Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

8.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56624

⸱

16 maart 2018

 ,  ,  , 
1In Vivo Multifunctional Magnetic Resonance center, Robert C. Byrd Health Sciences Center, West Virginia University, 2Department of Biochemistry, West Virginia University School of Medicine, 3Department of Microbiology, Immunology & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Low-veld (L-band, 1,2 GHz) elektron paramagnetisch resonantie met behulp van oplosbare nitroxyl en trityl sondes is voor beoordeling van fysiologisch belangrijke parameters in de communicatie van de tumor in muismodellen van borstkanker aangetoond.

Samenvatting

Dit protocol demonstreert de mogelijkheden van lage-veld elektron paramagnetisch resonantie (EPR)-op basis van technieken in combinatie met functionele paramagnetisch sondes kwantitatieve informatie te verstrekken over de chemische tumor communicatie (TME), met inbegrip van p O2, pH, redox status, concentraties van interstitiële anorganisch fosfaat (Pi), en intracellulaire glutathion (GSH). In het bijzonder, een toepassing van een onlangs ontwikkelde oplosbare multifunctionele trityl sonde biedt onovertroffen gelegenheid voor in vivo gelijktijdige metingen van pHen pO2 Pi E xtracellular ruimte (hoop sonde). De metingen van drie parameters met behulp van één sonde voorzien in hun correlatie analyse onafhankelijk van de distributie van de sonde en het tijdstip van de metingen.

Inleiding

Een sleutelrol van de TME in de progressie van kanker en therapie is steeds meer gewaardeerd1. Onder belangrijke fysiologische parameters van de TME in stevige tumors, weefsel hypoxie2, acidose3,4, hoge verminderen capaciteit5, verhoogde concentraties van intracellulaire GSH6,7, en interstitiële Pi8 zijn goed gedocumenteerd. Noninvasive in vivo pO2, pH, Pi, GSH en redox evaluaties unieke inzicht verwerven in de biologische processen in TME en voorschot tools voor pre-klinische screening van anti-kanker medicijnen en TME-gerichte therapeutische strategieën helpen. Een redelijke radiofrequentie indringingsdiepte in weefsels door magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en lage-veld EPR gebaseerde technieken maakt ze de meest geschikte benaderingen voor noninvasive beoordeling van deze TME-parameters. MRI berust grotendeels op imaging water protonen en wordt veel gebruikt in de klinische instellingen om anatomische omzetting te leveren maar mist functionele resolutie. De metingen van de fosfor-31 nucleaire magnetische resonantie (31P-NMR) van extracellulaire Pi concentratie en pH op basis van een signaal van endogene fosfaat potentieel aantrekkelijk zijn voor TME karakterisering, maar zijn meestal gemaskeerd door meerdere malen hogere intracellulaire Pi concentraties9,10. In tegenstelling tot dit, EPR metingen gebaseerd op spectroscopie en beeldvorming van speciaal ontworpen paramagnetisch sondes om functionele omzetting te leveren. Opmerking dat exogene EPR sondes een voordeel ten opzichte van exogene hebben NMR sondes te wijten aan de veel hogere intrinsieke gevoeligheid van EPR en afwezigheid van endogene achtergrond EPR signalen. De recente ontwikkeling van een dubbele functie-nitroxyl voor pH en redox sonde11 en multifunctionele trityl sonde12 onovertroffen mogelijkheden biedt voor in vivo gelijktijdige metingen van verschillende TME parameters en hun correlatie analyse onafhankelijke sonde distributie en tijdstip van de meting. Om onze kennis zijn er geen andere methoden beschikbaar voor het gelijktijdig in vivo fysiologisch belangrijke chemische TME parameters in levende onderwerpen, zoals pO2pHe, Pi, redox en GSH te beoordelen.

Sondes voor In Vivo Functionele metingen:

Figuur 1 toont chemische structuren van de paramagnetisch sondes gebruikt voor toegang tot TME parameters, waaronder sondes voor deeltjes en oplosbaar. Hoge functionele gevoeligheid, stabiliteit in levend weefsel, en minimale toxiciteit zijn een paar voordelen waardoor deeltjes sondes over oplosbare sondes voor in vivo EPR oxymetrie de voorkeur. Bijvoorbeeld, zwevende sondes toegenomen retentietijden op de site van weefsel implantaat in vergelijking met oplosbare sondes waardoor longitudinale meting van weefsel pO2 weken. Aan de andere kant, oplosbare sondes deeltjes sondes overtreffen door middel van ruimtelijke-resolved metingen met behulp van EPR gebaseerde beeldvormende technieken evenals waardoor gelijktijdige analyses van veelvoudige functionaliteit (pO2, pH, Pi, redox, en GSH).

figure-introduction-1
Figuur 1. Chemische structuren van de paramagnetisch sondes die TME beoordeling assay monteren. Dit omvat de zwevende pO2 sonde, LiNc-BuO (R = - O (CH2)3CH3), en oplosbaar sondes: dubbele functie pH en redox sonde, NR; GSH-gevoelige sonde, RSSR; en multifunctionele pO2, pH en Pi sonde van de extracellulaire communicatie, de hoop sonde. De synthese van deze sondes is beschreven in de verstrekte referenties 11,12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke werk werd uitgevoerd overeenkomstig het protocol van de WVU IACUC goedgekeurd.

1. sonde synthese en kalibratie

  1. Zwevende pO2-gevoelige LiNc-BuO sonde
    Opmerking: LiNc-BuO microcrystals zijn gesynthetiseerd en bereid zoals beschreven in verwijzing13. Ze zijn zeer stabiel en kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard voor jaren. De EPR linewidth van de LiNc-BuO deeltjes sonde is een pO2-gevoelige parameter. LiNc-BuO microcrystals tonen ideale lineaire afhankelijkheid van de linewidth op de zuurstofconcentratie in het bereik van zuurstofvrije omstandigheden tot 760 mmHg pO2 gedeeltelijke druk13, met de waarden van intrinsieke linewidth bij afwezigheid variërend van zuurstof en de helling van de zuurstof afhankelijkheid (uitgedrukt in mG/mmHg) iets voor verschillende batches instellen van het microcrystal-preparaat. Daarom is kalibratie vereist voor elke specifieke batch.
    1. Weeg 60 mg LiNc-BuO microcrystals.
    2. Voor zuurstof gevoeligheid kalibratie, schorten van microcrystals in 3 mL voor Dulbecco van bewerkt Eagle Media (DMEM) medium (in een concentratie van 20 mg/mL) en bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 min op ijs met een sonde ultrasoonapparaat op 20 kHz met behulp van 7 W kracht in een 5-mL glazen ronde onderkant buis.
    3. Plaats 1 mL van de sonicated microcrystals in een glazen buis in de oppervlakte spoel resonator van de L-band (1,2 GHz) EPR-spectrometer en het verwerven van continu golven (CW) EPR spectra op de fysiologische temperatuur van 37 ° C en zuurstof concentraties van 0, 1, 2, 4, 8 , en 20,9%. Onderhouden van de zuurstofconcentratie door borrelen van de oplossing met gasmengsel verlost van een gas-controller en houden van de temperatuur met behulp van een waterbad gekoppeld aan een thermostaat. Gebruik de volgende EPR spectrometer overname parameters: amplitude modulatie, 100 mG; modulatie frequentie, 100 kHz; sweep breedte, 5 G; vegen van tijd, 60 s.
    4. Om te bereiken van een beter signaal-ruisverhouding (SNR), gebruiken een waarde amplitude modulatie van 60% van de linewidth (b.v.een amplitude modulatie 0.6 G gebruiken voor de linewidth van 1 G).
    5. Alternatief kalibratieprocedure vereenvoudigd: de EPR-spectra in lucht-borrelen en zuurstofvrije oplossingen14opnemen. In het laatste geval handhaven Anoxie in de monsters door de toevoeging van 10 mM glucose en 100 U/mL glucose oxidase tot 1 mL sonde oplossingen volgens referentie14.
    6. Passen de EPR spectra met de Lorentz functie te vinden van de lijndikte, LW. Evalueren van de gevoeligheid van microcrystals tot pO2 als een helling van de afhankelijkheid van LW pO2, namelijk als een waarde van (LWlucht−LWAnoxie) /pO2air, waar LWlucht en LWAnoxie spectra linewidth in lucht- en Anoxie voorwaarden, respectievelijk; p O2air = 152 mmHg.
  2. Dubbele functie pH en redox sonde, NR
    Opmerking: De NR-sonde wordt gesynthetiseerd zoals beschreven in verwijzing11. Het is stabiel bij kamertemperatuur als een solide én in waterige oplossingen. De gesynthetiseerde NR sonde wordt bewaard bij 4 ° C. De splitsing van de hyperfine van de stikstof, eenN, en het signaal amplitude verval tarief zijn de spectrale parameters van de sonde NR die gevoelig voor pH zijn (pKeen sonde = 6,6 bij 37 ° C, bereik van de gevoeligheid van de pH van 5,6 aan 7.6) en voor het reducerend vermogen van de sonde communicatie, respectievelijk.
    1. Verwijder de NR uit de vriezer en laat de container opwarmen tot kamertemperatuur (10-15 min). Weeg 6.34 mg van de NR, los het dan op in 1 mL zoutoplossing en breng de pH op 7,2 met kleine porties van HCl en NaOH met behulp van een pH-meter. Gebruik de bereide NR oplossing (10 mM) als een stamoplossing.
    2. Voer de pH-kalibratie van de sonde NR als volgt (zie referentie11). Voeg eerst 0,1 mL van de stockoplossing van NR 2 mM nb-fosfaat buffer, 150 mM NaCl 0,9 ml. Titreer de oplossing verkregen 1 mM NR met aliquots van HCl en NaOH aan de vereiste pH met behulp van een pH-meter. Controle van de temperatuur met behulp van een waterbad gekoppeld aan een thermostaat.
    3. De EPR spectra van de monsters in 1.5-mL microcentrifuge buizen met behulp van de L-band EPR-spectrometer opnemen. Gebruik de volgende EPR spectrometer overname parameters: amplitude modulatie, 2,5 G; modulatie frequentie, 100 kHz; sweep breedte, 60 G; vegen van tijd, 20 s.
    4. Meten van de hyperfine (eenN) constante splitsen als de helft van de afstand tussen laag - en hoog-veld onderdelen van de EPR-spectra en het plot versus pH, opdat de kalibratiekromme voor L-band EPR metingen van pH.
  3. GSH-gevoelige RSSR sonde
    Opmerking: De RSSR sonde wordt gesynthetiseerd zoals beschreven in verwijzing15. Winkel de gesynthetiseerde NR sonde bij 4 ° C. De lipofiele RSSR disulfide biradical samengestelde diffundeert gemakkelijk tussen de celmembranen te reageren met intracellulaire GSH en biedt een betrouwbare aanpak voor het bepalen van GSH in vivo met behulp van EPR16,17. Deze methode is gebaseerd op de hoge reactiesnelheden van de overheersende intracellulaire pool van GSH thiolen met de RSSR-sonde. De reactie van de RSSR biradical met GSH splitst de disulfide binding (Zie schema 1) wat resulteert in de annulering van spin-uitwisseling tussen de twee radicale fragmenten en manifesteren in een daling van de spectrale componenten van de biradical en overeenkomstige verhoging van de monoradical componenten. Voor de biradical RSSR sonde, het tempo van de toename van de amplitude van de monoradical-component is evenredig aan de GSH-concentratie en is een handige GSH-gevoelige EPR spectrale parameter. Om te beoordelen GSH concentratie van de in vivo EPR metingen, heeft de voorgaande kalibratie van het tarief van de RSSR reactie met GSH de overeenkomstige temperatuur en pH moet als volgt worden uitgevoerd.
    1. Verwijder de RSSR uit de vriezer en laat de container opwarmen tot kamertemperatuur (10-15 min). Weeg 4.05 mg van de NR en los het op in 1 mL van DMSO oplossing. Gebruik de bereide oplossing van RSSR (10 mM) als een stamoplossing.
    2. De waarde van de snelheid constant, kobs, van de reactie van RSSR met GSH de wenselijk temperatuur en de pH als volgt bepalen.
    3. Voeg eerst 20 µL van de stockoplossing van de RSSR (10 mM) aan 0.98 mL 1 mM nb-fosfaat buffer, pH 7,2, 150 mM NaCl, verkrijgen een 0,2 mM RSSR probe oplossing.
    4. Bereid oplossingen van 1, 2 en 5 mM concentraties van GSH in 0,1 M nb-fosfaat buffer met een pH van 7,2. Om te nauwkeurig beoordelen GSH-concentratie in de cellen van de gerichte orgel van de metingen in vivo , moet de kalibratie in vitro worden uitgevoerd bij een pH dicht bij de waarde van de intracellulaire pH.
    5. Meng gelijke delen van 0,2 mM RSSR oplossing en een van de oplossingen van de GSH bereid in stap 1.3.4. voor een eindconcentratie van de sonde op 0,1 mM en GSH op 0,5, 1, of 2.5 mM.
    6. Onmiddellijk na RSSR en GSH oplossing mengen, leg het monster in de EPR-resonator en registreren de EPR-spectra iedere 12 seconden gedurende 10 minuten. Vervolgens berekent de kinetiek van de toename van de spectrale amplitude van de monoradical. Gebruik de volgende EPR spectrometer overname parameters: amplitude modulatie, 1 G; modulatie frequentie, 100 kHz; sweep breedte, 60 G; tijd, 10-60-s vegen.
    7. Passen de gemeten EPR-kinetiek aan de monoexponents en de tijdconstante van de exponentiële kinetiek, τ berekenen. De lineaire regressie (1/τ = kobs × [GSH]) biedt de constante waarde van de waargenomen tarief van de reactie tussen GSH en RSSR (b.v.bij 34 ° C en pH 7,2, kobs = 2,8 ± 0,2 M-1s-1)11.
  4. Multifunctionele hoop sonde voor pO2, pH en Pi beoordeling
    Opmerking: De trityl van de monophosphonated hoop sonde is gesynthetiseerd zoals beschreven in referentie12 en wordt bewaard bij 4 ° C. De CW EPR spectra van hoop op pH << pKa (A - zuurvorm) en pH >> pKper (B - basisvorm) worden vertegenwoordigd door de paren als gevolg van fosfor hyperfine splitsen, eenP. De typische instrumentele instellingen zijn als volgt: amplitude modulatie, 37.5 mG; modulatie frequentie, 100 kHz; sweep breedte, 0.9 G; tijd, 20-60-s vegen. Bij tussentijdse pH (5 < pH < 8) het EPR-spectrum van hoop sonde wordt gekenmerkt door een kwartet wanneer zowel A en B Staten aanwezig zijn. De individuele EPR linewidth van de hoop is een pO2 marker (nauwkeurigheid, ≈ 1 mmHg; p O2 bereik, 1-100 mmHg). De noemer van geprotoneerd hoop (een formulier) is een marker van de pH in de variëren van 6 tot 8.0 (nauwkeurigheid, ± 0,05). De waarde van de proton wisselkoers (uitgedrukt in mG) met Pi geëxtraheerd door simulatie van de spectra is een Pi-markering (nauwkeurigheid, ± 0,1 mM, bereik, 0.1-20 mM). Kalibratie procedures worden uitgevoerd op de (fysiologische 37 ° C), Ionische sterkte van de oplossing (NaCl, 150 mM), en hoop sonde concentratie van 0,2 mM, zoals eerder in verwijzingen12,18 beschreven, en hieronder.
    1. Verwijderen van de sonde hoop uit de vriezer en laat de container opwarmen tot kamertemperatuur (10-15 min).
    2. Weeg 10.7 mg van de hoop-sonde, los het dan op in 1 mL zoutoplossing en breng de pH op 7.4. Toevoegen van 20 µL van de bereid stockoplossing van de hoop (10 mM) tot 0.98 mL van de zoutoplossing te verkrijgen van een 0,2 mM hoop probe oplossing.
    3. Titreer 0,2 mM voor de oplossing van de sonde hoop door de toevoeging van een kleine hoeveelheid NaOH of HCl, met de uiteindelijke verdunning van het monster, minder dan 1% voor de kalibratie van de sonde van de pH wordt. De pH meet met een pH-elektrode gecalibreerd bij 37 ° C met behulp van de pH-waarden voor de oplossing van de verwijzing door nationale Bureau van normen (de V.S.) aanbevolen. Gebruik een dubbelwandige reactie bekerglas gekoppeld aan een rondpompthemostaat zorgvuldig om temperatuur te houden van de referentie- en milliliters gestelde oplossingen tijdens de metingen van de pH. Handhaven van zuurstofvrije omstandigheden door de toevoeging van 10 mM glucose en 100 U/mL glucose oxidase aan de sonde oplossingen.
    4. Verwerven de EPR spectra van de formulieren A en B op pH ≤ 5 en pH ≥ 8, respectievelijk in zuurstofvrije omstandigheden in de afwezigheid van fosfaat.
    5. Gebruik de corresponderende spectra intrinsieke spectrale parameters te verkrijgen. Namelijk, simuleren de spectrale lijn als de convolutie van de Lorentz-functie met de Gauss functie die de onopgeloste super hyperfine structuur van de hoop-sonde benadert. De montage van de berekende EPR spectra aan de experimentele spectra levert de waarden van eenP en Lorentz linewidth (ΔLpp), bepaald door de snelheid van de dwarse ontspanning, 1/T-2 (waar 1/T-2 = (√3/2) Lpp voor de gemeten afgeleide van de RF absorptie regel in CW EPR), en de linewidth van Gaussiaanse distributie, G.
      Opmerking: De volgende zijn de parameters die zijn verkregen uit de spectra gemeten op de voorwaarden die zijn opgegeven in stap 1.4.2: eenP(A) = 3.63 G, eenP(B) = 3.37 G; 1/T2(A) = 23.6 mG; 1/T-2(B) = 9 mG; G(A) = 40 mG; G(B) = 45 mG (zie verwijzing8).
    6. Verwerven van de EPR spectra van de hoop met een pH van de tussenliggende (5 < pH < 8). De hoge-geplaatst component van de verworven EPR spectra met behulp van de theorie van de uitwisseling tussen verschillende locaties in niet-gekoppelde of losjes gekoppelde systemen aangepast van referentie19 als eerder beschreven18te simuleren. Gebruik de intrinsieke parameters voor A verkregen- en B-Staten (zie stap 1.4.5) om het aantal variabelen te verlagen. Passen de berekende spectra experimentele die zoeken naar de waarden van de breuk een (pA), en de afhankelijkheid van de p-A -waarde van pH plot. Gebruik de afhankelijkheid van pA op pH in verdere studies als een kalibratiekromme pH.
      Opmerking: Montage van de afhankelijkheid van de pH van pA met een standaard titratiecurve biedt de waarde van de dissociatie constant, pKeen (hoop) = 6.98. In vivo studies is het verwerven van de volledige EPR spectra van de hoop-sonde onpraktisch vanwege de extra tijd die nodig zijn voor het verwerven van de kloof tussen laag - en hoog-veld onderdelen van de fosfor-hyperfine splitsen in het EPR-spectrum. Derhalve in verdere blijkt studies is alleen de hoge-geplaatst component van het EPR-spectrum gemeten en geanalyseerd.
    7. Voor de kalibratie van de sonde van pO2, aanschaffen EPR spectra van de hoop-sonde op verschillende zuurstofconcentraties.
    8. De pO2 controlewaarden van de oplossingen door borrelen met gasmengsel verlost van een gas-controller. Controle van de temperatuur (37 ° C) van de oplossing met behulp van een waterbad gekoppeld aan een thermostaat.
    9. Simuleren de EPR-spectra en passen ze bij experimentele degenen zoals beschreven in stap 1.4.6 de waarden van zuurstof-geïnduceerde ontspanning tarieven bepalen.
      Opmerking: De waarden van zuurstof-geïnduceerde ontspanning tarieven waren 0.49 mG/mmHg zowel voor A en B vormen van de hoop sonde zoals gemeten bij 37 ° C8.
    10. Voor de kalibratie van de sonde van [Pi], aanschaffen EPR spectra van de sonde van de hoop in verschillende concentraties van fosfaat. Gebruik de hoop radicale oplossing met een pH-waarde in de buurt van pKeen (pKeen = 6,9 bij 37 ° C)18 en titreer het met verschillende concentraties van fosfaat. De temperatuur en gas samenstelling handhaven zoals beschreven in bovenstaande stappen.
    11. Simuleren van de EPR-spectra en passen ze bij experimentele degenen zoals beschreven in stap 1.4.6 om te bepalen van de waarde van Pi-geïnduceerde wisselkoers.
      Opmerking: Afhankelijk van de wisselkoers Pi-geïnduceerde [Pi] wordt gebruikt als kalibratie in verdere studies.

2. Muismodellen van borstkanker

  1. MMTV-PyMT spontane tumor model
    1. Gebruik van 4-8 week-oude vrouwelijke vriend virus B-type gevoeligheid/NIH (FVB/N) muis borstklier tumor virus promotor (MMTV) polyoma midden-T antigeen (PyMT +) muizen met spontaan gevormde borstklier tumoren voor in vivo EPR-studies.
    2. Gebruiken voor vergelijking van weefsel microenvironments van normale borstklieren en tumoren, leeftijd-matched littermate vrouwtjes tekort aan de PyMT oncogen (PyMT−, "wild type")20.
    3. De muizen onverminderd L-band EPR spectroscopie eenmaal per week gedurende vier weken tijdens Isofluraan anesthesie (Zie sonde levering hieronder).
    4. Anesthetize van de muis met behulp van een lucht-Isofluraan mengsel (3% Isofluraan) en plaatst u de muisaanwijzer op een verstelbare tafel in een juiste, laterale positie met de tumor (borstklieren) dicht bij de oppervlakte spoel resonator.
    5. Na plaatsing van de muis, beheren van de sonde door intratissual (IT) injectie, tune de EPR-spectrometer en verwerven de EPR spectra voor 5-10 min.
    6. Meten van 2-3 borstklier tumoren (van MMTV-PyMT + muizen) of niet-tumor tijdens dezelfde sessie EPR borstklieren (van PyMT− muizen).
  2. Orthotopic Metropolitan-1 tumor model
    1. FVB/N achtergrond BMO-1 lymfkliertest borstkankercellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% relatieve vochtigheid in DMEM met 10% foetale runderserum (FBS), 10 µg/mL insuline, 5 ng/mL rhEGF en 1% groeien PSA (penicilline G natrium, streptomycine sulfaat en amfotericine B) om te ~ de samenvloeiing van de 80% in de kolf van een T175.
    2. De media gecombineerd en spoel de Adherente cellen met 10 mL PBS (1,54 mM KH2PO4, 155 mM NaCl en 2.71 mM nb2HPO4-7 H2O zonder calciumchloride of magnesiumchloride, pH = 7.4).
    3. Loskoppelen van de cellen door toevoeging van 5 mL trypsine-EDTA-oplossing van 0,25% en het schommelen van de kolf. Wanneer de cellen zijn vrijstaand, voeg vervolgens 10 mL DMEM met 10% FBS aan op de maatkolf en het verzamelen van de cellen.
    4. Centrifugeer de celsuspensie bij 132 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en resuspendeer naar 1 x 106 cellen per 100 µL minimale DMEM.
    5. Met behulp van een insuline-injectiespuit (naald 29G 1/2), langzaam injecteren 100 µL celsuspensie van de tumor in de borstklier vet pads nummer 4 van 8 weken oude vrouwelijke FVB/N wild type muizen.
    6. Inleiding van de tumor te controleren door palpatie (verschijnen na ongeveer 2-3 weken), groei (visuele), en muis heath (visueel) om de andere dag.
    7. Meten van tumor afmetingen eenmaal per week met behulp van de remklauwen en bepalen van de tumor volumes met behulp van de vergelijking:
      figure-protocol-1

3. sonde levering voor In Vivo functionele metingen

  1. Gebruik deeltjes LiNc-BuO sonde (Protocol I) voor pO2 metingen in orthotopic tumor modellen door het implanteren van tumorcellen met verinnerlijkte LiNc-BuO microcrystals zoals eerder beschreven14,21 en hieronder.
    1. In het geval van de Metropolitan-1 tumor model, voor internalisering van LiNc-BuO microcrystals in Metropolitan-1 de cellen, schorten de LiNc-BuO-microcrystals in DMEM met een concentratie van 20 mg/mL en bewerk ultrasone trillingen ten met een sonde ultrasoonapparaat op 20 kHz met behulp van 7 W kracht in een 5-mL glazen ronde onderkant buis voor 5 min op ijs.
    2. Voeg 100 µL (2 mg van LiNc-BuO) van de ophanging aan een T75 maatkolf met 10 mL voedingsbodems met BMO-1 cellen (ongeveer 30% heuvels). Alle procedures plaatsvinden in een kast van bioveiligheid en de media bevat penicilline en streptomycine om mogelijke besmetting te minimaliseren.
    3. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 72 uur of totdat zij ~ 80% confluentie.
    4. De media gecombineerd. Wassen van de cellen vijfmaal met 10 mL PBS. Loskoppelen van de cellen met 5 mL trypsine-EDTA. Het verzamelen van de cellen. Centrifuge zoals hierboven beschreven in stap 2.2.4. Een steekproef van cellen met uitsluiting kleurstof om de levensvatbaarheid van de cellen en de hoeveelheid vlekken.
    5. Opschorten van de cellen bij een concentratie van 1 x 10-6 per 100 µL minimale DMEM.
    6. Met behulp van een insuline spuit, injecteert langzaam 100 µL celsuspensie met de verinnerlijkte LiNc-BuO-microcrystals in de borstklier vet pads nummer 4 van 8 weken oude vrouwelijke FVB/N wild type muizen zoals beschreven in stap 2.2.5.
    7. Inleiding van de tumor en groei volgen zoals beschreven in stappen 2.2.6 en 2.2.7.
  2. Gebruik deeltjes LiNc-BuO sonde (Protocol II) op een spontane of orthotopic modellen. Injecteren LiNc-OBu microcrystals op de site van belang, bijvoorbeeld, in normale melkklier of borstklier tumoren, met behulp van een insuline spuit.
  3. Oplosbare sondes
    1. Anesthetize van de muizen door inhalatie van een mengsel van lucht-Isofluraan (1,0 L/min leverings- en 2-3% van Isofluraan) met behulp van een verdoving machine en plaats ze in de kloof van de EPR-spectrometer.
    2. Het instrument stemmen, dan injecteren de NR (10-30 µL, 10 mM), de hoop sonde (10−30 µL, 0,5-2 mM) in zoutoplossing, pH 7,2 of RSSR sonde in DMSO (10 µL, 10 mM) oplossingen (IT).

4. in Vivo functionele metingen

  1. Anesthetize voor EPR spectroscopische metingen, de muizen door inademing van lucht-Isofluraan mengsel met behulp van een machine van de verdoving zoals beschreven in stap 3.3.1.
  2. Uitvoeren van functionele metingen met behulp van L-band (1,2 GHz) EPR spectrometer als volgt.
    1. Plaats de resonator oppervlakte spoel op een normale melkklier of een borstklier tumor en afstemmen van de spectrometer.
    2. De EPR spectra van de geïmplanteerde deeltjes sonde voor 5−10 min verwerven over enkele weken na implantatie. In het geval van oplosbare sondes, verwerven de EPR-spectra onmiddellijk na injectie van de sonde voor 5-10 min.
    3. Analyseer de EPR spectra van de sonde NR te vinden van de hyperfine splitsen, eenN, en signaal amplitude, I(t). De waarde van eenN omzetten in de pH-waarde met behulp van de ijkcurve die is verkregen in stap 1.2.4. Het tarief van verval van de amplitude van het signaal I(t) analyseren als relatieve verandering van de oorspronkelijke amplitude, I(t = 0), berekend in willekeurige eenheden per seconde (s-1).
    4. Passen de verhoging van het monoradical-onderdeel van het EPR-spectrum van GSH-gevoelige RSSR sonde naar de monoexponents te verkrijgen van de tijdconstante van de exponentiële kinetiek voor het berekenen van de concentratie van GSH.
    5. Passen de EPR spectra van Hoogveld component van de multifunctionele hoop sonde aan de experimentele degenen zoals beschreven in (stap 1.4.5) opleveren van de waarden van pH en pO2 Pi.

5. statistische analyse

  1. Verwerking van gegevens en statistische analyses uitvoeren. Gebruiken van een Pearson r correlatie test (voor normaal verdeelde datasets) en de Spearman Rank volgorde correlatie (voor gegevenssets met geweigerde normaliteit van Gegevensdistributie) voor correlatie analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Weefsel p O 2 Evaluatie met behulp van de LiNc-BuO sondes:

Met behulp van de procedure beschreven onder stap 1.1, we de kalibratie van vers bereide LiNc-BuO microcrystals schorsing uitgevoerd. Figuur 2 toont de typische zuurstof-afhankelijkheid van de linewidth van de LiNc-BuO sonde, evenals haar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De gepresenteerde methoden toestaan voor noninvasive in vivo beoordeling voor de kritische parameters van de chemische TME, namelijk pO2, pH, redox status en concentraties van interstitiële Pi en intracellulaire GSH. Magnetische resonantie technieken, zoals MRI en lage-veld EPR, zijn de methoden van keuze voor noninvasive in vivo profilering van deze TME-parameters. MRI visualiseert anatomische structuren maar mist functionele gevoeligheid. In tegenstelling tot MRI bieden EPR technie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door de NIH grants CA194013, CA192064 en U54GM104942. De WVCTSI is erkend voor start-up VVK, AB, en onderzoekingen. De auteurs bedanken Dr. M. Gencheva en K. Steinberger voor de hulp bij de illustratieve experimenten. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
L-band EPR spectrometerMagnettech, DuitslandL-band (1,2 GHz) elektronenparamagnetische resonantie (EPR) spectrometer voor het verzamelen van in vitro en in vivo spectra van paramagnetische moleculen
 Temperatuur & Gas Controller Noxygen, DuitslandTemperatuur & Gas Controller ontworpen om de temperatuur en gassamenstelling te regelen en aan te passen  
SonicatorFisher Scientific
GSH (L-Glutathione gereduceerd)Sigma-AldrichG4251
MMTV-PyMT  muizenIn house
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Met-1 muis borstkankercellenIn house
C57Bl/6 wild type muizen Jackson Laboratory
TrypsineThermo Fisher Scientific25200056
Trypan Blauw Uitsluitingskleurstof Thermo Fisher ScientificT10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isofluraan (IsoFlo)Abbott Laboratories
Natriumfosfaat dibasischSigma-AldrichS9763
Natriumfosfaat monobasischsigma-AldrichS07051
Natriumchloridesigma-AldrichS7653
Zoutzuursigma-Aldrich320331
Natriumhydroxidesigma-AldrichS8045
Glucosesigma-Aldrich
Glucose oxydasesigma-Aldrich
Lauda Circulator E100Lauda-Brikmann
pH meter OrionThermo Scientific 
LiNc-BuO sondeIn houseDe Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine sonde werd gesynthetiseerd volgens ref 13
NR sondeIn houseDe Nitroxide sonde werd gesynthetiseerd volgens ref 11
RSSR sondeIn houseDe di-Nitroxide sonde werd gesynthetiseerd volgens ref 15
HOPE sondeIn houseDe monofosfonaat Triarylmethyl sonde werd gesynthetiseerd volgens ref 12

Referenties

  1. Siemann, D. W. Tumor Microenvironment. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).
  2. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  3. Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
  4. Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
  5. Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
  6. Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
  7. Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
  8. Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233(2017).
  9. Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
  10. Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
  11. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
  12. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
  13. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  14. Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
  15. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  16. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
  17. Hicks, R. Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).
  18. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
  19. Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. Practical NMR spectroscopy. , Heyden. (1980).
  20. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  21. Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
  22. Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
  23. Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
  24. Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
  25. Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
  26. Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
  27. Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Elektronparamagnetische resonantiepH-metingpO2-beoordelingfosfaatconcentratieglutathiondetectiemultifunctionele probeL-band EPR-spectrometerparamagnetische probes
In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.