Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Samenvatting

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Samenvatting

DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn ernstige DNA-beschadigingen. Analyse van de vorming en de reparatie van DSB is relevant in een breed spectrum van onderzoek op gebieden zoals genoom integriteit genotoxiciteit, straling biologie, veroudering, kanker en Geneesmiddelenontwikkeling. In reactie op DSB, is de Histon H2AX phosphorylated op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren vormen discrete nucleaire foci aantoonbaar door immunofluorescentie microscopie. Bovendien is 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een ander belangrijk DSB-responsieve eiwit bevordering van reparatie van DSB door nonhomologous einde-toe te treden terwijl het voorkomen van homologe recombinatie. Volgens de specifieke functies van γH2AX en 53BP1 kunnen de gecombineerde analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie een redelijke benadering voor een gedetailleerde analyse van DSB. Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol, aangevuld met methodische notities voor het uitvoeren van de techniek. Specifiek, blijkt de invloed van de celcyclus op γH2AX foci patronen in normale fibroblasten van de cellijn NHDF. Verder, is de waarde van de γH2AX foci een biomarker teljaren in x-ray bestraald lymfocyten bij een gezonde persoon. Tot slot wordt de genetische instabiliteit in CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie onderzocht door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Inleiding

DNA is permanent beschadigd door endogene (bv, replicatie stress, reactieve zuurstof soorten, intrinsieke instabiliteit van DNA) en exogene (bv, chemische radicalen, bestraling) bronnen (Figuur 1)^{1,2 ,3,4}. Onder DNA schade, DNA dubbele-strand einden (DSB) zijn bijzonder ernstige letsels en kunnen leiden tot celdood of carcinogenese. Ongeveer 50 DSB voordoen per cel en celcyclus⁵. Bij zoogdiercellen homologe recombinatie (HR) en nonhomologous eind-verbinden (NHEJ) ontwikkeld als belangrijke trajecten voor de reparatie van DSB (Figuur 2). HR treedt op in laat S/G2-fase en maakt gebruik van een intact zus chromatide als een sjabloon voor reparatie mogelijk vrij van fouten. Ter vergelijking: NHEJ is actief gedurende de celcyclus en potentieel mutagene zoals basenparen kunnen worden toegevoegd of gereseceerd voordat Afbinding van de gebroken uiteinden. Daarnaast mogen alternatieve einde-toetreding worden gebruikt als een langzame mutagene reparatie van de back-up mechanisme in geval van NHEJ deficiëntie^6,7.

DSB induceren de fosforylering van de Histon H2AX op Serine 139 in een regio van verschillende megabase paren rond elke DSB. De vormende nucleaire foci heten γH2AX foci en door immunofluorescentie microscopie⁸worden opgespoord. ΓH2AX bevordert de aanwerving van verdere DSB-responsieve eiwitten en is betrokken bij de chromatine remodeling, reparatie van DNA en signaaltransductie⁹. Zoals elke γH2AX focus wordt beschouwd als een enkele DSB vertegenwoordigen, is de kwantificering van DSB door immunofluorescentie microscopie het mogelijk, dat is aangetoond in kanker cellijnen en patiënt exemplaren^{10,11, 12 , 13 , 14}. 53BP1 (p53 bindende eiwit 1) is een andere belangrijke eiwit in het bemiddelen van DSB reparatie. Het is betrokken bij de aanwerving van DSB-responsieve eiwitten, checkpoint signalering en de synapsis van DSB uiteinden¹⁵. Daarnaast speelt 53BP1 een cruciale rol bij de keuze van DSB reparatie traject. Er wordt de reparatie van DSB richting NHEJ gegenereerd terwijl HR verhinderd^{16 is}. Gelet op de daadwerkelijke functies van γH2AX en 53BP1 in DSB reparatie, de gelijktijdige analyse van γH2AX en 53BP1 door immunofluorescentie microscopie mogelijk een handige methode voor de nauwkeurige analyse van de vorming en de reparatie van DSB.

Dit manuscript biedt een stapsgewijze protocol voor het uitvoeren van immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 in de celkernen. In het bijzonder wordt de techniek toegepast in normale fibroblasten voor de cellijn NHDF, x-ray bestraald lymfocyten van een gezond individu en CD34 + cellen van een patiënt met acute myeloïde leukemie. De details van de methode zijn gewezen in het kader van de gepresenteerde resultaten.

Protocol

alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de ethische commissie II van de Mannheim van de medische faculteit van de Universiteit van Heidelberg. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle individuen.

1. voorbereiding van materialen

1. antistollingsmiddel stockoplossing: bereiden een anticoagulatie stockoplossing van 200 I.E. heparine per mL in natriumchloride 0,9%. Vul elk van de collectie buizen (tekenen volume 9 mL) met 2 mL van de anticoagulatie stockoplossing vóór terugtrekking van de monsters van bloed of beenmerg.
2. Lysis oplossing voor rode bloedcellen: voorbereiden de 10 x lysis oplossing voor rode bloedcellen met 82.91 g ammoniumchloride, 7.91 g Ammoniumbicarbonaat en 2 mL 0,5 M ethyleendiamminetetra zure oplossing aan een pH van 8.0 door ontbinding van de agenten in tweemaal gedestilleerd water voor een totaal volume van 1 L.
3. Fixatie oplossing: toevoegen 8.3 µL van een 1 M kaliumhydroxide-oplossing voor 360 mg paraformaldehyde (PFA) in een buis van de microtiterplaat. Vul de buis met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot de maatstreep met 1 mL van de buis en warmte de buis in een blok van de verwarming op 95 ° C om 1 mL van een oplossing van de PFA 36%. Breng de 1 mL 36% PFA oplossing over in een buis met een inhoud van 15 mL. 8 mL PBS aan de 1 mL 36% PFA oplossing, om 9 mL van een 4% PFA stockoplossing toevoegen. Aliquot de 4% PFA stockoplossing en winkel bij-18 ° C tot voor fixatie van de cellen gebruiken.
   Let op: 1) kaliumhydroxideoplossing is corrosief. Zich bewust zijn van de bescherming van de ogen en huid. 2) PFA is kankerverwekkend. Vermijd contact met de huid en inhalatie. Bereid de oplossing van de fixatie onder een motorkap.
4. Permeabilization oplossing: toevoegen 50 µL Octoxinol 9 tot en met 50 mL PBS om een oplossing van ongeveer 0,1% Octoxinol 9.
5. Blokkeren oplossing: bereiden van 5% en 2% voor het blokkeren van oplossingen door het mengen van de blokkerende agent van eiwit met PBS en winkel op 6 – 8 ° C.

2. Bereiding van de monsters

1. fibroblasten in celkweek: cultiveren van menselijke fibroblasten voor de cellijn NHDF in een bevochtigde 5% CO ₂ atmosfeer bij 37 ° C in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 4 mM glutamine, en 1% penicilline/streptomycine.
   1. Voorbereiding van een microscoopglaasje met aanhanger fibroblasten
      1. Verwijder het medium van de kolf (75 cm ² groeigebied) met een exponentieel groeiende NHDF fibroblasten. Voeg aan de maatkolf toe 10 mL PBS. Wassen van de aanhangend fibroblasten zachtjes door handmatig schudden de kolf gedurende 1 min.
      2. Verwijder van de PBS en voeg 1 mL trypsine in de kolf. Schud de kolf voorzichtig om ervoor te zorgen dat alle aanhangend cellen trypsine vallen. Verwijder de Trypsine van de kolf. Zet de kolf in de incubator gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
      3. Neem de kolf uit de incubator en voeg 10 mL RPMI 1640 medium in de kolf. Pipetteer van het medium op en neer meerdere malen te verspreiden van de fibroblasten.
      4. Pipetteer 0.3 mL van de verspreide fibroblasten op elk van de twee velden van het microscoopglaasje en zet de dia in de incubator voor 24u zodat de fibroblasten aan de dia houden. Voor immunokleuring van γH2AX en 53BP1 in de kernen van fibroblasten, gaan naar stap 3.1.
2. Patiënt monsters
   1. bloed monsters: gebruik van de collectie buizen die voorheen waren opgevuld met 2 mL van de stockoplossing voor anticoagulatie en voeg 7 mL bloed in de buizen. Bewaar de monsters 's nachts bij kamertemperatuur (d.w.z., 18-20 ° C). De volgende dag, isoleren de G0/G1-fase rusten mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren (stap 2.2.3).
   2. Het beenmerg monsters: gebruik van de collectie buizen die voorheen waren opgevuld met 2 mL van de stockoplossing anticoagulatie (stap 1.1) en 7 mL beenmerg toevoegen in de buizen. Bewaar de monsters 's nachts bij kamertemperatuur (d.w.z., 18-20 ° C). De volgende dag, isoleren de G0/G1-fase rusten mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren (stap 2.2.3). Gebruik CD34 microbeads en cel scheiding kolommen voor de isolatie van de CD34 +-cellen.
   3. Isolatie van mononucleaire cellen door dichtheid kleurovergang centrifugeren
      Opmerking: Mononucleaire cellen zijn geïsoleerd uit bloed en beenmerg monsters door dichtheid kleurovergang centrifugeren ^{17 , 18 , 19}.
      1. Dilute het EDTA bloedmonster in een verhouding van 1:1 met PBS en het beenmerg EDTA monster in een verhouding van 1:3 met PBS. Opschorten van de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet tweemaal.
      Een volume van de kleurovergang medium dichtheid toevoegen
      2. aan een verse buis. Zachtjes laag het verdunde bloed of beenmerg bovenop het verloop medium dichtheid. Wees voorzichtig niet te mengen de twee lagen.
      3. Centrifugeren de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g. tekent de bovenste plasma laag af met de pipet. Vervolgens oogst zorgvuldig de mononucleaire cellen in de laag boven het verloop medium dichtheid. Breng de mononucleaire cellen in een verse buis.
      Ten minste drie volumes van PBS toevoegen
      4. aan de mononucleaire cellen in de buis. Opschorten van de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet twee keer. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g.
      5. Na de spin het supernatant verwijderen en voeg 10 mL van 4 ° C, 1 x lysis oplossing voor rode bloedcellen. Resuspendeer de cellen zachtjes door het tekenen van segmenten in en uit de pipet twee keer, en plaats de buis op ijs gedurende 5 minuten. Klik Voeg toe 30 mL PBS bij 4 ° C en centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g.
   4. Voorbereiding van de cytospins
      1. twee cytospins met mononucleaire cellen van de patiënt monsters (dat wil zeggen, een cytospin voor γH2AX immunofluorescentie kleuring en een cytospin voor γH2AX en 53BP1 voor te bereiden gecombineerd immunofluorescentie kleuring) door middel van centrifugeren (300 x g, 10 min) van 1,0 x 10 ⁵ cellen voor elk preparaat ( Figuur 3 en 4).

3. γH2AX en 53BP1 immunofluorescentie kleuring

1. fixatie en permeabilization: herstellen van de cellen met de 200 µL van 4% PFA gedurende 10 minuten. Na fixatie, wassen de cellen zachtjes driemaal met 30 mL PBS gedurende 5 minuten op een lab-shaker. Dan permeabilize de cellen met 200 µL van 0,1% Octoxinol 9 voor 10 min. Spoel de cellen zachtjes driemaal met 30 mL van blokkerende 5%-oplossing gedurende 5 minuten op een lab-shaker. Blokkeren van de cellen in 30 mL vers 5% blokkeren oplossing voor 1 h.
2. Incubatie met de antilichamen
   1. broeden één preparaat van de cellen met een muis monoklonaal anti-γH2AX antistof (1:500) en de andere voorbereiding van de cellen met een muis monoklonaal anti-γH2AX antistof (1:500) en een Polyclonal konijn van het antilichaam van anti-53BP1 (1:500) 's nachts bij 4 ° C.
   2. Na incubatie wassen de cellen zachtjes 3 keer met 30 mL van blokkerende 2%-oplossing gedurende elke 5 minuten op een lab-shaker.
   3. Verwijderen van de blokkerende oplossing en Incubeer de eerste voorbereiding van de cellen met een Alexa488-geconjugeerde geit anti-muis secundair antilichaam (1:500) en de tweede voorbereiding van de cellen met een Alexa488-geconjugeerde geit anti-muis secundair antilichaam ( 1:500) en een Alexa555-geconjugeerde ezel anti-konijn secundair antilichaam (1:500) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. Montage medium: zet de dia met de cellen in een kom en spoel de cellen zachtjes driemaal met 30 mL PBS voor elke 5 min op een lab-shaker. De PBS verwijderen en monteren van de cellen met montage medium dat 4,6-diamidino-2-phenylindole. Voorzichtig zetten een dekglaasje aan op de top van het montage-medium, zodat er geen luchtbellen zijn ingesloten. Wacht ten minste 3 h voor verharding van het montage-medium voor het analyseren van de cellen door fluorescentie microscopie.

4. Analyse van γH2AX en 53BP1 Foci

1. fluorescentie microscopie: analyseren van de γH2AX en 53BP1 foci in de celkernen met een fluorescentie Microscoop uitgerust met filters voor DAPI, Alexa 488 en Cy3 tijdens beeldvorming op een 100 X-doelstelling vergroting. Beelden met een camera registreren en verwerken van de beelden met passende imagingsoftware.

Resultaten

Analyse van γH2AX foci in cellen is nauwkeurigste in de G0/G1-fase en de G2-fase als γH2AX foci worden weergegeven als verschillende TL stippen (figuur 5A). In tegenstelling, wordt analyse van γH2AX foci in cellen in de S-fase bemoeilijkt door verspreide pan-nucleaire γH2AX spikkels veroorzaakt door het replicatieproces (figuur 5B).

Fixatie van de cellen is uitgevoerd m...

Discussie

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 is een handige methode voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DSB in een breed spectrum van onderzoeksgebieden. Kritische parameters die invloed hebben op de resultaten van de experimenten zijn de fase van de celcyclus, de stoffen die worden gebruikt voor de fixatie en permeabilization van de cellen, de keuze van de antilichamen, en de hardware en software van de fluorescentie Microscoop.

De invloed van de celcyclus op γH2AX fo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI medium	Sigma-Aldrich	R0883	Medium voor celcultuur
Heparine natrium	ratiopharm	PZN 3029843	Heparine 5.000 I.E. / mL
Natriumchloride-oplossing 0,9%	B. Braun	PZN 1957154	Component van de anticoagulantia-voorraadoplossing
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Medium voor isolatie van mononucleaire cellen
Trypsine-oplossing 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzym voor dissociatie van fibroblasten in celcultuur
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Isolatie van CD34+ myeloïde voorlopercellen
Diagnostische microscoopglazen	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Microscoopglazen
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Centrifuge voor op tafel
Cytospin-apparaat
Deksel	Heraeus	76003422	Deksel voor werken zonder microbuizen
Cyto-container	Heraeus	75003416	Cyto-container met 2 conische openingen
Klemdrager	Heraeus	75003414	Drager voor het vasthouden van een cyto-container en een schuif
Ondersteunende inleg	Heraeus	75003417	Ondersteunende inleg voor het vasthouden van een klemdrage
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Detergens voor permeabilisatie van celmembranen
Kaliumhydroxide-oplossing 1M	Merck Millipore	109107	Noodzakelijk voor het bereiden van de paraformaldehyde-oplossing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixatiemiddel
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma-Aldrich	D8537	Gebalande zout-oplossing
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Blokkeermiddel
Monoklonaal anti-γH2AX-antilichaam van muis (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Primair antilichaam voor detectie van γH2AX
Polyklonaal konijnen anti-53BP1-antilichaam (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Primair antilichaam voor detectie van 53BP1
Alexa Fluor 488-geconjugeerd geiten anti-muis antilichaam	Invitrogen	A-11001	Secundair antilichaam
Alexa Fluor 555-geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam	Invitrogen	A-31572	Secundair antilichaam
Vectashield montagemedium	Vector Laboratories	H-1200	Bevat DAPI voor kleuring van DNA
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Fluorescentiemicroscoop
Cool Cube 1 CCD-camera	Metasystems	H-0310-010-MS	Camerasysteem voor digitale opname
Isis software	Metasystems	Niet van toepassing	Microscoopsoftware