Hierin presenteren wij een protocol voor de 3D cultuur van rat hersenen-afgeleide glia cellen, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten en microglia. We tonen primaire celculturen, methacrylated hyaluronzuur (HAMA) hydrogel synthese, HAMAphoto-polymerisatie en cel inkapseling en monster verwerking voor confocale en scanning elektronen microscopische beeldvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Verbeterd 3D Hydrogel culturen van primaire gliacellen voor In Vitro modellering van Neuroinflammation
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In het centrale zenuwstelsel, talrijke acute verwondingen en neurodegeneratieve aandoeningen, zo goed als geïmplanteerde apparaten of biomaterialen ontworpen ter verbetering van het resultaat van de functie in dezelfde uitkomst: overmaat ontsteking leidt tot gliosis, cytotoxiciteit, en/of vorming van een gliale litteken dat collectief schade verergeren of voorkomen van gezond herstel. Met de bedoeling van het creëren van een systeem model gliale litteken vorming en studie inflammatoire processen, hebben we een geschikt voor huisvesting van primaire gekweekte gliacellen 3D cel-steiger gegenereerd: microglia die de reactie van het buitenlandse lichaam reguleren en initiëren de inflammatoire gebeurtenis astrocyten die reageren op een vezelig litteken vormen en oligodendrocyten die meestal kwetsbaar voor inflammatoire letsel zijn. Het huidige werk biedt een gedetailleerde stapsgewijze methode voor de fabricage, cultuur en microscopisch karakterisering van een hyaluronzuur-gebaseerde 3D hydrogel steiger met ingekapselde rat gliale cellen van hersenen-afgeleide. Verder, protocollen voor karakterisering van cel inkapselen en de hydrogel steiger door confocal immunofluorescentie en scanning elektronen microscopie zijn aangetoond, evenals de capaciteit om te wijzigen de steiger met bioactieve substraten, met opneming van een commerciële basale lamina mengsel verbeterde cel integratie.
Inleiding
Ontsteking van het centrale zenuwstelsel (CNS) heeft lang beschouwd als een stempel van acute (b.v., ischemische beroerte, traumatische hersenen en ruggenmerg letsel) en chronische (zoals Alzheimer, Parkinson van en Huntingtons ziekten) CNS letsel, maar wordt steeds meer erkend als een causale bijdrage aan neurodegeneratieve en neuropsychiatrische aandoeningen. Opgelopen of ongepaste ontsteking kan veroorzaken van neurale letsel en demyelinisatie (bv . multiple sclerose), en negatieve invloed hebben op de ontwikkeling van de hersenen (bijvoorbeeld, schizofrenie, autisme) en stemming Staten (bijvoorbeeld, depressie, angst bi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol voor de hersenen weefsel extractie van dag 1 Sprague-Dawley ratten pups, euthanized door onthoofding, werd goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité bij de Universiteit van Alberta.
1. Microglia en Astrocyt isolatie67,68
Opmerking: Alle media voor isolatie en cultuur van de cel is voorverwarmd tot 37 ° C in een waterbad. Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) heeft 1% penicilline-streptomycine (PS). Alle Dulbecco van bewerkt Eagle's media met Ham de F12 nutriënten mengsel (DMEM/F12) wordt aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om het model van de reactie van de gastheer zenuwweefsel en het gliale litteken in een hoge doorvoer, vereist in vitro systeem een 3D cel steiger met een matrix-materiaal dat is biocompatibel, niet een cytotoxische gebeurtenis doet oplopen tijdens in situ vorming en is aanpasbaar met bioactieve componenten bij welwillende reactie. Te dien einde hebben we gemaakt van een 3D cel steiger systeem op basis van hyaluronzuur en een primaire gemengde gliale celpopulatie om te st.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Richting van het doel van het genereren van een 3D cultuur systeem model gliale bioreactivity en het gliale littekens proces, hebben we een systeem dat kan ondersteunen primaire gekweekte microglia, astrocyten en oligodendrocyten en maakt robuuste karakterisering van cel morfologie en cel interacties. Van de microfoto komt te staan, was de morfologie van elk celtype duidelijk verschillend met 2D, 3D-HAMA en 3D HAMA-basale lamina mengsel platforms. In de 2D systeem, morfologie was duidelijk bevooroordeeld langs het vliegt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de NSERC, CFI, AIHS, Alberta gezondheidsdiensten en de Davey Endowment for hersenonderzoek.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1. Materialen voor HAMA-synthese en fotopolymerisatie | |||
| Hyaluronzuur (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1,5 - 1,8 X 10^6 |
| Methacrylzuuranhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Natriumhydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4) tabletten | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidon (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxan (PDMS) Sylgard 184 Siliconen Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxisilyl)propylmethacrylaat | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH-papier (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| 2. Materialen voor gliacellenisolatie en celcultuur | |||
| P1-2 Sprague Dawley rattenpups | Charles River | CD Sprague Dawley rattenstam code 001 | |
| Dissector schaar - slanke bladen (klein) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Chirurgische schaar - Toughcut (groot) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fijne pincetten (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Gebogen fijne pincetten (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's gebalanceerde zout oplossing (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium en Ham's voedingsmengsel F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicilline-streptomycine (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0,25% Trypsin-ethyleen-diaminetetra-azijnzuur (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conische centrifugebuis | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conische centrifugebuis | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 wel Tissuecultuur behandelde platen (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serologische pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serologische pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petrischaal (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petrischaal (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscoop Dekglas (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| 3. Materialen voor microscopie (confocale en rasterelektronenmicroscopie) | |||
| Muis monoklonaal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Konijn anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Kip anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formaline | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Gebufferd (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Paardenserum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Gebufferd (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Gebufferd (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Gebufferd (2%) |
| Hexamethyldilazana (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscoopglas (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
Referenties
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
