Mitochondriën zijn slechts een klein percentage van de plant cel, moeten ze voor een aantal studies worden gezuiverd. Mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van organen van de plant door homogenisering, gevolgd door de differentiaal- en dichtheid kleurovergang centrifugeren te verkrijgen van een hoogst gezuiverde mitochondriale fractie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondriën zijn essentiële organellen die betrokken zijn bij talrijke stofwisselingsroutes in planten, met name de productie van adenosine trifosfaat (ATP) van de oxidatie van verminderde verbindingen zoals nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) en flavine adenine dinucleotide (FADH2). De volledige annotatie van het genoom van Arabidopsis thaliana heeft opgericht als de meest plant modelsysteem gebruikte, en de noodzaak om te zuiveren van mitochondriën uit allerlei organen (blad, wortel of bloem) dus nodig is om volledig gebruik maken van de instrumenten die zijn nu beschikbaar voor Arabidopsis mitochondriale biologie studeren. Mitochondriën zijn geïsoleerd door de homogenisering van de weefsel met behulp van een verscheidenheid van benaderingen, gevolgd door een reeks stappen van de differentiële centrifugeren produceren een ruwe mitochondriale pellet dat is verder gezuiverd met behulp van continue colloïdale dichtheid verloop centrifugeren. De colloïdale dichtheid materiaal wordt daarna verwijderd door meerdere centrifugeren stappen. Vanaf 100 g verse blad weefsel, kan 2-3 mg van de mitochondriën worden routinematig verkregen. Respiratoire experimenten op deze mitochondriën weer typische tarieven van 100-250 nmol O2 min-1 mg totale mitochondriale eiwit-1 (NADH-afhankelijke tarief) met de mogelijkheid om diverse substraten en inhibitors gebruiken om te bepalen welke substraten zijn wordt geoxideerd en de capaciteit van de alternatieve en cytochroom terminal oxidasen. Dit protocol beschrijft een methode van de isolatie van de mitochondriën van Arabidopsis thaliana bladeren met behulp van continue colloïdale dichtheid verlopen en een efficiënte respiratoire metingen van gezuiverde plant mitochondriën.
Inleiding
De geschiedenis van mitochondriale plantenonderzoek gaat terug over 100 jaar1. Intacte mitochondria werden voor het eerst geïsoleerd in de vroege jaren 1950 met behulp van differentiële centrifugeren. De komst van een colloïdale dichtheid verloop in de jaren 1980 toegestaan mitochondriën zonder lijden osmotische aanpassing worden gezuiverd. Terwijl kleurovergang gezuiverde mitochondriën geschikt voor de meeste doeleinden, vanwege de gevoeligheid van de Spectrometrie van de massa zijn, kunnen zelfs relatief geringe verontreinigingen worden gedetecteerd en mogelijk een mitochondriale locatie2ten onrechte is toegewezen. Het gebruik van gratis stroom elektroforese kan verwijderen van beide plastidic en peroxisoom besmetting3, maar vrij stromen elektroforese is een gespecialiseerde techniek en is niet vereist voor de overgrote meerderheid van de studies. Bovendien komt voor wanneer bepalen de locatie van een eiwit dient te worden herinnerd dat dubbele of meerdere targeting van eiwitten in cellen. Meer dan 100 dual gerichte eiwitten worden beschreven voor een aantal eiwitten gericht op mitochondriën, chloroplasten/plastiden en mitochondriën4en peroxisomen zijn ook bekend van5. Bovendien is de nieuwe locatie van eiwitten onder specifieke stimuli, zoals oxidatieve stress, een opkomende thema in cel biologie6. Dus, de locatie van eiwitten moet worden beschouwd in het kader van de biologie studeerde en een aantal verschillende benaderingen worden gebruikt om te bepalen en controleren of de locatie2.
Mitochondriën zijn meestal geïsoleerd van plantaardige weefsels door homogenisering, een evenwicht nodig tussen de celwand mitochondriën vrij te open te breken, en niet schadelijk de mitochondriën. Traditioneel, met aardappel en bloemkool omvat homogenisering het gebruik van huishoudelijke blender/juicer toestellen te maken van een vloeibaar extract in een buffer met diverse componenten te houden activiteit. Isolatie van de mitochondriën van pea bladeren, (een populair materiaal voor mitochondriale isolatie met behulp van jonge zaailingen (~ 10 dagen oud), maakt gebruik van een blender lyse cellen zoals het blad materiaal zacht is. Met de beschikbaarheid van Arabidopsis thaliana T-DNA dat knock-out lijnen, is de noodzaak om het zuiveren van de mitochondriën van functionele studies te kunnen de ontwikkeling van methoden om te isoleren van de mitochondriën van de blad-, wortel- of bloem noodzakelijk weefsel. Over het geheel genomen werkte de methoden ontwikkeld voor andere planten goed7, met de perquisite die slijpen van het materiaal nodig om te worden geoptimaliseerd. Voor Arabidopsis dit kan worden bereikt in een verscheidenheid van manieren (zie hieronder), en verschilt tussen weefseltypes (HLA) (wortel versus schieten). Het gebruik van het continu verloop kan ook worden geoptimaliseerd als de dichtheid van mitochondriën van verschillende organen of ontwikkelingsstadia betekent ze anders kunnen migreren. Dus, voor maximale scheiding de dichtheid van het verloop kan worden verfijnd om ervoor te zorgen om de beste scheiding.
Eenmaal gezuiverde de mitochondriën kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van studies, met inbegrip van eiwit en tRNA opname experimenten, enzym activiteit testen, respiratoire keten metingen en analyses van de westelijke vlek. Geïsoleerde mitochondriën kunnen ook worden gebruikt voor spectrometrische analyse van eiwit overvloed. Gerichte meerdere reactie (MRM) analyses controle zorgt voor de kwantificering van eiwitten gedefinieerd, maar vereisen aanzienlijke assay ontwikkeling. In tegenstelling, biedt kwantificering dimethyl of andere isotoop etiketten8, een aanpak van de ontdekking in het identificeren van verschillen over de hele Proteoom die kan worden gebruikt om te ontdekken van nieuwe biologische inzichten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol wordt gebruikt voor de isolatie van intacte mitochondria van Arabidopsis thaliana organen geteeld op de bodem met behulp van continue colloïdale dichtheid verlopen. Alle procedures na het verzamelen van het materiaal worden uitgevoerd bij 4 ° C.
1. bereiding van het slijpen van Medium, Wash Buffer en kleurovergang oplossingen
- Bereiden van 300 mL van het slijpen medium (min ascorbaat en cysteïne) en 200 mL 2 x wassen buffer per tabel 1 één dag voorafgaand aan de isolatie, houd ze koud bij 4 ° C.
Opmerking: Natrium ascorbaat en L-cysteïne (vrije base) aan toevoegen een eindconcentratie van 17.84 en 20,36 mM, respectievelijk aan het slijpen medium op de ochtend van de isolatie. Als de mitochondriën zijn te gebruiken gel voor westelijke vlek of blauwe native-polyacrylamide de elektroforese (BN-pagina) analyses, 2 x wassen buffer zonder BSA make-up. - Verlopen voor te bereiden op de ochtend van mitochondriale isolatie (Figuur 1 en tabel 1).
- Maak de zware en lichte kleurovergang oplossingen in twee bekers; elk 35 mL is voldoende voor twee kleurovergang buizen.
- De kamers van de kleurovergang schenker en peristaltische PVC-buis met gedeïoniseerd water wassen en zelfs stroom door de leidingen van alle buizen zorgen.
- Plaats 2 centrifuge buizen (50 mL) onder een lichte hoek op ijs met de afzet van de peristaltische buizen PVC geplakt is aan de binnenkant van de buizen om dat de kleurovergang oplossing loopt langs de zijkant van de buizen.
- Sluit de verbinding tussen de binnenste en buitenste kamers (zwarte hendel naar beneden). Kleurovergang Schenker plaats op een magneetroerder met een klein roer-bar in de binnenkamer.
- Giet de 35 mL zware kleurovergang oplossing in de binnenkamer (kamer met slang afvoer). Afzien van de zware kleurovergang oplossing in de twee centrifuge buizen geplaatst op ijs totdat de helft is nog met het tarief van de peristaltische pomp ingesteld op snel (300 mL/h).
- Giet de 35 mL licht verlopende oplossing in de buitenste kamer (kamer zonder buis stopcontact). Open de verbinding tussen de kamers (push zwarte hendel omhoog halverwege) en oplossingen voor het mengen zachtjes toestaan. Vermeng de oplossingen met de magneetroerder.
- Toestaan dat de oplossingen voor langzaam (60 mL/h) totdat alle van de kleurovergang mix heeft is afgezien van de kamers wat resulteert in twee 0 - 4,4% (m/v) Polyvinylpyrrolidon (PVP) verloop gevulde buizen. Houden de hellingen op ijs totdat klaar voor gebruik in stap 2.12.
Opmerking: Zodra het verloop is opgesteld, Verdun 2 x wassen middellange en 1 x met prechilled-gedeïoniseerd water en houdt kou bij 4 ° C.
2. de homogenisering en mitochondriale isolatie
- Hele rozet weefsel van 4 - weken oude Arabidopsis planten gekweekt op bodem met een schaar te knippen, zullen ten minste 80 planten worden vereist voor 1 prep.
Let op: 10-14 dagen oude water culturen, minimum 5 potten/prep of 2 - weken oude zaailingen geteeld op agar-platen, Murashige & Skoog basale zout mengsel (MS), minimaal 4 platen, kunnen ook worden gebruikt. - Plaats de helft van het plantmateriaal die heeft zijn gesneden in kleine stukjes in een vooraf gekoelde 4 ° C grote mortier en een stamper met 75 mL van slijpen medium (tabel 1) en slijpen uitgebreid gedurende enkele minuten totdat geen grote stukken van weefsel worden overgelaten.
- Vooraf NAT 4 lagen van filtratie materiaal (22-25 µm poriegrootte) met het slijpen van middellange en filtreer homogenaat door de 4 lagen van filtratie materiaal via een kunststof trechter in een erlenmeyer van 500 mL.
- Het malen van de resterende helft van het weefsel met een andere 75 mL medium slijpen.
- Homogenates in de filtratie-materialen combineren en zoveel mogelijk homogenaat door middel van filteren.
- Het malen van het resterende weefsel nog op het materiaal van de filtratie weer met de resterende 150 mL slijpen medium, filter weer in de conische kolf van 500 mL.
- Centrifugeer het gefilterde homogenaat in 8 vooraf gekoeld 50 mL kunststof centrifuge buizen bij 2.500 x g bij 4 ° C in de rotor van een vaste hoek voor 5 min.
- Giet het supernatant in schone centrifuge buizen (50 mL; dat niet wordt verstoord de groene pellet) en centrifugeer bij 17.500 x g bij 4 ° C gedurende 20 minuten in een vaste hoek rotor.
- Gooi alles behalve < 3 mL van het supernatans dat door aspiratie (of giet voorzichtig af zonder de pellet te verstoren). Zachtjes resuspendeer de pellet in het residuele supernatant met behulp van een kleine fijne penseel.
- Voeg 10 mL 1 x wassen buffer aan elke buis en 4 buizen combineren tot 1 schone centrifugebuis (dat wil zeggen, wat resulteert in 2 buizen).
- Vul deze buizen met 50 mL buffer 1 x wassen en herhaalt u stappen 2,7-2,9.
- Zwembad ruwe mitochondriale pellets in 1 tube met behulp van een druppelaar en gelijkmatig te verspreiden met het fijne penseel (een kleine hoeveelheid was buffer kan worden gebruikt, maar het eindvolume moet minder dan 3 mL te passen op de top van het verloop). Zachtjes laag de mitochondriale schorsing met een druppelaar op de 2 continu 0 - 4,4% (m/v) PVP verlopen.
- Buizen per gewicht (met 1 x wassen buffer) worden gesaldeerd samen en centrifugeer bij 40.000 x g bij 4 ° C gedurende 40 min. Zorg ervoor de pauze is uitgeschakeld. Mitochondriën gaan migreren naar een band in de buurt van de onderkant van de buis, of mag aanwezig zijn in de zware oplossing aan de onderkant van de buis (geïdentificeerd door een bewolkt, gelige band; Figuur 2).
- Verwijder voorzichtig de bovenste 5 cm van oplossing boven de mitochondriale band door aspiratie.
- Distribueren van de resterende oplossing met de mitochondriën in 2 schone buizen en vul met 1 x wassen buffer. Verdeel de colloïdale dichtheid verloop- en mitochondriën door die betrekking hebben op de monding van de buis met een kunststof paraffine film en meerdere malen omkeren. Centrifugeer gedurende 15 min bij 31.000 x g bij 4 ° C bij langzaam remmen.
Opmerking: Voordat het centrifugeren, zorg ervoor dat de mitochondriën en het resterende colloïdale dichtheid verloop gelijkmatig verdeeld zijn. Anders is het verloop van de colloïdale dichtheid kan concentreren op de onderkant van de buis en voorkomen pillering van het mitochondrium. - Verwijder het supernatant door aspiratie, vul de buis met 1 x wassen tot 50 mL buffer, en weer omkeren zodat mengen. Centrifugeer gedurende 15 min bij 31.000 x g bij 4 ° C bij langzaam remmen.
- De bovendrijvende substantie gecombineerd en verzamelen de mitochondriale pellets in zo klein een volume (~ 500 µL) mogelijk met behulp van een precisiepipet met gemodificeerde 200 µL tips (knippen de tip een beetje boven het einde toe de opening). Plaats de mitochondriën in een tube van 1,5 mL en houd op ijs voor onmiddellijk gebruik of winkel bij-80 ° C.
Opmerking: Als mitochondriën wordt gebruikt voor natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE), BN-pagina, of immunoblot analyses, gebruik 1 x wassen buffer zonder BSA voor de definitieve wast (d.w.z., stap 2.15 en 2.16). - Bepaal de eiwitconcentratie van mitochondriën met behulp van de methode Bradford.
Opmerking: Voor BN-pagina centrifuge aliquots bij 4 ° C, en winkel pellet-80 ° c tot gebruik. Voor zuurstof verbruik metingen, kunnen alleen vers geïsoleerde mitochondriën worden gebruikt.
3. zuurstof verbruik metingen
Opmerking: Zuurstofverbruik door geïsoleerd vers plant mitochondriën kunnen worden geanalyseerd met een zuurstof-elektrode van Clark-type, waardoor de bepaling van mitochondriale INTACTHEID, cytochroom c traject activiteit, en activiteit van de alternatieve route.
- Software-installatie
- Installeer de gelicentieerde zuurstof monitoring software op de computer die wordt gebruikt voor zuurstof verbruik metingen.
- Voorbereiding van de ademhaling medium, substraten, chemische stamoplossingen en de Clark-type zuurstof-elektrode
- Ademhaling medium (300 mM sacharose, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0,1% (g/v) bovien serumalbumine (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) gebruikt voor zuurstof verbruik testen voor te bereiden.
- Bereiden substraten, inhibitors en effectoren gebruikt voor het meten van mitochondriale ademhaling (tabel 2). Deze kunnen worden eerder bereid en opgeslagen bij-20 ° C.
Opmerking: De pH van zure oplossingen zoals organische zuren op pH 7,0 neutraliseren met behulp van NaOH vóór gebruik. - Warm de ademhaling middellange tot dezelfde temperatuur als de test kamer (25 ° C).
- Monteer de Clark-type zuurstof-elektrode, zoals beschreven in het protocol van de fabrikant.
- 1 mL lucht-verzadigd water (lucht-verzadigd water wordt verkregen door het krachtig schudden van een kleine hoeveelheid gedeïoniseerd water in een grote erlenmeyer) plaats in de meetkamer. Om over te schakelen op de roerder, klikt u op de knop "Roerder snelheid". Klik op de knop "On" en zet de roerder snelheid naar 65 rpm. Klik op "OK" om door te gaan. Roer het water voortdurend bij 25 ° C.
- Kalibratie van zuurstof-elektrode
- Warm het water dat wordt gebruikt voor kalibratie aan dezelfde temperatuur als de test kamer (25 ° C).
- Wachten voor de huidige te stabiliseren en de zuurstof-elektrode kalibreren.
- Om te beginnen de kalibratie van de zuurstof-elektrode, klik op de 'Calibreer'-knop, selecteer "Vloeibare fase kalibratie" en vervolgens "Lucht verzadigd Water."
- Een nieuw venster wordt geopend (zuurstof kalibratie (vloeibare fase) - stap 1 van 5). Selecteer het kanaal om te kalibreren (het kanaal dat op de elektrode control box is aangesloten) en geef variabelen (set 'Kamer Temperature' tot 25 ° C en "Atmosferische druk" 101.32 kPa). Klik op "OK" om door te gaan.
- In de volgende stap (stap 2 van 5), setup de roerder snelheid (65 rpm) en klik op "OK" om door te gaan.
- In stap 3 van 5, wacht totdat het signaal naar het bereiken van een plateau. De term 'Plateau bereikt, druk op OK om verder te' verschijnt in het vak. Klik op "OK" om door te gaan.
- In stap 4 van 5, tot stand brengen nul zuurstof in de kamer door het toevoegen van 5 mg natrium dithioniet. Klik op "OK" om door te gaan.
Opmerking: Een daling van de zuurstofconcentratie in de trace zichtbaar moet zijn en moet bereiken 0. - In de laatste stap van kalibratie (stap 5 van 5), wacht totdat het signaal naar het bereiken van een plateau. De term 'Plateau bereikt, druk op OK om verder te' verschijnt in het vak. Klik op "OK" om door te gaan.
- Klik op "Opslaan kalibratie" om op te slaan van de kalibratie. Een nieuw venster wordt geopend. Klik op "OK" om te bevestigen als u wilt opslaan van de nieuwe kalibratie voor de zuurstof control box.
Opmerking: Na succesvolle kalibratie, de labeling "zuurstof (nmol/mL)" verschijnt op de y-as. - Reinig na kalibratie, de meetkamer door de kamer met water spoelen (minstens 5 - 10 maal) om ervoor te zorgen dat goede reiniging. Plaats 1 mL van ademhaling medium in het meten van de kamer en laat het membraan te equilibreer gedurende een paar minuten totdat de zuurstof verbruik trace lineair is.
- Aanpassen van de schaal van het zuurstof verbruik spoor een goede helling beeld te krijgen. Klik op "Zoom XY" en voer variabelen ("Zuurstof" ingesteld op 0 - 300 en de "tijd-as" op 0 - 45 min).
- Bepaling van mitochondriale integriteit
- Toevoegen met zuiger open, 970 µL ademhaling lucht verzadigde medium aan de kamer van de reactie.
- 30 µL geïsoleerd mitochondriën of 150 µg totale mitochondriale eiwit toevoegen als vastbesloten na de mitochondriën isolatie (totaal eiwit moet worden opgenomen in berekeningen daarna) aan de kamer van de reactie met behulp van een precisiepipet met een gesneden tip.
- Roer de mitochondriale schorsing continu gebruik maakt van een magneetroerder bar (65 rpm) bij 25 ° C te lucht-verzadigen van de oplossing.
- Zegel van de kamer met de zuiger, klik op "Start opname" als u wilt opnemen van zuurstofverbruik en toestaan dat de zuurstof verbruik trace te stabiliseren (1-2 min).
- Bepaal het tarief van zuurstofverbruik handmatig na 10 mM ascorbaat en 25 µM cytochroom c gedurende 5 minuten om het tarief "before wasmiddel" toe te voegen.
Opmerking: Om de toevoeging van substraten, inhibitors en effectoren rechtstreeks in het spoor van een label, klikt u op de knop "Voeg gebeurtenis Mark" en voer de bijbehorende label aanwijzing. Klik op "OK" om door te gaan. - Het tarief van zuurstofverbruik handmatig gedurende 3 minuten na het toevoegen van 0,05% (v/v) wasmiddel te geven de "na wasmiddel" tarief bepalen. Klik op "Opname stoppen".
- Klik op de knop "Tarieven van wijzigen tabel". 2 cursors verschijnt als verticale lijnen op het scherm van de grafiek. Klik en sleep het paar tarief cursors naar de gewenste posities in de trace naar de tarief-interval te definiëren. Het tarief interval langs het spoor met behulp van de linker tarief cursor verplaatsen Het tarief interval zelf met behulp van de juiste tarief cursor instellen. De zuurstof controlesoftware automatisch trekt een lijn van passend tussen de twee cursors terwijl het bewegen van de tarief-interval cursors langs het spoor.
- Zodra de gewenste baudrate interval en standpunt heeft bepaald, het tarief invoeren in de tabel met een klik met de rechtermuisknop op 1 van de 2 cursors, en kies "Tarief toevoegen aan tabel." Klik op de "Add" knop om te bevestigen als u wilt weergeven van het tarief op de belangrijkste tarieventabel.
- Mitochondriale integriteit berekenen door de snelheid "before wasmiddel" door de "na wasmiddel" tarief, uitgedrukt als een percentage, te delen en het aftrekken van 100.
- Bepaling van mitochondriale ademhaling
- Met zuiger open, voeg 970 µL van ademhaling lucht verzadigde medium aan de kamer van de reactie. 500 µM ATP en 30 µL geïsoleerd mitochondriën of 150 µg totale mitochondriale eiwit met behulp van een precisiepipet met een gesneden tip om het medium van de ademhaling in de zaal reactie toevoegen.
- Roer de mitochondriale schorsing continu gebruik maakt van een magneetroerder bar (65 rpm) bij 25 ° C.
- Plunjer sluit, klikt u op "Start Recording" om het opnemen van zuurstofverbruik, en wacht tot 1-2 min zuurstof verbruik tarief te stabiliseren (wanneer de zuurstof verbruik trace lineair is). Voeg van 5 mM succinaat. Record het aantal zuurstofverbruik gedurende ongeveer 2 minuten.
Opmerking: Om de toevoeging van substraten, inhibitors en effectoren rechtstreeks in het spoor van een label, klikt u op de knop "Voeg gebeurtenis Mark" en voer de bijbehorende label aanwijzing. Klik op "OK" om door te gaan. - Het toevoegen van 1 mM adenosinedifosfaat (ADP). Blijven opnemen van het tarief van zuurstofverbruik gedurende 2 minuten.
- 1 mM NADH toevoegen. Record het aantal zuurstofverbruik voor 4-8 min. Dit tarief is de capaciteit van de ademhaling via cytochrome oxidase.
- Voeg 1 mM kaliumcyanide (KCN) (of 2,5 µM myxothiazol of 5 µM antimycin A) om te remmen het cytochroom c traject, en blijven opnemen voor ongeveer 2 minuten om te observeren zuurstofverbruik via de alternatieve oxidase.
- Voeg 5 mM dithiothreitol (DTT) en 10 mM pyruvaat volledig activeren de alternatieve oxidase. Blijven registreren voor 5-7 min: dit is de capaciteit van de alternatieve oxidase.
- 500 µM n-propyl gallate (nPG) toevoegen, en registreert voor 2 min. Dit beoordeelt de resterende zuurstof verbruik tarief, dat kan niet chemisch worden geremd. Aftrekken dit tarief van de andere tarieven opgenomen, aangezien het niet waarschijnlijk mitochondriale in oorsprong. Zuurstofverbruik nog steeds die plaatsvinden na de remming van het cytochroom c en de AOX traject (door KCN en nPG) is zeer waarschijnlijk Peroxidasen aanwezig als verontreinigende stoffen in de geïsoleerde mitochondriën9vandaan.
- Klik op "Opname stoppen".
- Klik op de knop "Tarieven van wijzigen tabel" en het tarief invoeren in de tabel met een klik met de rechtermuisknop op een van de twee cursors en selecteer "Toevoegen aan tarieventabel". Klik op de "Add" knop om te bevestigen als u wilt weergeven van het tarief op de belangrijkste tarieventabel.
Opmerking: Wanneer het toevoegen van effectoren ontbonden in organische oplosmiddelen (bijv., antimycin A, nPG, myxothiazol), de kamer en de plunjer moet worden gespoeld met ethanol en vervolgens water om ervoor te zorgen dat goede reiniging.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van dit protocol, konden we verschillende mitochondriale eiwitten door SDS-pagina en immunoblotting detecteren. Zoals blijkt uit figuur 3A, is het eiwit geïsoleerd van water cultuur weefsel voldoende om een zwakke band (2 µg) detecteren. Signaal intensiteit verhoogt naar verhouding tot de hoeveelheden die zijn geladen. Voor mitochondria geïsoleerd uit weefsels geteeld op platen (figuur 3B), het antwoord op hoge lichte ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Isolatie van de mitochondriën van Arabidopsis laat meestal opbrengsten van 3 mg mitochondria van ongeveer 80-100 3 - 4 - weken oude planten, hoewel rendementen van meer dan 5 mg kunnen vaak worden bereikt met grondige slijpen. Het rendement varieert met de voorwaarden van groei en vermindert dramatisch als verlaat senesce, hoewel mitochondriën structuur lijkt te worden goed onderhouden tijdens senescentie9. Een van de meest kritieke functies tot het verkrijgen van een goede opbrengst is de methode...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een Australische onderzoek Raad Centre of Excellence in de Plant energie biologie CE140100008, een Australisch onderzoek Raad toekomst Fellowship (FT130100112) te MWM, een Feodor Lynen Research Fellowship (Alexander von Humboldt Stichting, Duitsland) naar JS.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemisch |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemisch, opgelost in ethanol |
| AOX antilichaam | van Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbaat | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbaat Oxidase van Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemisch |
| Bovien serum albumine (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemisch |
| Clarity western ECL substraat | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemisch |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemisch |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemisch |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemisch |
| Difco Agar, gegranuleerd | BD Biosciences | 214530 | Chemisch |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemisch |
| EDTA dinatriumzout | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemisch |
| Gamborg B-5 Basaal Medium | Austratec | G398-100L | Chemisch |
| Gamborg Vitaminoplossing (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemisch |
| Geit Anti-Muis IgG (H + L)-HRP Conjugaat | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemisch |
| Geit Anti-Konijn IgG (H + L)-HRP Conjugaat | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemisch |
| L-Cysteïne | Sigma | C7352-100G | Chemisch |
| Magnesiumsulfaat | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemisch |
| Murashige & Skoog Basaal Zoutmengsel (MS) | Austratec | M524-100L | Chemisch |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemisch, opgelost in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemisch |
| Ndufs4 antilichaam | van Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propylgallaat | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemisch, opgelost in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemisch, colloïdaal dichtheidsgradiënt |
| Polyvinylpyrrolidon (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemisch |
| Kaliumcyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemisch |
| Kaliumfosfaat monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemisch |
| Pyrovaat | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemisch |
| Natriumchloride | Chem-Supply | SA046 | Chemisch |
| Natriumdithioniet | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemisch |
| Natrium L-ascorbaat | Sigma | A4034-100G | Chemisch |
| Succinaat | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemisch |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemisch |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemisch |
| Tetranatriumpyrofosfaat (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemisch |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemisch |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemisch, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemisch |
| Balans | Mettler Toledo | XS204 | Apparatuur |
| Bekers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Apparatuur |
| Centrifugebuizen | Nalgene | 3117-9500 | Apparatuur |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Bevestigd aan zuurstofelektrodekamer |
| Conische kolf | Isolab | 500 mL | |
| Druppelpijp | 3 mL | ||
| Vaste hoekrotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Apparatuur |
| Trechter | Per Alimenti | 14 cm | Voor filteren |
| Gradiëntschenker | Bio-Rad | 165-4120 | Voor bereiding van gradiënten |
| Magneetroerder ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Apparatuur |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtratiemateriaal |
| Mortier en stamper | Jamie Oliver | Graniet, 6 Inch | Apparatuur |
| O2view | Hansatech Instruments | Zuurstofbewakingssoftware | |
| Oxygraph Plus Systeem | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type zuurstofelektrode |
| Verfkwast | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Kunststof paraffinefilm |
| Peristaltiekpomp | Gilson | F155001 | Voor bereiding van gradiënten |
| PVC peristaltiekbuis | Gilson | F117930 | Voor bereiding van gradiënten |
| Waterbad | VELP Scientifica | OCB | Apparatuur |
Referenties
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
