Plaats-geleide immobilisatie van bot morfogenetische proteïne 2 op vaste oppervlakken door klik chemie

Samenvatting

Biomaterialen doped met bot morfogenetische eiwit 2 (BMP2) zijn gebruikt als een nieuwe therapeutische strategie om non-adhesie botbreuken genezen. Om te overwinnen bijwerkingen als gevolg van een oncontroleerbare release van de factor, stellen wij voor een nieuwe strategie aan site-direct immobiliseren de factor, waardoor materialen met verbeterde mogelijkheden voor osteogenic.

Samenvatting

Verschillende therapeutische strategieën voor de behandeling van niet-genezende lang bot gebreken zijn intensief onderzocht. Momenteel gebruikt behandelingen aanwezig verschillende beperkingen die hebben geleid tot het gebruik van biomaterialen in combinatie met osteogenic groeifactoren, zoals bot morfogenetische eiwitten (BMP's). Veelgebruikte methoden voor absorptie of inkapseling vereisen supra-fysiologische hoeveelheden BMP2, typisch resulterend in een zogenaamde eerste uitbarsting release effect dat diverse ernstige nadelige bijwerkingen lokt. Covalent het eiwit te koppelen aan het schavot zou een mogelijke strategie om deze problemen te overwinnen. Koppeling, moet bovendien, teneinde een reproduceerbare product resultaat op een specifieke wijze te worden uitgevoerd. Dus we gemaakt een BMP2 variant, waarin een kunstmatige aminozuur (propargyl-L-lysine) werd geïntroduceerd in het volwassen deel van de BMP2 proteïne door codon gebruik expansie (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk werd gekoppeld aan matiemaatschappij kralen door koper gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). De biologische activiteit van de gekoppelde BMP2-K3Plk in vitro werd bewezen, en de osteogenic activiteit van de BMP2-K3Plk-matiemaatschappij parels werd bewezen in cellen gebaseerd. De functionalized kralen in contact met C2C12 cellen konden voor het opwekken van expressie van het alkalisch fosfatase (ALP) in de nabijheid van het lokaal beperkt van de parel. Dus, door deze techniek, matiemaatschappij steigers kunnen worden geproduceerd dat kan leiden tot celdifferentiatie naar een osteogenic afstamming. Bovendien, volstaan lagere BMP2 doses als gevolg van de gecontroleerde oriëntatie van plaats-geleide gekoppelde BMP2. Met deze methode worden de BMP's altijd blootgesteld aan hun receptoren op het celoppervlak in de juiste oriëntatie, die niet het geval is als de factoren zijn gekoppeld via niet-plaats-geleide koppeling technieken. Het resultaat van het product is zeer controleerbaar en dus resultaten in materialen met homogene eigenschappen, verbetering van hun toepasbaarheid voor de reparatie van kritische omvang bot gebreken.

Inleiding

Het uiteindelijke doel van bot weefselregeneratie engineering en bot is het overwinnen van de nadelen en beperkingen die zich voordoen tijdens voorkomende behandelingen van non-adhesie fracturen. Auto - of allo-transplantaties worden voornamelijk gebruikt als huidige therapie strategieën, ook al ze beide verschillende nadelen hebben. De ideale bottransplantatie moet induceren osteogenesis door zowel osteoinduction als osteoconduction, wat leidt tot de osteointegration van de prothese in het bot. Alleen auto-transplantatie wordt tegenwoordig beschouwd als de "gouden standaard" omdat het voorziet alle karakteristieken van een ideale bottransplantatie. Helaas presenteert het ook belangrijke negatieve aspecten, zoals lange chirurgie times, en een tweede trauma site dien meestal meer complicaties (bijvoorbeeldchronische pijn, hematoom formaties, infecties, cosmetische defecten, enz.). Allogene transplantaten, hebben aan de andere kant suboptimaal kenmerken voor alle algemene aspecten¹. Alternatieve bone graft technologieën zijn verbeterd in de afgelopen jaren, met als doel het produceren van steigers die osteo-inductief, osteoconductive, biocompatibel, en bioresorbable. Aangezien veel biomaterialen niet al deze osteogenic kenmerken vertonen, zijn verschillende groeifactoren, voornamelijk BMP2 en BMP7, ter verbetering van het osteogenic potentieel van de bijzondere steiger²opgenomen.

Als een essentieel criterium dienen dergelijke groeifactor levering systemen een release van de gecontroleerde dosis na verloop van tijd ter vergemakkelijking van de essentiële gebeurtenissen zoals cel aanwerving en bijlage, cel ingroei en angiogenese. Echter BMP's evenals andere osteogenic groeifactoren zijn vaak geïmmobiliseerd non-covalent³. Entrapment en adsorptie technieken vereisen het gebruik van supra-fysiologische hoeveelheden eiwit door de vrijval van een eerste uitbarsting, die tot ernstige nadelen in vivo meestal invloed op de omliggende weefsels leidt door het inducerende bot begroeiing, Osteolyse, zwelling en ontsteking⁴. Dus, het behoud van groeifactoren op de site van de levering voor langere perioden kan worden bereikt door covalente immobilisatie methoden. Chemisch gewijzigd BMP2 (succinylated⁵, geacetyleerd⁶ of biotinyleerd⁷) heterodimers⁸ontworpen, of BMP2 afgeleide oligopeptides⁹ zijn ontworpen en gebruikt voor het overwinnen van de beperkingen met betrekking tot absorptie. De bio-activiteit van deze constructies is echter niet voorspelbaar omdat de regeling mogelijk de binding van de geïmmobiliseerdet ligand aan de cellulaire receptoren remt. Als eerder is laten zien is het essentieel dat alle vier receptor ketens die betrokken zijn bij de vorming van complexen van de geactiveerde ligand-receptor interactie met de geïmmobiliseerdet BMP2 om alle downstream signalering cascades¹⁰volledig te activeren.

Om de problemen van een inhomogene product resultaat met beperkingen in termen van topicale, stabiliteit en biologische beschikbaarheid van de geïmmobiliseerdet factor, ontwierpen we een BMP variant kan covalent verbindend steigers in een plaats-geleide manier. Deze variant, aangeduid als BMP2-K3Plk, bestaat uit een kunstmatige aminozuur werd geïntroduceerd door genetische codon uitbreiding¹¹. Deze variant is met succes gekoppeld aan steigers met behulp van een covalente koppeling strategie met behoud van de biologische activiteit.

Protocol

1. de productie van de BMP2 Variant BMP2-K3Plk

1. Klonen van BMP2-K3Plk door plaats-geleide mutagenese met behulp van PCR ¹²
   1. Versterken van menselijke volwassen BMP2 (hmBMP2) van een p25N-hmBMP2-vector (Zie Tabel van materialen) met een voorwaartse primer (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') en een omgekeerde primer (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') invoering van een amber stop codon ( Label) op de positie van de eerste lysine van volwassen deel van de BMP2´s. Uitvoeren van de PCR-reactie met 33.5 µL van H₂O, 10 µL van het PCR reactie mix, 1.5 µL van 10 µM dNTP stockoplossing, 1.5 µL voorste primer (10 pmol/µL), 1.5 µL van omgekeerde primer (10 pmol/µL), 1 µL van p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) , en 1 µL van polymerase van DNA (Zie Tabel van materialen) in een thermische cycler (denaturatie bij 95 ° C gedurende 5 min, 30 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 1 min., gloeien bij 60 ° C gedurende 1 min, rek bij 72 ° C gedurende 1 minuut en een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten).
   2. Zuiveren van het PCR-product met behulp van een commercieel beschikbare kit de aanbevelingen van de fabrikant (Zie Tabel van materialen).
   3. Het PCR-product met de restrictie-enzym NdeI bij 37 ° C gedurende 45 minuten met behulp van 16 µL van H₂O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA verteren (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering van het enzym bij 65 ° C voor 5 min. verteren het PCR-product met de restrictie-enzym BamHI bij 37 ° C gedurende 1 h met gebruikmaking van 16 µL van H₂O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Inactivering van warmte enzym bij 80 ° C gedurende 5 min.
   4. De vector van de pET11a-pyrtRNA met NdeI bij 37 ° C gedurende 2 uur en 45 min met behulp van 16 µL van H₂O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA verteren (20 ng / µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering van 65 ° c voor 5 min. verteren de vector van de pET11a-pyrtRNA met BamHI bij 37 ° C gedurende 1 h met gebruikmaking van 16 µL van H₂O, 3 µL van spijsvertering buffer, 10 µL van DNA (20 ng/µL), en 1 µL van het restrictie-enzym. Warmte-inactivering bij 80 ° C gedurende 5 min.
   5. Scheiden van de verteerd vector van onverteerd vector en resten van de spijsvertering door agarose gel elektroforese (0,8% agarose, 60 min bij 100 V). Het verteerd BMP2-K3TAG insert met verteerd pET11a-pyrtRNA backbone bij kamertemperatuur (RT) voor 2 h met gebruikmaking van 100 afbinden ng van pET11a-pyrtRNA-backbone en 34,5 ng van BMP2-K3TAG insert (1:3 molaire ratio). Het reactiemengsel bevat de ruggengraat van DNA en invoegen, 2 µL van ligase buffer, 1 µL van DNA ligase en H₂O tot een totaal volume van 20 µL.
   6. Voer een co transformatie van pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk en pSRF-duet-pyrtRNAsynth in BL21(DE3) bacteriën:
      1. Voeg 50 ng van elke plasmide aan de bacteriën, plaats het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten, heat shock bij 42 ° C gedurende 50 s, plaats op het ijs gedurende 5 minuten, voeg 500 µL van lysogenie Bouillon (LB) medium in het mengsel, en schud op 300 rpm voor 60 min.
      2. Verspreiden van 100 µL van het bacteriële mengsel op voorverwarmde kanamycine (50 µg/mL) / ampicilline (100 µg/mL) platen, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
2. Meningsuiting en zuivering van BMP2-K3Plk ^{13 , 14}
   1. Propageren een één kolonie overnachting in 50 mL LB voedingsbodem met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline bij 37 ° C.
   2. Verdun overnachting culturen 1:20 in 800 mL van geweldige Bouillon (TB) medium aangevuld met 50 µg/mL kanamycine en 100 µg/mL ampicilline en groeien bij 37 ° C, totdat een OD₆₀₀ van 0,7 is bereikt. Propargyl-L-lysine toevoegen om een eindconcentratie van 10 mM. Een 100 µL monster verzameld uit de cultuur voordat isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie.
   3. Induceren genexpressie door de toevoeging van IPTG aan een eindconcentratie van 1 mM. Het groeien van de cultuur bij 37 ° C gedurende 16 uur in een roteerschudapparaat bij 180 t/min. Verzamelen eenmonstervan 100 µL van de cultuur.
   4. Centrifugeer de hele cultuur bij 9000 x g gedurende 30 min. negeren het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 30 mL TBSE buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA)) met 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (vers toegevoegd).
      Let op: Ingang 2-mercaptoethanol onder de zuurkast. Vermijd contact met huid en ogen. Vermijd inademen van damp of nevel. Alle resuspensie stappen uitvoeren met buffers met 2-mercaptoethanol onder de zuurkast.
   5. Weeg een lege centrifuge bekerglas en overdracht van de geresuspendeerde pellet in het lege bekerglas. Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en wegen van het bekerglas af met de pellet. Het gewicht van het lege bekerglas voor het berekenen van het gewicht van de pellet aftrekken.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het bevriezen van de pellet bij-20 ° C op de korte termijn of bij-80 ° C op de lange termijn. Na het hervatten van het protocol, ontdooien de pellet op RT.
   6. Resuspendeer de pellet in STE buffer (1 mM EDTA, 375 mM sacharose, 10 mM Tris pH 8,0; 150 mM NaCl; 1:1000 (v/v) 2-mercaptoethanol (vers toegevoegd)). 200 mL STE buffer gebruiken voor elke 10 g pellet.
   7. Bewerk ultrasone trillingen ten de opschorting op ijs (10 min met 40 s puls, 20 s rem en 30% amplitude). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet. Herhaal de stappen ultrasoonapparaat en centrifugeren 4 keer.
   8. Resuspendeer de pellet in 100 mL TBS buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weeg pellet.
   9. Resuspendeer de pellet in nuclease buffer (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl₂) met vers toegevoegd 80 U/mL nuclease (bijvoorbeeldBenzonase) met 10 mL/g pellet. Incubeer de schorsing 's nachts op RT op een opzwepende plaat (30 rpm).
   10. Toevoegen van Triton buffer (60 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleenglycol) tot de schorsing. Het volume van Triton buffer toe komt overeen met een 0.5 volume deel van de schorsing. Incubeer gedurende 10 min op RT (niet roeren). Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet.
   11. Resuspendeer de pellet in TE buffer (100 mM Tris, 20 mM EDTA) gebruik 8 mL/g pellet. Centrifugeer bij 6,360 x g gedurende 20 min. negeren het supernatant en weegt de pellet.
   12. Resuspendeer de pellet door toevoeging van 4 mL/g 25 mM NaAc pH 5.0 en 5 mL/g van 6 M GuCl met 1 mM dithiothreitol (DTT) (vers toegevoegd). Incubeer de schorsing 's nachts bij 4 ° C op een opzwepende plaat (30 rpm).
   13. Centrifugeer bij 75.500 x g gedurende 20 min. De bovendrijvende vloeistof bevat nu het ongevouwen monomere BMP2 eiwit. De bovendrijvende vloeistof en concentraat dit extract tot 20 OD/mL met behulp van een membraan 3 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) in een concentratie van de cel (Zie Tabel van materialen) verzamelen.
   14. De geconcentreerde monomeren in enkele druppels toevoegen aan de renaturatie buffer (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 1 mM glutathion-disulfide (GSSG), 2 mM glutathion (GSH)) tijdens het roeren (30 rpm). Incubeer bij RT gedurende 120 h in het donker.
       Opmerking: In deze incubatieperiode, uiteinde ontstaat. De oplossing van deze stap vanaf bevat de gevouwen dimeric BMP2-K3Plk.
   15. Breng de pH van de oplossing naar 3.0 met behulp van geconcentreerd HCl. Dialyze de oplossing tegen 1 mM HCl. concentraat de dialyzed oplossing met behulp van een membraan van 10 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) in een gecentraliseerd cel.
   16. Equilibreer de oplossing door het toevoegen van de buffer een (20 mM NaAc, 30% isopropanol). Het toevoegen van een volume van buffer A overeenkomt met een volume van 30% van de oplossing. Centrifugeer de oplossing bij 4700 x g gedurende 15 minuten.
   17. De kolom voor ionenwisseling op een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem¹⁵ met 150 mL buffer A. Load de eiwit-oplossing op de equilibrated kolom equilibreer. Elueer fracties met behulp van een lineair verloop van buffer B (20 mM NaAc, 30% isopropanol, 2 M NaCl) met behulp van 100 mL buffer B. verzamelen 2 mL breuken.
       Opmerking: Concentreren het eiwit vóór het laden naar de kolom volgens het totaalkolom volume. Het volume van de definitieve eiwit moet < 5% van het totale kolom volume.
   18. Analyseren 20 µL van elke breuk met SDS-Polyacrylamide gel (12%) elektroforese (SDS-PAGE) ¹⁶ en Coomassie briljant blauw kleuring¹⁷ (Zie Tabel van materialen).
       Opmerking: De Coomassie briljant blauw gekleurd SDS-pagina gel toont breuken met Dimeren (26 kDa) en breuken met monomeren (13 kDa).
   19. Zwembad dimeer-bevattende breuken. Dialyze het zwembad van dimeer met breuken 's nachts bij 4 ° C tegen 1 mM HCl (5 liter volume). Het concentreren van het eindproduct met behulp van een 10 kDa concentreren centrifugaal filter eenheid (Zie Tabel van materialen). Analyseren van het eindproduct door SDS-Polyacrylamide (12%) Elektroforese van het gel (SDS-PAGE) en Coomassie briljant blauw kleuring.
       Opmerking: De band op de Coomassie briljant blauw gekleurd SDS-pagina gel slechts één band op 26 kDa moet tonen. Dit is het eindproduct van de BMP2-K3Plk.

2. optimalisatie van koper (I)-gekatalyseerde alkyn-Azide cycloadditie (CuAAC) voorwaarden

1. Effect van natrium ascorbaat (NaAsc) en koper (II) sulfaat (CuSO ₄ ) _{op wild type BMP2 (BMP2-WT)}
   1. Incubeer 20 µM BMP2-WT met verschillende verhoudingen van NaAsc naar CuSO₄. 0,5 mM NaAsc en 0,5 mM CuSO₄ (vanaf concentratie) in een 50 µL volume gebruiken. Ga door met de volgende verhoudingen van NaAsc naar CuSO₄: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), de concentratie van de₄ CuSO constant te houden op 0.5 mM en de concentratie van NaAsc dienovereenkomstig aan te passen. Uitvoeren van de reactie in H₂O op een roterende mixer (20 rpm) 's nachts op RT.
   2. Bereiden van gereduceerde monsters door toevoeging van laden buffer met 5% 2-mercaptoethanol en incubeer monster bij 95 ° C voor 6 min. analyseren verminderd en monsters niet verlaagd door SDS-Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) van het (12%) en Coomassie briljant blauw kleuring. De SDS-pagina gelen gekleurd Coomasie Toon bands in de range van 13 kDa (beperkte voorwaarden) 26 kDa en hoger molecuulgewicht (niet verlaagd voorwaarden).
2. Effect van Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) op de reactie van CuAAC
   1. Incubeer 20 µM BMP2-K3Plk met verschillende verhoudingen van THPTA naar CuSO₄. Gebruik 5 mM NaAsc en 200 µM 3-Azido-7-hydroxycoumarin (Houd NaAsc en 3-Azido-7-hydroxycoumarin constant). Gebruik 50 µM THPTA en 0,5 mM voor CuSO₄ als startende concentraties. Gebruik van verschillende verhoudingen van THPTA naar CuSO₄: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). Voer reactie in H₂O (50 µL totaalvolume) voor 24 h op RT op een roterende mixer (20 rpm).
   2. Bij koppeling wordt 3-Azido-7-hydroxycoumarin een fluorescente kleurstof. Monsters in verminderde en niet verlaagd omstandigheden voor te bereiden en analyseren door SDS-PAGE. Visualiseren van de gels onder de excitatie-kanaal met de specifieke golflengte voor de 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λ_abs = 404 nm; λ_em = 477 nm).

3. covalente koppeling techniek van BMP2-K3Plk naar Azide matiemaatschappij Agarose kralen

1. Incubeer 20 µM van BMP2-K3Plk of BMP2-WT (gebruikt als negatieve controle) met 20 µL van azide-geactiveerde agarose parels in een totaal volume van 500 µL in reactie buffer (0,1 M HEPES pH 7.0, 3.9 M ureum, 50 µM CuSO₄, 250 µM THPTA, 5 mM natrium ascorbaat) voor 2 h op RT op een rotati ng mixer (20 rpm). Zet de reactie stop door toevoeging van 5 mM EDTA (eindconcentratie).
2. Incubeer bij RT gedurende 15 minuten op een roterende mixer (20 rpm). Centrifugeer steekproeven bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT. Collect het supernatant.
3. Spoel de pellet bevattende de bolletjes driemaal met 1.000 µL van HBS₅₀₀ buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), driemaal met 1.000 µL van 4 M MgCl₂, en twee keer met 1.000 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bij elke stap van wassen, centrifugeren bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT en verzamelen supernatant. Winkel gekoppeld kralen in 1000 µL van PBS bij 4 ° C.
   Let op: Niet storen de kraal pellet tijdens het verwijderen van de bovendrijvende substantie.

4. het valideren van de aanwezigheid en de biologische activiteit van geïmmobiliseerdet BMP2-K3Plk met behulp van Texas Red Label BMP Receptor ik een Ectodomain (BMPR-IA _EG )

1. Incubeer 50 µL van de BMP2-K3Plk matiemaatschappij parels met 1 µM van Texas Red Label BMPR-IA_EG met 150 µL van HBS₅₀₀ buffer (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) op RT gedurende 1 uur op een roterende mixer (20 rpm).
2. Centrifugeer de kralen bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT. Discard het supernatant. Wassen van de kralen met 1000 µL van HBS₅₀₀ buffer. Herhaalstap het wassen een extra 3 keer. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 1 minuut op RT na elk wassen stap.
3. Resuspendeer de kralen in 500 µL van PBS en Pipetteer 50 µL op een glasplaatje dekking. De Microscoop filter tussen 561 of 594 nm instellen. Detecteren van Texas Red-BMPR-IA_EG-BMP2-K3Plk matiemaatschappij kralen met behulp van fluorescentie microscopie en nemen foto's.

5. meting van de alkalische fosfatase (ALP) expressie om aan te tonen van de In Vitro topicale van de BMP2-K3Plk geproduceerd vóór en na de Coupling reactie.

1. Alkalische fosfatase (ALP) assay
   1. Cultuur promyoblastic C2C12 cellen (ATCC CRL-172) in Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetale kalf Serum (FCS), 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO₂.
   2. Zaad C2C12 cellen bij een dichtheid van 3 × 10⁴ cellen per putje in een 96-Wells-microplate. Laat cellen koppelen overnachting. Verwijderen van middellange en incubeer C2C12 cellen in aanwezigheid van 0,5-200 nM BMP2-K3Plk of BMP2-WT in 100 µL per putje van DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO₂ voor 72 uur.
   3. Verwijderen van middellange en wassen van cellen met PBS 100 µL per putje. Lyse cellen op RT voor 1 h met 100 µL per putje van lysis buffer (1% NP-40, 0,1 M glycine, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) op een schudden plaat (220 rpm).
   4. Voeg 100 µL per putje van ALP buffer (0,1 M glycine, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1 mM ZnCl₂) met 1 mg/mL p-nitrophenylphosphate (vers toegevoegd) naar de cel lysate.
   5. Meten van de absorptie bij 405 nm in een multiplate lezer na het toevoegen van de ALP-buffer, en elke 5 minuten tot de ontwikkeling van de kleur voltooid is. Genereren van de dosis-respons-curven en EC50-waarden met behulp van een logistieke model, y = A₂ + (A₁-A₂) / (1 + (x/x₀)^p).
2. Alkalische fosfatase (ALP) kleuring
   1. Cultuur promyoblastic C2C12 cellen (ATCC CRL-172) in Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale kalf Serum (FCS), 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO₂.
   2. Zaad C2C12 cellen bij een dichtheid van 3 × 10⁴ cellen per putje in een 96-Wells-microplate. Laat cellen koppelen overnachting. Verwijder van middellange en Voeg 20 µL per putje van BMP2-K3Plk combinatie parels. BMP2-K3Plk combinatie kralen zijn in 1000 µL van een PBS-ophanging.
   3. Bereid een oplossing van 0,4% laag-smeltpunt agarose in DMEM. Smelten in de magnetron (600 W voor 3 min) en laat het afkoelen in een waterbad bij 37 ° C tot gebruik.
   4. Voeg 20 µL van 0,4% laag-smeltpunt agarose in elk putje (bekleding kralen en cellen). Centrifugeer bij 2000 x g gedurende 5 minuten bij 20 ° C. Voeg 80 µL DMEM (2% FCS, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine) en Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer op 5% CO₂ voor 72 uur.
   5. Medium, dat evenwel niet tot het loskoppelen van de gestolde 0,4% agarose verwijderen. Voeg 100 µL per putje van 1-stap NBT/BVIE (Nitro-blauw tetrazolium chloride, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluïdine zout) substraat oplossing.
   6. Analyseren alkalische fosfatase kleuring met behulp van de lichte microscopie, onmiddellijk nadat de paarse kleuring blijkt. Gebruik heldere veld microscopie en fotograferen.

Resultaten

In dit artikel beschrijven we een methode om te koppelen covalent een nieuwe variant van de BMP2, BMP2-K3Plk, aan verkrijgbare azide matiemaatschappij agarose kralen (Figuur 1). De topicale van de geproduceerde BMP2-K3Plk-variant werd gevalideerd door de inductie van alkalische fosfatase (ALP) genexpressie in cellen van de C2C12. De in vitro -test toont vergelijkbare ALP expressie niveaus geïnduceerd door wild type BMP2 (BMP2-WT) en BMP2-K3Plk (

Discussie

Genereren van gecodeerde eiwit varianten door genetische codon expansie kan de invoering van verschillende niet-natuurlijke aminozuur-analogen voornamelijk op elke positie van de primaire eiwit sequentie. In het geval van BMP's zoals BMP2, gemeenschappelijke tags, zoals een 6-Histidine (zijn)-tag kan alleen worden aangebracht N-terminaal, sedert het einde van de protein´s C-terminal is begraven in de tertiaire eiwitstructuur, en dus niet toegankelijk vanaf de buitenkant is. Op andere posities, kan de grootte van de geïnt...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal
1-Step NBT/BCIP	Thermo Fisher	34042	Los oplossing toevoegen aan cellen
3-Azido-7-hydroxycoumarine	BaseClick	BCFA-047-1	Chemisch product dat gebruikt wordt voor click reactie
Agarose met laag smeltpunt	Biozym	840101	Agarose voor ALP assay
Azide agarose kralen	Jena Bioscience	CLK-1038-2	Kralen die gebruikt worden voor reactie
BamHI (Fast Digest enzym)	Thermo Fisher Scientific	FD0054	Restrictie-enzym
BMP receptor IA (BMPR-IAEC)	--	--	Geproduceerd in ons lab
Coomassie Brilliant Blue G-250 kleurstof	Thermo Fisher Scientific	20279	Chemisch product dat gebruikt wordt voor Coomassie Brilliant blue kleuring van SDS PAGE
Koper (II) sulfaat watervrij (CuSO4)	Alfa Aesar	A13986	Chemisch product dat gebruikt wordt voor click reactie
DNA Polymerase en reactiebuffer	Kapabiosystems	KK2102	KAPA HiFi PCR Kit
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX	Gibco	61965-026	Celcultuurmedium
ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	Chemisch product dat gebruikt wordt om click reactie te stoppen
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH	2316.5	Bacteriëninductie (1mM eindconcentratie)
NdeI (Fast Digest enzym)	Thermo Fisher Scientific	ER0581	Restrictie-enzym
NHS-geactiveerde Texas Red	Life technologies	T6134	Gekoppeld aan receptor
P- Nitrofenylfosfaat	Sigma Aldrich GmbH	N4645-1G	Alkaline Fosfatase
p25N-hmBMP2	--	--	Plasmid dat beleefd ter beschikking is gesteld door Walter Sebald aan J. Nickel
pET11a-pyrtRNA	--	--	Beschikbaar gesteld door de leerstoel Farmacie en Biofarmacie, Universiteit Wuerzburg
propargyl-L-lysine (Plk)	--	--	Beschikbaar gesteld door de leerstoel Farmacie en Biofarmacie, Universiteit Wuerzburg
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	--	Beschikbaar gesteld door de leerstoel Farmacie en Biofarmacie, Universiteit Wuerzburg
Qiagen Gel Extractie Kit	Qiagen	28704	Gel zuivering
Qiagen PCR zuiveringskit	Qiagen	28104	PCR Zuivering
Natrium L-ascorbinezuur	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	Chemisch product dat gebruikt wordt voor click reactie
T4 DNA Ligase	ThermoScientific	EL0011	Ligatie
tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)	BaseClick	BCMI-006-100	Chemisch product dat gebruikt wordt voor click reactie
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)fenyl-polyethyleenglycol	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X 100
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur
Amicon concentrerende cel 400 ml	Merck KGaA	UFSC40001	Concentrerende unit
Amicon Ultra-15 Centrifugale Filter Units	Merck KGaA	UFC901024	Concentrerende centrifugale unit
ÄKTA avant FPLC	ÄKTA	--	FPLC machine
Avanti J-26XP	Beckman Coulter	393124	Centrifuge voor bacteriële cultuur
Bacterieel schuddende incubator	Infors HT		Schuddende incubator voor bacteriële cultuur
FluorChem Q systeem	proteinsimple	--	Beeldvormings- en analysesysteem voor SDS-PAGE
Fluorescente microscoop	Keyence	BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M)	Merck KGaA	116882	Ionenuitwisselingschromatografie kolom materiaal
Greiner CELLSTAR® 96 wel platen	Sigma	M5811-40EA	96 wel platen voor celcultuur (ALP Assay)
Heraeus Multifuge X1R	ThermoScientific	--	Centrifuge
M-20 Microplate draaiende emmer rotor	ThermoScientific	75003624	Rotor voor Microcentrifuge voor platen tijdens ALP kleuring
Microcentrifuge - 5417R	Eppendorf	--	Centrifuge
OriginPro 9.1 G	OriginLab	--	software voor statistische analyse van ALP assay data
Polysine Slides	ThermoScientific	10143265	microscope slides
Rotor JA-10	Beckman Coulter	--	rotor voor Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JLA 8.1	Beckman Coulter	--	rotor voor Avanti J-26XP centrifuge
Rotor JA 25.50	Beckman Coulter	--	rotor voor Avanti J-26XP centrifuge
Tecan infinite M200 multiplate reader	Tecan Deutschland GmbH	--	Multiplate reader voor ALP assay
Thermocycler - Labcycler Gradient	SensoQuest GmbH	--	PCR
TxRed - microscoopfilter	Keyence		Filter voor fluorescente microscoop
Ultrafiltratie geregenereerde cellulose discs 3 kDa	Merck KGaA	PLBC04310	gebruikt met amicon concentrerende cel 400ml
Ultrafiltratie geregenereerde cellulose discs 10 kDa	Merck KGaA	PLGC04310	gebruikt met amicon concentrerende cel 400ml