamcellen en primaire cellen, evenals traditioneel moeilijk te transfecteren celtypen.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	werkconcentratie: 1:400 in 5% melkoplossing
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	werkconcentratie: 1:10000 in 5% melkoplossing
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	dit is een remmer van serine proteasen en acetylcholinesterase
Thermocycler voor RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	het zorgt voor temperatuurhomogeniteit en een oprampsnelheid van maximaal 3°C/sec. Het protocol kan ook worden uitgevoerd met andere thermocyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR systeem	Dit is een vijfkleurig platform dat fluorescentie-gebaseerde polymerasekettingreactie (PCR) reagentia gebruikt om een relatieve kwantificering te bieden met behulp van comparatieve CT assay type. Het protocol kan ook worden uitgevoerd met andere thermocyclers
Microvolume Spectrofotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	Het biedt een nauwkeurige en snelle acid nucleid meting met behulp van een kleine hoeveelheid monster
Blotting systeem	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo systeem	Het voert een semi-droge overdracht uit in enkele minuten
Beeldverwervingssysteem en geldocumentatie	Bio-Rad	Chemidoc beeldsysteem	Het is eenvoudig te gebruiken voor