Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn ernstige DNA-beschadigingen. Analyse van de vorming en de reparatie van DSB is relevant in een breed spectrum van onderzoek op gebieden zoals genoom integriteit genotoxiciteit, straling biologie, veroudering, kanker en Geneesmiddelenontwikkeling. In reactie op DSB, is de Histon H2AX phosphorylated op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren vormen discrete nucleaire foci aantoonbaar door immunofluorescentie microscopie. Bovendien is 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een ander belangrijk DSB-responsieve eiwit bevordering van reparatie van DSB door nonhomologous einde-toe te treden terwijl het voorkomen van homologe recombinatie. Volgens de specifieke functies van γH2AX en 53BP1 kunnen de gecombineerde analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie een redelijke benadering voor een gedetailleerde analyse van DSB. Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol, aangevuld met methodische notities voor het uitvoeren van de techniek. Specifiek, blijkt de invloed van de celcyclus op γH2AX foci patronen in normale fibroblasten van de cellijn NHDF. Verder, is de waarde van de γH2AX foci een biomarker teljaren in x-ray bestraald lymfocyten bij een gezonde persoon. Tot slot wordt de genetische instabiliteit in CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie onderzocht door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.
Inleiding
DNA is permanent beschadigd door endogene (bv, replicatie stress, reactieve zuurstof soorten, intrinsieke instabiliteit van DNA) en exogene (bv, chemische radicalen, bestraling) bronnen (Figuur 1)1,2 ,3,4. Onder DNA schade, DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn bijzonder ernstige letsels en kunnen leiden tot celdood of carcinogenese. Ongeveer 50 DSB voordoen per cel en celcyclus5. Bij zoogdiercellen homologe recombinatie (HR) en nonhomologous eind-verbinden (NHEJ) ontwik....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de ethische commissie II van de Mannheim van de medische faculteit van de Universiteit van Heidelberg. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle individuen.
1. voorbereiding van materialen
- antistollingsmiddel stockoplossing: bereiden een anticoagulatie stockoplossing van 200 I.E. heparine per mL in natriumchloride 0,9%. Vul elk van de collectie buizen (tekenen volume 9 mL) met 2 mL van de anticoagulatie stockoplossing vóór terugtrekking van de monsters van bloed of beenmerg.
- Lysis oplossing voor rode bloedcellen: voor....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Analyse van γH2AX foci in cellen is nauwkeurigste in de G0/G1-fase en de G2-fase als γH2AX foci worden weergegeven als verschillende TL stippen (figuur 5A). In tegenstelling, wordt analyse van γH2AX foci in cellen in de S-fase bemoeilijkt door verspreide pan-nucleaire γH2AX spikkels veroorzaakt door het replicatieproces (figuur 5B).
Fixatie van de cellen is uitgevoerd m.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 is een handige methode voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DSB in een breed spectrum van onderzoeksgebieden. Kritische parameters die invloed hebben op de resultaten van de experimenten zijn de fase van de celcyclus, de stoffen die worden gebruikt voor de fixatie en permeabilization van de cellen, de keuze van de antilichamen, en de hardware en software van de fluorescentie Microscoop.
De invloed van de celcyclus op γH2AX fo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het project werd ondersteund door de Duitse José Carreras leukemie Stichting (DJCLS 14 R/2017).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium voor celcultuur |
| Heparine natrium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparine 5.000 I.E. / mL |
| Natriumchloride-oplossing 0,9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component van de anticoagulantia-voorraadoplossing |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium voor isolatie van mononucleaire cellen |
| Trypsine-oplossing 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzym voor dissociatie van fibroblasten in celcultuur |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolatie van CD34+ myeloïde voorlopercellen |
| Diagnostische microscoopglazen | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscoopglazen |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Centrifuge voor op tafel |
| Cytospin-apparaat | |||
| Deksel | Heraeus | 76003422 | Deksel voor werken zonder microbuizen |
| Cyto-container | Heraeus | 75003416 | Cyto-container met 2 conische openingen |
| Klemdrager | Heraeus | 75003414 | Drager voor het vasthouden van een cyto-container en een schuif |
| Ondersteunende inleg | Heraeus | 75003417 | Ondersteunende inleg voor het vasthouden van een klemdrage |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergens voor permeabilisatie van celmembranen |
| Kaliumhydroxide-oplossing 1M | Merck Millipore | 109107 | Noodzakelijk voor het bereiden van de paraformaldehyde-oplossing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixatiemiddel |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Sigma-Aldrich | D8537 | Gebalande zout-oplossing |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blokkeermiddel |
| Monoklonaal anti-γH2AX-antilichaam van muis (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primair antilichaam voor detectie van γH2AX |
| Polyklonaal konijnen anti-53BP1-antilichaam (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primair antilichaam voor detectie van 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-geconjugeerd geiten anti-muis antilichaam | Invitrogen | A-11001 | Secundair antilichaam |
| Alexa Fluor 555-geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam | Invitrogen | A-31572 | Secundair antilichaam |
| Vectashield montagemedium | Vector Laboratories | H-1200 | Bevat DAPI voor kleuring van DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescentiemicroscoop |
| Cool Cube 1 CCD-camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camerasysteem voor digitale opname |
| Isis software | Metasystems | Niet van toepassing | Microscoopsoftware |
Referenties
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
