Detectie en verwijdering van de Nuclease besmetting tijdens het zuiveringsproces ongehinderd van recombinante Prototype schuimend Virus Integrase

Samenvatting

Recombinante prototype schuimend virus integrase eiwit is het vaak besmet met een bacteriële nuclease tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. Deze methode nuclease besmetting identificeert en verwijdert het uit de definitieve opstelling van het enzym.

Samenvatting

Het eiwit integrase (IN) van het retrovirus prototype schuimend virus (PFV) is een enzym model voor het bestuderen van het mechanisme van retrovirale integratie. In vergelijking met IN van andere retrovirussen, is PFV IN meer oplosbaar en meer vatbaar voor experimentele manipulatie. Bovendien is de gevoelig voor klinisch relevante humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) IN remmers, suggereren dat het katalytische mechanisme van PFV IN vergelijkbaar met is dat van HIV-1 IN. IN katalyseert de covalente verbinding van virale cDNA (cDNA) naar doel DNA in een proces genaamd strand overdracht. Deze reactie van de overdracht deel introduceert nicks aan het DNA van het doel. Analyse van integratie reactieproducten kan worden verward door de aanwezigheid van nucleasen die ook nick DNA. Een bacteriële nuclease heeft aangetoond dat mede zuiveren met recombinant PFV IN uitgedrukt in Escherichia coli (E. coli). Hier beschrijven we een methode om te isoleren PFV IN van de besmettende nuclease door de chromatografie van de affiniteit van de heparine. Breuken zijn gemakkelijk gescreend nuclease besmetting met een supercoiled plasmide en agarose gel electroforese. PFV IN en de besmettende nuclease weergegeven alternatieve affiniteiten voor heparine sepharose waardoor een nuclease-vrije opstelling van recombinante PFV IN geschikt voor bulk biochemische of één molecuul analyse van integratie.

Inleiding

Biochemische en één molecuul studies eiwitinteractie met DNA vereisen uitzonderlijk zuivere recombinante eiwitten. Contaminerende nucleasen van bacteriën kan onzichtbaar maakt de resultaten van deze tests. Een contaminerende nuclease heeft gevonden in de voorbereidingen van recombinante eiwitten zuurstof scavenger protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) en prototype schuimend virus (PFV) integrase (IN) geïsoleerde van Escherichia coli (E. coli)^{1 , 2 , 3}.

Retrovirale integratie testen is afhankelijk van de conversie van supercoiled DNA naar gejat of lineaire producten als een maatregel van IN activiteit⁴. Tijdens de cellulaire infectie IN sluit zich aan bij de twee uiteinden van een virale cDNA naar de host chromatine⁵. Elk uiteinde toetreding tot reactie heet strand overdracht. Testen van recombinante IN activiteit kan toetreden twee DNA oligomeren nabootsen van virale cDNA eindigt aan een doelDNA in een onderling afgestemde feitelijke integratie reactie^4,5,6,7,8. Als alternatief kunt recombinante IN slechts één DNA einde deelnemen in een niet-fysiologisch relevante halve site integratie reactie^9,10. Wanneer supercoiled plasmide DNA de doelstelling van is integratie, gecoördineerde integratie producten zijn gelineariseerde DNA en halve site integratie producten zijn ontspannen cirkels. Deze reactieproducten worden geïdentificeerd door hun relatieve mobiliteit tijdens agarose gel elektroforese¹. Als de recombinante IN een contaminerende nuclease heeft, zal er valse ontspannen cirkels of een eventueel gelineariseerde plasmide verwarrend de experimentele resultaten. Virale DNA oligomeren kunnen fluorescently worden aangeduid om overtuigend integratie producten, in tegenstelling tot de nuclease producten vast te stellen. Echter, gunsten sterk IN supercoiled DNA doelstellingen; enig verlies van supercoiled plasmide te ontspannen cirkels of lineaire DNA door contaminerende nuclease kan scheeftrekken resultaten en interpretatie van gegevens¹¹. Het is dus absoluut noodzakelijk om bacteriële nucleasen van retrovirale IN preparaten.

PFV IN heeft een verschillende affiniteit voor heparine sepharose ten opzichte van de bacteriële nuclease¹. PFV IN en de nuclease mogen worden gescheiden door een lineaire gradiënt elutie van heparine sepharose. De nuclease is niet gemakkelijk gedetecteerd door een ultraviolet (UV)-absorptie bij 280 nm piek of polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-pagina) voor analytische natrium dodecyl sulfaat. In plaats daarvan wordt de nuclease gedetecteerd door een nuclease activiteit assay met de conversie van een supercoiled plasmide naar ontspannen cirkels of lineaire producten. Elke breuk na heparine sepharose chromatografie is getest voor nuclease activiteit. PFV IN en de nuclease verontreiniging hebben geen verschil in affiniteit voor Mono-Q anion hars. Er is een klein verschil in affiniteit voor Mono-S catie hars. De resolutie van de Mono-S van bacteriële nuclease en PFV IN zou echter niet toestaan dat efficiënte scheiding van de eiwitten. Uiteindelijk, heparine sepharose affiniteit zuivering biedt de beste scheiding van bacteriële nuclease van PFV IN en heeft het voordeel van onbeperkte belasting volume.

Testen voor besmetting van de nuclease activiteit kan worden aangepast aan andere eiwitten. De proteïne van belang zal waarschijnlijk hebben alternatieve affiniteit kenmerken dan PFV IN; het verschil in de kenmerken van de proteïne van belang en de verontreiniging van de nuclease bindend moet empirisch worden bepaald. Deze methodologie voor het identificeren van de nuclease verontreiniging kan worden aangepast aan andere harsen met inbegrip van Mono-S catie of Mono-Q anion uitwisseling harsen. Affiniteit en ionenwisseling harsen kunnen bieden een betrouwbare methode om te isoleren een recombinant proteïne van belang van contaminerende nucleasen met geen limiet op de hoeveelheid eiwit tijdens chromatografie.

Protocol

1. het induceren van PFV IN expressie in E. coli

1. Voeg 1 μL van PFV IN expressie plasmide (10 ng/μl) toe aan 20 μL van E. coli BL21(DE3) pLysS (20 μL hoeveelheid in de handel verkrijgbare cellen heeft > 2 x 10⁶ CFU/μg plasmide) in een 1,5 mL-buis. Meng voorzichtig door de vinger te onttrekken of flicking de buis. Incubeer op ijs 5 min.
   1. Verwarm schok voor precies 30 s in een 42 ˚C water bad en dan onmiddellijk terug naar het ijs gedurende 2 minuten.
   2. Voeg 80 l kamertemperatuur super optimale bouillon met omzettingsproducten onderdrukking (SOC) media. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ˚C met 225 omwentelingen per minuut (rpm) schudden.
   3. Plaat van 25 μl van het mengsel op een 100 x 15 mm petrischaal met 25 mL Luria Bouillon (LB) agar (1 L LB agar: 10 g bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g gistextract, 15 g agar) en 100 μg/mL ampicilline (100 mg/mL stockoplossing).
   4. De resterende 75 μL van de getransformeerde cellen op een tweede identieke plaat plaat. Incubeer de platen met de deksels af overnachting bij 37 ° C.
2. Ophalen van de platen van getransformeerde E. coli. Gebruik een enkele kolonie om te enten van 3 mL LB (1 L LB: 10 g bacto-trypton, 10 g NaCl, 5 g gist extract) aangevuld met 100 μg/mL ampicilline in een ronde bodem van 14 mL polypropyleen cultuur buis. Incubeer gedurende ~ 8 h bij 37 ˚C met 225 rpm schudden.
   1. Voeg de 3 mL van de cultuur tot 50 mL LB aangevuld met 100 μg/mL ampicilline en 34 μg/mL chlooramfenicol (34 mg/mL stockoplossing) in een conische kolf van 250 mL. Incubeer de cultuur 's nachts bij 37 ° C met 225 rpm schudden.
   2. Breng de 53 mL van cultuur 1 L LB, 100 μg/mL ampicilline en 34 μg/mL chlooramfenicol in een conische kolf van 4 L. Incubeer bij 37 ° C met 225 rpm schudden.
   3. Meten van de extinctie op 600 nm (OD₆₀₀) van de cultuur periodiek. Aanvankelijk, Controleer de cultuur OD₆₀₀ elke h. Als de cultuur de gewenste OD_{600 bereikt}, controleren elke 15 min naar niet zijn overwoekeren. De cultuur uitgroeien tot een OD₆₀₀ tussen 0,9 en 1,0. De kolf overbrengen in een ijsbad en swirl ter vermindering van de temperatuur van de cultuur.
3. 1 mL van de cultuur overbrengen in een tube 1,5 mL voor latere analyse door denaturering van SDS-pagina-analyse.
   1. De cellen in de buis 1,5 mL pellet door centrifugeren voor 1 min in een microfuge bij 14.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 150 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door pipetteren. De PBS kan worden met of zonder CaCl₂ en MgCl₂.
   2. Voeg 150 l 2 x SDS-pagina monster buffer (150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 1,2% SDS, 30% glycerol, 15% β-mercaptoethanol (βME), 0,0018% bromophenol blauw) en meng door Pipetteer of vortex. Kook voor 3 min. winkel bij-20 ° C.
4. Toevoegen aan de bacteriecultuur: een eindconcentratie van 0,25 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0,25 M stockoplossing) en 50 μM ZnCl₂ (50 mM stockoplossing). IPTG induceert expressie van het PFV IN gen van de T7 promotor en ZnCl₂ is toegevoegd als een aanvulling voor de juiste vouwen van een amino terminal zink vinger domein in PFV IN. Incubate de cultuur bij 25 ° C met schudden bij 225 t/min voor 4 h. onmiddellijk de kolf overbrengen in een ijsbad. Sla 1 mL van de cultuur voor SDS-pagina-analyse na hetzelfde protocol zoals hierboven in punt 1.3.
5. De bacteriecultuur overbrengen in gepaste afmetingen centrifuge flessen. Bijvoorbeeld, kan een 1 L-cultuur worden overgedragen aan vier steriele wegwerp 250 mL conische bodem polypropyleen flessen. Draaien de flessen in een gekoelde tafelblad centrifuge op 3000 x g gedurende 20 minuten op 4 ˚C. Gooi supernatant door gieten.
   1. Resuspendeer alle van de pellets uit een 1 L-bacteriecultuur in een totaal volume van 25 mL (6,25 mL per fles) koude PBS (met of zonder CaCl₂ en MgCl₂) door pipetteren. Combineer en de bacteriële schorsingen overbrengen in een conische tube van 50 mL. Spin in een gekoelde centrifuge op 3000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant door gieten of pipetteren.
6. Resuspendeer de bacteriële pellet in 10 mL resuspensie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, en 500 μM phenylmethylsulfanoxide (PMSF) proteaseinhibitor) door pipetteren. De pellet module bevriezen door het plaatsen van de buis in een maatkolf van Dewar met vloeibare stikstof voldoende te dompelen de tube van 50 mL. Verwijder voorzichtig de buis van vloeibare stikstof en het opslaan van-80 ° C.
   Opmerking: Bacteriële pellets kunnen worden opgeslagen voor enkele maanden bij-80 ° C. Hebben we geen verlies van actieve eiwit-80 ° C-opslag te volgen voor twee jaar.
7. Analyseer de pre inductie en na inductie monsters door 8,3 cm breed, 7,3 cm hoog, 0,75 mm dik SDS-pagina gels met 1,5 mL 6% polyacrylamide stapelen laag (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% acrylamide, 0,1% SDS, 0,1% ammoniumnitraat persulfate, 0,001% TEMED) en 3,5 mL 10% Polyacrylamide oplossen van laag (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% acrylamide, 0,1% SDS, 0,1% ammoniumnitraat persulfate, 0,001% TEMED)¹².
   1. Invoegen na het gieten van de stapelvolgorde gel, een 10 goed kam. De gel heeft polymeervorm, assembleren de pagina apparaat als voldoende SDS-pagina lopende buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS) toevoegen.
   2. 10 μL van elk monster en 4 μL van prestained eiwit normen laden. Uitvoeren vanaf 16,5 V/cm totdat de kleurstof voorkant de onderkant van de gel, ongeveer 60 min bereikt.
   3. Demonteren van de gel-platen en de gel overbrengen in een kunststof kuip. Voeg Coomassie briljant blauw kleurstofoplossing (0.1% Coomassie briljant blauw R-250, 40% methanol, 10% azijnzuur) te royaal dekken de gel en vlek gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Verwijder de kleurstofoplossing door het gieten en vervangen met destain oplossing (40% methanol, 10% azijnzuur) totdat bands waarneembaar zijn. Verwijder de destaining oplossing door gieten en vervang met gedeïoniseerd water. PFV IN moet gemakkelijk worden geïdentificeerd in het monster na inductie. PFV IN met een hexahistidine-tag heeft een molecuulgewicht van 47374 Da.
   5. Als PFV IN niet zichtbaar is, herhaal de inductie begint met een andere kolonie van één van de platen van de transformatie.

2. de chromatografie van de affiniteit van de nikkel

1. Ontdooi een bacteriële pellet op ijs.
   Opmerking: Dit zal heel wat tijd (ongeveer 2-3 uur) duren. Wanneer de pellet heeft ontdooid aan een cel drijfmest, voeg een extra 500 μM (100 mM stockoplossing) PMSF.
2. Houd de tube 50 mL van bacteriën drijfmest op ijs. Bewerk de bacteriën bij 30% amplitude voor 30 ultrasone trillingen ten s (1 s op 1 s af) per pellet afgeleid van 1 L cultuur met behulp van een ultrasoonapparaat met een 0,5 inch diameter bio hoorn met een diameter van 0,125 inch kegelvormige microtip, een frequentie van 20 kHz en maximaal vermogen van 400 W.
3. Het monster van de cel overbrengen in een koude ultracentrifuge buis. Het gebruik van polycarbonaat fles assemblages (diameter 25 mm, 89 mm hoogte) compatibel is met een Type 60 Ti vaste hoek rotor. Alternatieve buizen en rotoren mogen worden gebruikt indien dezelfde gravitatie kracht is bereikt. Spin 120.000 x g voor 60 min bij 4 ° C. Er moet een duidelijk pellet. Het supernatant kan een gele kleur hebben.
4. Breng het supernatant door gieten of pipetteren aan een conische buis van koude 50 mL. Opmerking het volume; Dit volume moet ongeveer de hoeveelheid resuspensie buffer gebruikt voorafgaand aan module bevriezing. Als het supernatant viskeuze is, kan het worden besmet door bacteriële DNA die de chromatografie-kolom verstoppen kan. In dit geval, herhaal de ultracentrifugatie om de bacteriële DNA pellet.
5. Bereiden van 500 mL Buffer een (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) en 500 mL Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazol).
   Opmerking: In dit protocol, houd het systeem snel eiwit vloeistofchromatografie (FPLC), alle buffers en het monster bij 4 ° C in een koude kamer.
   1. Steriel filter Buffers A en B met 0,2 micrometer wegwerp filter units. Afhankelijk van het FPLC systeem, wassen pomp A en B pomp met A Buffer en Buffer B, respectievelijk. Doorstroming van 90% Buffer A en 10% Buffer B via het systeem totdat de geleidbaarheid en UV lezingen stabiliseren. Het maximale debiet zal afhangen van het instrument; Gebruik een debiet van 5 mL/min met een limiet van de maximale druk van 1.0 MPa.
6. Bereiden van een 110 mm lang, 5 mm diameter FPLC kolom met 1,5 mL nikkel-charged hars (maximale bindingscapaciteit 50 mg/mL, maximale druk van 1 MPa). De kolom kan worden voorbereid op de dag vóór de zuivering en opgeslagen op 4 ˚C.
7. De kolom verbinden met het FPLC-instrument. De kolom met 20 mL 10% Buffer B (20 mM imidazol) bij een snelheid van 0,5 mL/min of 90% Buffer A met een maximale druk limiet van 0,5 MPa equilibreer. Het instrument moet het verzamelen van real-time gegevens van geleidbaarheid en UV-absorptie bij 280 nm (een₂₈₀). De geleidbaarheid en UV lezingen moeten stabiliseren. Als deze lezingen niet hebben gestabiliseerd, blijven buffers van de stroom door de kolom totdat ze stabiel zijn.
8. Laad de eiwitSteekproef (~ 10 mL per pellet) naar de kolom op een debiet van 0,15 mL/min met een limiet van de maximale druk van 0,5 MPa. De waterdruk tarief en kolom ongewijzigd gedurende de zuivering. Het verzamelen van de stroom door in een tube van 50 mL.
   1. Was de kolom met 20 mL 90% Buffer A en 10% Buffer B. verzamelen het wassen in een tube van 50 mL. Elueer de eiwitten met een lineair verloop van 20 mL van 10% tot 100% Buffer B (20 mM tot 200 mM imidazol).
   2. Tot slot was de kolom met 5 mL 100% Buffer B (200 mM imidazol). Verzamelen van de kleurovergang en definitieve wassen in breuken van 0,27 mL.
9. 15 μL van 2 x SDS-pagina monster buffer combineren met 15 μL van de stroom door, wassen en piek A₂₈₀ breuken. Kook de monsters gedurende 3 minuten.
   1. Twee 10% SDS-pagina gels zoals eerder is beschreven in stap 1.6 behalve met 15 goed kammen voor te bereiden. 10 μL van elk monster naar de gels en 4 μL van prestained eiwit normen laden. Uitvoeren, vlekken en analyseren van de gels, zoals beschreven in stap 1.6.
   2. Combineren van breuken die worden weergegeven bevat bijna pure PFV IN gebaseerd op visuele inspectie. Meet het volume door pipetteren, meestal 8-10 mL.
   3. Met een spectrofotometer, de A-₂₈₀ van de gecombineerde breuken meten en berekenen van de totale hoeveelheid PFV IN eiwit; onze typische opbrengst is ~ 10 mg per liter van geïnduceerde cultuur. Het uitsterven prestatiecoëfficiënt PFV IN met de hexahistidine-tag is 59360 cm^-1 M^-1.
10. Schakel de hexahistidine-tag, een aanvulling op de PFV IN met 10 mM dithiothreitol (DTT, 1 M stockoplossing) en 0.1 mM EDTA, pH 8,0 (0.5 M stockoplossing). Voeg 15 μg van menselijke rhinovirus (HRV) 3C protease per mg PFV IN. Incubate 4 ˚C's nachts. Decolleté vermindert het PFV IN moleculaire gewicht van 47374 Da 44394 da en door 10% SDS-pagina-analyse kan worden geverifieerd.

3. de chromatografie van de affiniteit van de heparine

1. Bereiden van 250 mL Buffer C (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF) en 250 mL Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
   Opmerking: In dit protocol, het FPLC systeem, buffers, en steekproef worden bewaard in een koude kamer op 4 ˚C.
   1. Steriel filter Buffers C en D met 0,2 micrometer wegwerp filter units. Afhankelijk van het FPLC systeem, wassen pomp A en B pomp met Buffer C en D van de Buffer, respectievelijk. Stroom 80% Buffer C en 20% Buffer D t/m het systeem totdat de geleidbaarheid en UV lezingen stabiliseren. Het maximale debiet zal afhangen van het instrument; regelmatig gebruiken we een debiet van 5 mL/min met een limiet van de maximale druk van 1.0 MPa.
2. Bereiden een 80 mm lang, 5 mm diameter FPLC kolom met 1 mL van heparine sepharose hars (maximale bindingscapaciteit 2,0 mg van runderen antithrombin III per mL resin; maximale druk 1.4 MPa). De kolom kan worden voorbereid op de dag vóór de zuivering en opgeslagen bij 4 ° C. De kolom verbinden met het FPLC-instrument.
   1. De kolom met 20 mL 80% Buffer C en 20% Buffer D (200 mM NaCl) op een debiet van 0,5 mL/min met een limiet van de maximale druk van 1 MPa equilibreer. Het instrument moet het verzamelen van real-time gegevens van geleidbaarheid en UV-absorptie bij 280 nm (een₂₈₀). De geleidbaarheid en UV lezingen moeten stabiliseren. Als deze lezingen niet hebben gestabiliseerd, blijven buffers van de stroom door de kolom totdat ze stabiel zijn.
3. De concentratie van NaCl van het PFV IN monster tot 200 mM verminderen door toevoeging van 1,5 volumes Buffer C. Bijvoorbeeld, voeg toe 15 mL Buffer C op 10 mL PFV IN. Onze totale volume is meestal ~ 25 mL.
4. Belasting aan de heparine sepharose kolom 0,5 mL/min debiet met maximumdruk verdunde PFV IN monster beperken 1.0 MPa. De waterdruk tarief en kolom ongewijzigd gedurende de zuivering. Het verzamelen van de stroom door in een conische tube van 50 mL.
   1. Was de kolom met 20 mL 80% Buffer C en 20% Buffer D (200 mM NaCl), het verzamelen van het wassen in een conische tube van 50 mL. Elueer de kolom met een lineair verloop van 30 mL van 20% tot 100% Buffer D (200 mM tot 1 M NaCl).
   2. Was de kolom met 5 mL 100% Buffer D. verzamelen het verloop en definitieve wassen in 0,37 mL breuken.
5. Analyseren van lading, stroom door, wassen en breuken met 8% SDS-pagina zoals beschreven in 2.9. PFV IN na de splitsing van de hexahistidine-tag heeft een molecuulgewicht van 44394 Da en de coëfficiënt uitsterven blijft 59360 cm^-1 M^-1 zonder de hexahistidine tag. Bewaren alle breuken op 4 ˚C tot de voltooiing van een test van de nuclease.

4. nuclease assay

1. Identificeren van heparine sepharose breuken die worden weergegeven bevat bijna pure PFV IN. combineren 3 μL van heparine breuk en 50 ng van 3 kb supercoiled plasmide DNA in reactie buffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO₄, 4 μM ZnCl₂ 10 mM DTT) met een eindvolume van 15 μL. Incubeer bij 37 ˚C voor 90 min. opnemen een negatieve controle met geen PFV IN.
   1. Stop de reactie met 1 mg/mL proteïnase K (20 mg/mL stockoplossing) en 0,5% SDS (stockoplossing 10%). Incubeer bij 37 ° C voor 1 h. monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor een latere anayse.
2. Bereiden een 125 mL gel 1% gewicht per volume (w/v) agarose in 1 x TAE buffer (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA) met 0,1 µg/mL ethidium bromide (10 mg/mL stockoplossing)¹³. Smelt de agarose oplossing en giet aan een dienblad van de casting van het gel van 15 x 10 cm. Invoegen van een 15 goed kam met 5 mm breed, 0,75 mm dik wells. Dunne putten levert betere band resolutie ten opzichte van 1,5 mm dikke wells. Laat de gel te stollen bij kamertemperatuur.
   1. Dompel de gel in 1 x TAE met 0,1 µg/mL ethidiumbromide. 3.5 μL van 6 x laden kleurstof (50% glycerol, 0,15% oranje G kleurstof) aan de nuclease assay Reacties toevoegen. Het laden van het gehele volume aan de gel. Stel de gel bij constante spanning, 10 volt per cm (100 V) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of totdat de voorkant van de kleurstof oranje G het einde van de gel bereikt.
3. Direct het imago van de agarose gel met een fluorescerende scanner ingesteld op het detecteren van ethidiumbromide. Lineaire DNA trouw grootte wordt uitgevoerd bij 3 kb, supercoiled DNA moet sneller (~ 2 kb) worden uitgevoerd en ontspannen cirkel DNA moet langzamer (~3.5 kb) worden uitgevoerd.
   1. Met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, het berekenen van het volume van de pixel van de plasmide supercoiled, lineaire en ontspannen cirkel in elke baan. Bel de som van de pixel volumes voor deze drie DNA vormen de "totale DNA" waarde en gebruiken voor het berekenen van het percentage van de lineaire en ontspannen cirkels. Bijvoorbeeld, het volume van de pixel van ontspannen kringen wordt gedeeld door de totale waarde van de pixel van de DNA in dat lane, dit getal te vermenigvuldigen met 100 om te bepalen van een percentage. Breuken die contaminerende nuclease bevatten geeft een hoger percentage van lineaire en ontspannen cirkels in vergelijking met de negatieve controle.
4. Combineren van heparine sepharose breuken die besmettende nuclease activiteit niet weergeven. Dialyze in 10 mm 6-8 kDa molecuulgewicht cutoff (MWCO) dialyse buis bij 4 ° C's nachts tegen 1 L voor 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl₂, 10 mM DTT, 20% glycerol.
5. Herstellen de PFV IN nuclease-vrije steekproef van dialyse buizen. De A-₂₈₀ meten en berekenen van de definitieve eiwitconcentratie. Aliquot en module bevriezen in vloeibare stikstof. Winkel aliquots bij-80 ° C.

Resultaten

Recombinante PFV IN is vaak besmet met een bacteriële nuclease¹. Biochemische integratie testen is afhankelijk van de kwantificatie van de omzetting van supercoiled plasmide DNA naar ontspannen cirkels en lineaire producten. De aanwezigheid van een contaminerende nuclease kan leiden tot valse kwantificatie van deze tests. Uitdrukking van PFV IN met een hexahistidine-tag is geïnduceerd in E. coli (Figuur 1) en eerst gezuiverd door chromatografie van de affinit...

Discussie

Recombinante eiwitten die interactie met DNA, zoals DNA repair eiwitten, zuurstof aaseters voor enkel molecuul microscopie toepassingen of retrovirale integrases, moeten vrij zijn van contaminerende bacteriële nucleasen^2,3. Deze verontreinigingen kunnen verwarren de interpretatie van resultaten tijdens bulk biochemische of één molecuul testen.

We hebben gevonden dat een bacteriële nuclease vaak mede met PFV IN. zuivert PFV IN wordt ech...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
LB bouillon	EMD biosciences	1.10285.0500
Ampicillin	Amresco	0339
Chloramfenicol	Amresco	0230
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
IPTG	Denville Scientific	CI8280
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF	Amresco	0754
Imidazol	Sigma-Aldrich	I0250
DTT	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
MgSO4	Amresco	0662
Agarose	Denville Scientific	CA3510
Ethidiumbromide	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Glycerol	Fisher Scientific	G37-20
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Heparine Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01
HRV14 3C protease	EMD Chemicals	71493-3