Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

7.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56631

⸱

26 januari 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

In dit artikel

Samenvatting

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Samenvatting

Ontwikkeling van de hersenen is een complex proces, dat wordt gecontroleerd in een temporo-ruimtelijke wijze door gradiënten van morphogens en verschillende transcriptionele programma's. Epigenetische chromatine wijzigingen, zoals Histon methylering, hebben bovendien een belangrijke rol voor de totstandbrenging en het onderhoud van specifieke cel lot binnen dit proces. De overgrote meerderheid van Histon methylatie optreedt op de flexibele Histon staart, die toegankelijk is voor Histon modifiers, gummen en Histon lezer eiwitten. In tegenstelling, H3K79 methylation bevindt zich in het bolvormige gebied van Histon 3 en is betrokken bij verschillende ontwikkelings functies. H3K79 methylation is evolutionair bewaard en kan worden gevonden in een breed scala van soorten van Homo sapiens naar Saccharomyces cerevisiae. De wijziging treedt op in verschillende cel populaties binnen organismen, waaronder neurale progenitorcellen. De locatie van methylering van de H3K79 in het bolvormige domein van Histon 3 maakt het moeilijk in te schatten. Hier presenteren we methoden om te isoleren en cultuur corticale voorlopercellen cellen (CPC) van embryonale corticale hersenweefsel (E11.5-E14.5) of cerebellaire granulaire neuron progenitoren (CGNPs) van postnatale weefsel (P5-P7), en naar efficiënt immunoprecipitate H3K79me2 voor kwantitatieve PCR (qPCR) en sequentiebepaling van het genoom-brede.

Inleiding

De sensorische, motorische en cognitieve functies van de hersenen zijn zeer complex en gevoelig voor fysieke en ecologische veranderingen. De hersenen bestaat uit drie algemene delen de hind-, midden-, en reukkolf, die diep met elkaar zijn verbonden. Binnen de reukkolf, kan de telencephalon worden onderverdeeld in een dorsale telencephalon (DT) en een ventrale telencephalon (VT). De DT van muizen bestaat uit zes corticale lagen die worden gevormd tussen E11.5 en E18.5 in een "binnenstebuiten" manier1. De VT bevat de ganglionaire eminenties in ontwikkeling, die later het vormen van de basale ganglia2,3. Verschillende soorten cellen kunnen worden ingedeeld in de zoogdieren centrale zenuwstelsel zoals neuronen, astrocyten, oligodendrocyten4, of die zich in een temporo-ruimtelijke wijze5 ontwikkelen. Ten eerste, de neurale voorlopercellen (NPC) aanleiding geven tot verschillende soorten neuronen, interneuronen in de VT en projectie neuronen in het DT, en later naar gliale cellen (bijvoorbeeld, astrocyten6). Tijdens de corticale ontwikkeling, de meest oppervlakkige laag (layer ik), die bevat Cajal-Retzius cellen, eerst wordt gevormd. Vervolgens, tussen E12.5 en E14.5, NPC's genereren diepere neuronale lagen (VI, V) terwijl tussen 14,5 en 16,5, progenitoren aanleiding geven tot7,8van de neuronen van de bovenste laag (IV-II). Neuronale identiteit is opgegeven door de verschillende morphogen-geïnduceerde temporo-ruimtelijke transcriptionele programma's, en daarnaast door epigenetische programma's2.

Het cerebellum, die is betrokken bij de coördinatie van de motor, is gelegen in de hindbrain en ontwikkelt tussen E10 en ongeveer P20 in muizen9. Het bevat de cerebellaire cortex en de cerebellaire kernen10. De volwassen cerebellaire cortex bestaat uit drie lagen, de buitenste laag van de moleculaire, het Purkinje cellaag en de binnenste granulaire laag met granulaire neuronen10. De cerebellaire submodule cellen zijn de kleinste neuronen en vertegenwoordigen ongeveer 80% van alle neuronen in de hersenen van de gewervelde11. Ze migreren door het Purkinje cellaag naar hun bestemming12en ontwikkelen van precursoren in de externe germinal zone bevindt. Zoals in de telencephalon, de ontwikkeling van het cerebellum wordt geregeld door verschillende belangrijke morphogens, die hebben specifieke tijd - en ruimte-afhankelijke functies en initiëren gedefinieerd transcriptionele programma's10.

De ontwikkeling van corticale en cerebellaire lagen wordt gecontroleerd door transcriptionele expressie van specifieke morphogens en, dus, door de staat van de chromatine van het DNA. In een vereenvoudigde weergave, kunnen chromatine-Staten worden onderverdeeld in euchromatine als transcriptionally actief en heterochromatin als transcriptionally stille gebieden. De nucleosoom als de basiseenheid van de chromatine bevat twee kopieën van elke kern Histon H2A, H2B, H3 en H4, omringd door 147 basenparen van DNA13. Histonen zijn zeer post-translationally gewijzigd door methylering, acetylation, fosforylatie, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, deamination en proline isomerisatie14,15. Histon lysine methylering wordt beschouwd als de meest stabiele Histon wijziging die transcriptie, replicatie, recombinatie16, DNA-schade antwoord17en genomische inprenting18 besturingselementen. Lysines worden mono-, di- en tri-gemethyleerd19 en verschijnen niet alleen op de staarten toegankelijk Histon, maar ook binnen het bolvormige domein van histones20. Specifieke methyleringen op H3K4 en H3K36 worden vooral geassocieerd met euchromatine, specifieke methyleringen op H3K9, H3K27 of H4K20 zijn voornamelijk te vinden in de hétérochromatique regio's, hoewel alle residuen bevinden zich binnen de Histon staart14, 19,21. Methylation van H3K79 is bevindt zich in het bolvormige domein van Histon en geassocieerd met een transcriptionele activiteit, maar ook met transcriptionally inerte genomic regio22. De wijziging is evolutionair bewaard aangezien geconstateerd in gist, kalf zwezerik, kip en menselijke23. H3K79 mono-, di- en trimethylation (H3K79me1, me2, me3) worden gekatalyseerd door de Histon methyltransferases DOT1L24,25 en de nucleaire SET Domain-bevattende eiwitten 2 (Nsd2)26. DOT1L is betrokken bij de proliferatie, DNA-reparatie en mobiele reprograming27. Verlies van Dot1l in muizen leidt tot een prenatale dood rond de ontwikkelingsstadium E10.528,29. Tijdens de ontwikkeling van het hart en bij myocardiocyte differentiatie is DOT1L essentieel voor gen expressie verordening30. In het centrale zenuwstelsel, DOT1L functie kan worden betrokken bij de neurale buis ontwikkeling31, het is betrokken bij het onderdrukken van Tbr1-expressie tijdens reukkolf ontwikkeling32, en kan functioneren in de regulering van ER-stress reactie genen33. De context-afhankelijke activeren of de actie van de bestrijding van H3K79me, vooral met in vivo situaties zoals de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel, is tot nu toe slechts gedeeltelijk begrepen32. Aangezien H3K79 methylering zich in het bolvormige gebied van Histon 3 bevindt, is het sterically minder toegankelijk in vergelijking met wijzigingen op de flexibele Histon staarten23. Om te begrijpen van de functie van H3K79 methylering, zijn betrouwbare en reproduceerbare analysemethoden ter bepaling van de locatie en de genomische omgeving nodig. In deze paper methoden presenteren wij isolatie methoden van verschillende neurale progenitoren (CPC voor de cortex) en CGNPs voor het cerebellum, effectieve DOT1L remmer behandeling en een ChIP-methode voor het analyseren van methylation van H3K79 via qPCR of rangschikken op ander moment punten tijdens corticale en Cerebellaire ontwikkeling. Voor een overzicht van het protocol en de mogelijkheden, Zie Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierenwelzijn commissies van de Universiteit van Freiburg en de plaatselijke instanties goedgekeurd alle dierproeven (G12/13, G16/11) vermeld in het volgende protocol.

1. voorbereiding

  1. Voorbereiding van de CPC's isolatie
    1. Instellen getimede paring om te verkrijgen van embryo's in de verschillende stadia van ontwikkeling van de cortex (tussen E11.5 en E14.5). Gebruik de muizen van de stam NMRI (Naval Medical Research Institute), die ten minste 8 oud weken. Na de paring, overwegen een positieve vaginale stekker aan E0.5.
    2. Als u genoeg materiaal, gebruikt u een nest van NMRI muizen voor een H3K79me2 ChIP van cortices van E12.5 of E14.5. Voor later embryonale stadia, gebruiken een nestje voor meer ChIP analyses (gemiddelde nest grootte NMRI: 10 embryo's).
    3. Precool Hank´s evenwichtig zout oplossing (HBSS) en -fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 4 ° C (langetermijnopslag op RT).
    4. Equilibreer de 4 ° C opgeslagen trypsine-EDTA (0.05% w/v) tot 37 ° C.
    5. Voorbereiden corticale-cel medium (CCM): Het medium voor neuronen (Zie Tabel van materialen) aan te vullen met de eindconcentraties van 2% (v/v) B-27 supplement, 5 µg/mL Apo-transferrine 1 µg/mL glutathion, 0.5 mM L-glutamine, 0.8 µg/mL Superoxide dismutase en 1% (v/v) Penicilline-streptomycine-neomycine antibiotica mengsel. Bewaren bij 4 ° C. Voor het experiment equilibreer middellange tot 37 ° C.
    6. Foetaal kalfsserum (FCS), aliquoot ontdooien het (50 mL elk), en equilibreer één aliquot tot 37 ° C (langetermijnopslag bij-20 ° C).
    7. Voorbereiden op voorraden DNAse 1 (10 mg/mL) in H2O celkweek. Winkel aliquots bij-20 ° C.
    8. Indien nodig, los van de specifieke DOT1L-remmers EPZ-5676 of SGC0946 in DMSO een voorraad concentratie van 100 mM. De concentratie van een einde van 1-5 µM toepassen op de cellen op dag 0 en toepassen van de Inhibitor van de omwenteling om de twee dagen.
    9. Jas voor CPC-teelt, cel cultuur platen (6 goed of 12 goed) met poly-L-ornithine hydrobromide (1 mg/mL in 150 mM boorzuur pH 8.4) gedurende ten minste 1 uur op RT en daarna met laminin (1 mg/mL) in CCM medium bij 37 ° C's nachts.
  2. Preparaten voor CGNP isolatie
    1. Organiseer een passende paring van muizen voor het genereren van P5-P7 dieren voor het isoleren van het cerebellum (3-5 dieren per ChIP en conditie).
    2. Bereiden HBSS/Glucose door toevoeging van 6 mg/mL glucose aan HBSS buffer.
    3. Bereid de CGNP cel kweekmedium (CGM) door toevoeging van 1% (v/v) N2 supplement, 1% (v/v) penicilline-streptomycine-neomycine, 25 mM KCl en 10% FCS tot DMEM-F12. Voor CGNP teelt bereiden CGM medium zonder FCS maar met inbegrip van 0,6 µg/mL sonic hedgehog (SHH) (CGM-SHH) en equilibreer het tot 37 ° C wanneer nodig.
    4. Jas 6-well cel cultuur platen met 100 µg/mL poly-D-lysine voor 1-2 h op RT voor glia cellen verwijderen. Daarna wassen tweemaal met steriele ddH2O en laat de platen droog. Opslaan van de platen gedurende maximaal één week bij 4 ° C.
    5. Voor de teelt van CGNPs vacht 6-well cel cultuur platen met poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) bij 4 ° C overnachting. Daarna wassen tweemaal met H2O voor celkweek en laat de platen droog.
      Opmerking: De platen kunnen worden opgeslagen voor maximaal een week bij 4 ° C.
    6. Bereiden van 0,025% trypsine (w/v) in HBSS/Glucose en equilibreer het tot 37 ° C wanneer nodig.
  3. Voorbereiding van de ChIP van H3K79me2
    1. PFA (1% in PBS, pH 8) vers bereiden voordat crosslinking chromatine. Om voor te bereiden Verwarm PFA 50 mL PBS in de magnetron tot maximaal 65 ° C. Voeg 0,5 mg PFA naar de PBS tijdens constant roeren. Voeg vervolgens toe 50 µL 10 M NaOH en wachten tot PFA wordt ontbonden. Daarna, voeg 42.5 µL HCl (37% v/v) om een pH van 8. Controleer de pH opnieuw en laat de 1% PFA oplossing bereiken RT.
    2. Voorraden voor te bereiden inzake RNase (1 mg/mL) en proteïnase K (20 µg/µL) afzonderlijk in steriele ddH2O. bewaren de aliquots bij-20 ° C.
    3. Voorbereiding van de volgende buffers en reagentia: PBS met 0,02% Tween, Lysis-buffermengsel, Glycine, verdunning buffer, ChIP buffer 1, ChIP buffer 2 ChIP buffer 3 en TE buffer en hen bewaren bij 4 ° C. Bereiden de elutie buffer vers telkens.
      1. Bereiden van PBS met 0,02% Tween. Wachten op de meeste één week bij 4 ° C.
      2. Lysis-buffermengsel met behulp van 50 mM Tris op pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% (m/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS) en 1 x proteaseinhibitor voor te bereiden.
      3. Bereiden van 2,5 M glycine.
      4. Bereiden verdunning buffer met 20 mM Tris op pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0,25% (m/v) SDS en 1 x proteaseinhibitor.
      5. ChIP buffer 1 met behulp van 20 mM Tris op pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, en 0.2% (m/v) SDS voorbereiden.
      6. ChIP buffer 2 met 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, en 0.2% (m/v) SDS voorbereiden.
      7. ChIP-buffer 3 met 20 mM Tris pH 8.0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40, en 1% (m/v) SDS voorbereiden.
      8. Voorbereiden TE buffer met behulp van 20 mM Tris pH 8,0 en 2 mM EDTA.
      9. Bereiden van verse elutie buffer met 1% (m/v) SDS, 100 mM NaHCO3.

2. neurale Progenitor isolatie van hersenweefsel

  1. Isolatie en optionele teelt van CPC 's
    1. De drachtige dieren door cervicale dislocatie euthanaseren en transfer van de embryo's naar ijskoude HBSS.
    2. Verwijderen van de schedel met een schaar en het isoleren van de hersenen, dan het verwijderen van de hersenvliezen, indien van toepassing, met kleine pincet en isoleren cortices (geheel, DT, of VT) van beide halfronden door het verwijderen van alle andere hersenen delen onder de binoculair scope met behulp van kleine pincet en, indien nodig, kleine schaar. Bewaar de geïsoleerde cortices in 5 mL HBSS buffer bij 4 ° C in een tube van 15 mL.
    3. Centrifugeer het geïsoleerde hersenen materiaal voor 5 min op 1000 x g- en 4 ° C.
    4. Wassen van de cortices met 5 mL ijskoud HBSS en meng ze met een 1 mL pipet tip door pipetteren omhoog en omlaag. Indien nodig, knip het uiteinde van de pipet-tip.
    5. Centrifugeer het gehomogeniseerde monster gedurende 5 minuten op 1000 x g- en 4 ° C. Verwijder de HBSS.
    6. Voeg 3 mL trypsine en Incubeer het monster gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    7. 1 mL FCS, 5 mL CCM en 30 µL van DNase 1 Voeg aan het monster en meng het monster met een 5 mL glazen pipet door pipetteren zorgvuldig op en neer.
    8. Centrifugeer de geïsoleerde cellen gedurende 5 minuten bij 1000 x g- en 4 ° C. Vloeistof wordt weggeworpen, voeg 5 mL CCM en meng het monster opnieuw.
    9. Verdun een aliquoot gedeelte van het monster en het rekenen met een Neubauer tellen-kamer. Een gemiddeld bedrag van 4,5 x 106 cellen per embryo wordt verwacht. Voor de teelt van het geïsoleerde CPCs gaat u verder met stap 2.1.10. Voor ChIP, onmiddellijk gaat u verder met stap 3.
    10. Voor teelt, plaat het CPCs poly-L-ornithine (0,1 mg/mL) en laminin (1 mg/mL) bekleed gerechten bij een dichtheid tussen de 8 x 104 en 2,5 x 105 cellen/cm2 in CCM medium en hen Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2en 100% relatieve vochtigheid.
    11. Omdat het CPCs begint te onderscheiden in de neuronen in de cultuur van de cel (na ongeveer 4 dagen), overwegen de dissectie datum als dag in vitro 0 (dag 0). Voor langere termijnen van teelt, wijzigen de helft van het medium elke vierde dag met verse CCM medium.
    12. 1-5 µM van toepassing SGC0946 of EPZ5676 opgelost in DMSO op dag 0 (4-5 uur na de isolatie van de cel) en vernieuw het elke tweede dag. DMSO gebruiken als een controle behandeling. Het testen van de efficiëntie van de Inhibitor van de omwenteling behandeling via standaard immunoblot methoden, indien nodig.
  2. Isolatie en optionele teelt van CGNPs
    1. Euthanaseren P5-7 dieren door onthoofding met behulp van schaar. Verwijderen van de hoofdhuid huid, open de schedel en de hersenen met behulp van kleine schaar en pincet te verwijderen. Isoleren van het cerebellum en overbrengen naar de ijskoude HBSS/Glucose. Verwijder alle hersenvliezen en bloedvaten en breng de cerebella in 15 mL buizen gevuld met koude HBSS/Glucose.
    2. Wassen van de cerebella drie keer met 10 mL ijskoude HBSS/Glucose (verzamelen door centrifugeren bij 650 x g gedurende 5 min bij 4 ° C) en cerebella vervolgens Meng door zachtjes op en neer met een pipet 1 mL pipetteren (maximaal 2 - 3 keer) om 0,5-1 mm3 fragmenten.
    3. Voeg 5 mL van 0,025% trypsine in HBSS/Glucose en Incubeer het weefsel onder constant roeren in een waterbad 37 ° C gedurende 15 minuten Stop de spijsvertering door toevoeging van 5 mL van CGM en verzamelen van het weefsel door centrifugeren bij 650 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
    4. Verwijder het supernatant en triturate van het weefsel met een uiteinde van de pipet 1 mL in 1 mL CGM en overbrengen naar een nieuwe tube van 15 mL.
      Opmerking: Het is belangrijk te voorkomen dat luchtbellen.
      1. Voeg 5 mL CGM en Incubeer het mengsel gedurende 2 minuten op ijs te regelen de restanten van het weefsel. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe tube van 15 mL. Voeg 2 mL CGM aan het resterende weefsel en herhaal de procedure verpulvering.
    5. De supernatants (zonder resten weefsel, ongeveer 10 mL in totaal) en centrifugeer bij 650 x g gedurende 5 min bij 4 ° C voor het verzamelen van de cerebellaire cellen. Resuspendeer de pellet in 10 mL CGM.
    6. Aangezien de astrocyten houden sneller en sterker aan poly-D-lysine dan CGNPs, plaat de cellen op 100 µg/mL poly-D-lysine gecoate 6-goed-platen (maximaal 4 mL per putje) en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C te verwijderen van de astrocyten.
    7. Schud de plaat en het verzamelen van de bovendrijvende substantie. Centrifugeer dan bij 650 x g gedurende 5 min bij 4 ° C in een tube van 15 mL. Resuspendeer de pellet in 10 mL CGM en cellen tellen met een Neubauer tellen kamer.
      Opmerking: CGNPs zijn ronde, klein, en tonen een halo wanneer beeld met fase contrast microscopie.
    8. Als vereiste, zaad cellen in 37 ° C opgewarmd vooraf CGM op poly-L-ornithine-gecoate platen (3 x 106 cellen per 6-well) en hen Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 en 100% relatieve vochtigheid.
      Opmerking: Als zaaien is niet uitgevoerd, gaat u verder met stap 3.1.
      1. Na 6-12 h, de middellange tot CGM-SHH uit te wisselen. Behandelen van de geïsoleerde CGNPs 6 h (of bij de overgang naar CGM-SHH) na isolatie met een DOT1L-remmer en DMSO besturen en vernieuwen elke tweede dag (vergelijk met 2.1.12). Het testen van de efficiëntie van de Inhibitor van de omwenteling behandeling via standaard immunoblot methoden indien nodig. Voor ChIP, gaat u verder met stap 3.3.
        Opmerking: CGM verlaten op de platen (en met die FBS) zal leiden tot differentiatie van de CGNPs in cerebellaire granulaire neuronen (CGNs).

3. fixatie van de cellen en het afknippen van de chromatine

Opmerking: Voer stap 3.1 en 3.2 als cellen worden niet gekweekt, als ze doorgaan naar stap 3.3.

  1. De cellen verzamelen door centrifugeren voor 4 min op 1000 x g en voeg 1.3 mL PBS. Het monster overbrengen in een 1,5 mL-buis. Centrifugeer gedurende 4 min bij 1.000 x g bij 4° C. Het wassen van het monster twee keer met 1.3 mL PBS.
  2. Kritieke stap: Voeg 350 µL 1% PFA aan het monster en het Incubeer gedurende 5 min bij 22 ° C. Om te stoppen met de reactie, 18.4 µL glycine en 1 mL PBS toevoegen. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 1.000 x g bij 4 ° C.
    1. Het wassen van het monster twee keer met ijskoude PBS. De vaste cellen verzamelen door centrifugeren voor 5 min op 1000 x g- en 4 ° C. Houd de monsters op ijs van nu af aan.
      Opmerking: De tijd van de fixatie moet precies 5 min om optimale resultaten te krijgen. Verschillende cel nummers kan tijd aanpassing nodig is.
  3. Kritieke stap: Aan gekweekte CGNPs (of CPC), tot 1 mL toevoegen 1% PFA rechtstreeks naar de cel cultuur plaat putten. Na een 5 minuten incubatie bij 22 ° C, voeg een passend bedrag van glycine en PBS en oogsten van de cellen met een cel schraper.
    1. Breng de cellen in 1,5 mL buizen en Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten op 1000 x g- en 4 ° C. Het wassen van het monster twee keer met ijskoude PBS. De vaste cellen verzamelen door centrifugeren voor 5 minat 1000 x g bij 4 ° C. Houd de monsters op ijs van nu af aan.
  4. Kritieke stap: Voeg 700 µL van lysis-buffermengsel (+ proteaseinhibitor) en Incubeer het monster gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Vortex het monster elke 5 min. schuintrekken de chromatine van de lysed cellen 3 x 10 min in het ultrasoonapparaat (30 s puls, 30 s pauze) bij maximumvermogen.
    1. Zorg ervoor dat het volume niet meer dan 350 µL per buis. Vortex de monsters elke 10 min. controleren de lysate voor resterende kernen met een Microscoop fase contrast.
      Opmerking: Het is belangrijk om optimale schuintrekken resultaten (in vergelijking met figuur 1B) voor latere analyse. Optimaliseer de schuintrekken naar fragmenten van de chromatine formaat tussen 200-500 bp in geval van met behulp van andere methoden voor het scheren van de chromatine.
  5. Pellet cel restanten voor 10 min, 13.000 x g, 4 ° C. Gebruik het supernatant voor de preclearing stap 5.2. Bevriezen van het monster bij-20 ° C voor later gebruik, indien nodig.

4. voorbereiding van de kralen en Preclearing

  1. Wassen van 45 µL EiwitA magnetische kralen/ChIP en 20 µL magnetische kralen/monster met 1 mL ijskoud PBS met 0,02% Tween driemaal een magnetische standaard gebruiken. Dan, voeg 1 mL ijskoud PBS aan de kralen.
  2. Voeg 1 mL ijskoud PBS en 45 µL kralen/ChIP, 3 µg antilichaam/ChIP (H3K79me2 of konijn IgG). Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij 4 ° C op een rotator te binden de antilichamen aan de kralen. Afhankelijk van het antilichaam, ~ 3 µg antilichaam/spaander te gebruiken.
  3. Spoel de antilichaam-gebonden-kralen driemaal met 1 mL ijskoud PBS met 0,02% Tween. Het volume van de passende kraal (vanaf volume van magnetische kralen gebruikt) van de ijskoude PBS aan de gewassen antilichaam-combinatie-kralen toevoegen.
  4. 600 µL van verdunning buffer en 20 µL van gewassen magnetische kralen Voeg aan het monster voor de preclearing (totale volume 1.320 µL) en incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C op een rotator. Verwijder de parels een magnetische standaard gebruiken. 5% (33 µL) van de lysates als input monsters nemen en bevriezen ze bij-20 ° C.

5. chromatine Immunoprecipitation

  1. Het precleared extract verdelen in twee buizen (ongeveer 643.5 µL), voeg een gelijk volume verdunning buffer en de antilichaam-gebonden-beads (45 µL/monster; H3K79me2 of konijn IgG). Incubeer de monsters bij 4 ° C's nachts op een rotator.
  2. Het wassen van de kralen met ijskoude ChIP buffer 1, ChIP buffer 2 en ChIP buffer 3 voor elke 10 min bij 4 ° C op een rotator. Spoel daarna driemaal met TE buffer voor 5 min bij 4 ° C op een rotator.
  3. Elueer de kralen met elutie buffer gedurende 1 uur bij 1400 t/min in een shaker bij kamertemperatuur.
  4. 10 µg RNase (1 mg/mL) per ChIP monster en 5 µg toevoegen aan de input monsters en Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 ° C (1400 rpm).
  5. Toevoegen van 100 µg proteïnase K (20 µg/µL) per ChIP monster en 50 µg per ingang en na een nacht bebroeden bij 65 ° C bij 1400 t/min.

6. zuivering van ChIP monsters

  1. Zuiveren van de ChIP en de input monsters met een DNA-zuivering kit (Zie Tabel van materialen) volgens de handleiding. Kolomsgewijs meer zuivering wanneer meer dan 5 µg van DNA wordt verwacht. Elueer de steekproef met 2 x 15 µL van de DNA elutie buffer geleverd in de kit.
  2. Kwantificering van de monsters (gebruik 1 µL) uitvoeren met behulp van een visualiseren fluorophore en een fluorospectrometer (Zie Tabel van materialen).

7. de analyse van monsters van de ChIP via qPCR

  1. Ophalen voor primer design for qPCR analyse, genomic opeenvolgingen van belang van de integratieve Genomics Viewer (IGV) browser34. Inleidingen rond de transcriptionele start site (TSS) van een gen, ontwerpen, want H3K79me2 is waarschijnlijk gelegen om daar te zijn. Een besturingselement, kunt u overwegen niet-coderende genomic regio's of regio's ongeveer 10 Kb stroomopwaarts van de TSS of 10 Kb stroomafwaarts van het transcriptionele einde site (TES).
    1. Genereren van de inleidingen met https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ met behulp van voorinstelling voor de grootte van een product tussen 70 en 200 bp en een optimale temperatuur van 60 ° C. Voor de doeleinden van het proces, door inleidingen voor de genomic regio's Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, en Npm1 vermeld in tabel 1te gebruiken.
  2. Testen van nieuw ontworpen inleidingen met het volgende programma van de qPCR, master mix en een onthardende temperatuur verloop tussen 58 ° C en 63 ° C, en selecteer de onthardende temperatuur met de hoogste product kwantiteit en kwaliteit.
    1. Elektroforese van het gel van DNA om te bepalen van de grootte van de verwachte product van toepassing. P.a. van qPCR, het gebruik van een Real-Time PCR detectiesysteem (Zie Tabel van materialen).
    2. Voorbereiding van de master mix met 10 µL polymerase van DNA master mix, 0,5 µL primer naar voren (10 µM), 0,5 µL primer omgekeerde (10 µM), 4 µL nuclease-gratis water en 5 µL DNA (1 ng/µL).
    3. Gebruik een programma 2-step qPCR als volgt: 5 min bij 95 ° C, 50 x (30 bij 95 ° C, 30 s s bij 58 ° C - 63 ° C), en denaturatie verloop voortdurend bij 4 ° C.
  3. Maken van een verdunningsreeks van genomic, sheared, gezuiverde DNA-monsters (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL en 0,125 ng/µL) en gebruiken 5 µL voor een test van de efficiëntie met behulp van qPCR. Bepaal de helling van de standaard curve en de efficiëntie van de primer berekenen door de volgende formule:
    Rendement (%) = (10-^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Inleidingen gebruiken met efficiëntie tussen 90 en 105% in een ideaal geval, of ten minste met efficiëntie tussen 85% en 115%.
  4. Om de ChIP- en input monsters te analyseren, 0,1-1 toepast ng van ChIP DNA gemengd met respectieve forward en reverse primer, nuclease-gratis water en meester van de polymerase van DNA mengen in een eindvolume van 20 µL voor elke reactie qPCR.
  5. Bepalen van de drempelwaarden van de cyclus (Ct) van ChIP en input monsters en normaliseren van het monster, Ct tot Ct -waarden van input voor het berekenen van verrijking (% input) met de volgende formule. Gebruik Ct waarden, verkregen uit IgG controle om te bepalen van het achtergrondniveau.
    % input = 100-2^(norm. input − norm. ChIP)
    norm. invoer = Ct (input) − log2(verdunningsfactor)
    norm. ChIP = Ct (ChIP) − log2(verdunningsfactor)
    Opmerking: norm. = genormaliseerde

8. analyse van ChIP monsters via Sequencing

  1. De ChIP monsters (input en immunoprecipitated DNA-monster) overbrengen in een volgorde faciliteit.
  2. Ter voorbereiding van een bibliotheek vooraf, gebruik een passende bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen) en converteren van 2 ng van de input DNA en alles van het DNA van de immunoprecipitated in geïndexeerde bibliotheken voor de volgende generatie multiplex rangschikken op de aangegeven platform (Zie Tabel van materialen).
  3. Kritieke stap: Volg de instructies van de kit, afbinden sequencing adapters (met een concentratie van de werken van 15 µM) ter afsluiting van de gerepareerde en dA-tailed DNA-fragmenten. Voor sequencing adapters en PCR gebruikt inleidingen passende oligos (Zie Tabel van materialen). Gebruik voor deze hoeveelheid input DNA, 6-9 PCR cycli te verrijken adapter afgebonden DNA-fragmenten.
    Opmerking: Het is normaal gesproken niet nodig voor het uitvoeren van een selectie van de grootte van de adapter afgebonden DNA. Het is het beste om te gebruiken, zo weinig cycli van PCR mogelijk, aangezien veel resultaat van de cycli van PCR versterking in PCR duplicaten en een hoge GC bias.
  4. Nemen voor een definitieve bibliotheek check, 0,5 µL van de totale reactie p.a. te visualiseren grootteverdeling op een geschikte inrichting (Zie Tabel van materialen). Kwantificering, gebruiken een visualiseren kleurstof in combinatie met een fluorospectrometer of andere methoden (Zie Tabel van materialen).
  5. Aangezien H3K79me2 lijkt te worden van een wijziging van Histon, die in grote lijnen grotere regio genomic's is gespreid, volgorde van de monsters gekoppeld-einde met een lees lengte van 50 bp en met een diepte van de sequencing van 75 Mio leest.
  6. Het analyseren van de gegevens van de ChIP-seq met de Galaxy/Uni Freiburg Server (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Uitvoeren van kwaliteitscontrole met verkregen ChIPseq met FastQC en, in voorkomend geval, kaart hen rechtstreeks met Bowtie2 versie 2.2.035 met of zonder trimmen. Als referentie gebruiken genoom vergadering mm9 of de nieuwste versie mm10; en als referentie aantekening Ensembl FTP laat 79.
  8. Optioneel: Verwijder duplicaten met behulp van Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) alvorens leest piek roeping.
  9. Bel pieken met MACS2 versie 2.1.036 met behulp van de "globale" optie voor H3K79me2.
  10. Voor het verkrijgen van een logboek2 verhouding tussen ChIP en input monster, de log-2 van het aantal leesbewerkingen van de luidt gebruiken de verhouding van beide monsters BamCoverage en BamCompare.
  11. Voor alle andere ChIP-seq specifieke diepteanalyse, gelden deepTools2 versie 2.3.5 of 2.4.137, dat wil zeggen dekking track om dossiers te produceren (bamCoverage voor de ChIP alleen, bamCompare voor vergelijking van ChIP aan op de ingang), voor het inschatten van de ChIP prestaties gebruiken plotFingerprint en voor het genereren van een algemeen overzicht computeMatrix, plotHeatmap. K-gemiddelde clustering tijdens het computeMatrix aan de genomic regio's volgens de H3K79me2 verdeling cluster selecteren
  12. Gebruik gepubliceerde ChIP-seq gegevens als H3K79me2 van E14.5 DT gedeponeerd bij NCBI voor verhoor doeleinden (toetreding nummer: SRP057733).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Opzet van neurale voorlopercellen isolatie, teelt, H3K79me2 ChIP en ChIP analysemethoden: Figuur 1 toont een stroomdiagram voor het uitvoeren van H3K79me2 ChIP van corticale voorlopercellen op verschillende tijdstippen tijdens de embryonale hersenontwikkeling of cerebellaire granulaire neuron progenitoren in postnatale stadia. Als een eerste stap, de hersenen moet worden geïsoleerd en de telencephalon (tussen E11.5 en E14.5) of het cerebellum...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn twee belangrijke manieren voor het uitvoeren van de chromatine immunoprecipitation om te ontdekken de genomic bezetting van Histon modificaties, transcriptiefactoren, histone code lezers, schrijvers of gummen. Een is de inheemse ChIP methode met behulp van de nuclease verteerd, inheemse chromatine voor immunoprecipitation, en anderzijds de onderhavige methode met PFA-vaste, sheared chromatine, waarin de nucleosomes en andere DNA-ingeschrevenen eiwitten wijze aan het DNA covalente 39. nativ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben

Dankbetuigingen

We bedanken Henriette Bertemes voor het helpen om het protocol van de teelt van CGN in het lab. Deze methode papier werd gesteund door de Medische epigenetica DFG-gefinancierde CRC992 door financiering van TV. De auteurs erkennen de steun van het Team van de Melkweg Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning en Prof. Rolf Backofen, bio-informatica, Universiteit van Freiburg, Duitsland gefinancierd door Collaborative Research Centrum 992 Medische epigenetica (DFG grant SFB 992/1-2012) en het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (goedgekeurd subsidie 031 A538A RBC (de. NBI)).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x)Life Technologies17504044Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategory: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acidSERVA39760.01Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v)Gibco10082147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
GlucoseSigma-AldrichG5767Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
GlycineCarl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
LamininSigma-AldrichL2020Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chlorideSigma-AldrichL4408Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplementLife Technologies17502048Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal mediumGibco21103049Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
ParaformaldehydeCarl Roth335Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered salineLife Technologies10010023Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis

Referenties

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485(2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137(2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cerebellaire granulaire neuronprogenitorencorticale progenitorcellenweefseldigestiecelkweekflowcytometrieWestern blotqPCR analyse
Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.