Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes

12K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56647

⸱

5 februari 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een in vitro live-imaging fagocytose assay voor het meten van de fagocytische capaciteit van astrocyten. Gezuiverde rat astrocyten en microglia worden gebruikt samen met pH-indicator-geconjugeerd synaptosomes. Deze methode kan detecteren real-time engulfment en afbraak kinetiek en biedt een platform geschikt screening om te identificeren factoren moduleren Astrocyt fagocytose.

Samenvatting

Astrocyten zijn de grote celtype in de hersenen en direct contact opnemen met synapsen en bloedvaten. Hoewel microglial cellen zijn aangemerkt de belangrijke immune cellen en alleen fagocyten in de hersenen, de recente studies hebben aangetoond dat astrocyten ook deelnemen aan diverse fagocytische processen, zoals ontwikkelingsstoornissen synapse opheffing en de ontmijning van bèta amyloid plaques in de ziekte van Alzheimer (AD). Ondanks deze bevindingen is de efficiëntie van Astrocyt engulfment en aantasting van hun doelstellingen onduidelijk vergeleken met die van microglia. Dit gebrek aan informatie is vooral te wijten aan het ontbreken van een systeem van de bepaling waarin de kinetiek van Astrocyt - en microglia-gemedieerde fagocytose gemakkelijk vergelijkbaar zijn. Om dit te bereiken, hebben we een lange termijn live-imaging in vitro fagocytose assay om te evalueren van de fagocytische capaciteit van gezuiverde astrocyten en microglia ontwikkeld. In deze test is real-time detectie van engulfment en aantasting mogelijk met behulp van de pH-indicator-geconjugeerde synaptosomes, die uitstoten van heldere rode fluorescentie in zure organellen, zoals lysosomen. Onze nieuwe assay biedt eenvoudige en doeltreffende opsporing van fagocytose via live-imaging. Daarnaast kan deze fagocytose in vitro assay worden gebruikt als een screening platform om chemische stoffen en verbindingen die kunnen verbeteren of remmen de fagocytische capaciteit van astrocyten te identificeren. Zoals synaptic snoeien storing en pathogene eiwit accumulatie is gebleken psychische stoornissen of neurodegeneratieve ziekten veroorzaken, moet chemicaliën en verbindingen die de fagocytische capaciteit van gliale cellen moduleren nuttig zijn bij de behandeling van verschillende neurologische stoornissen.

Inleiding

Gliale cellen, die naar niet-prikkelbaar cellen in de hersenen verwijzen, zijn de grote celtype in het centrale zenuwstelsel (CNS). Eerder, gliale cellen werden beschouwd als louter ondersteunende cellen die voornamelijk spelen een passieve rol bij het handhaven van de basale synaptic eigenschappen en neuronale overleven. Echter, opkomende bewijs heeft geopenbaard dat gliacellen spelen een actiever rol in verschillende aspecten van neurobiologie, zoals behoud van hersenen homeostase, synaps formatie,1,,2,3 en synapse bemiddelen eliminatie4,5, en modulerende synaptische plasticiteit6,7. Gliale cellen in het VNV zijn astrocyten, microglia en oligodendrocyten. Onder deze cellen, astrocyten en microglia gebleken fagocytische rol spelen door Djaja synapsen4,5, apoptotic cellen8, neurale puin9en pathogene eiwitten, zoals bèta amyloid plaques10,11. In de ontwikkelende hersenen elimineren astrocyten synapsen in de dorsale laterale geniculate kern (dLGN) t/m4fagocytose MERTK - en MEGF10-afhankelijk. Evenzo, microglia ook elimineren C1q beklede synapsen tijdens ontwikkelingsstadia tot en met de klassieke complement cascade5. Interessant, is er gesuggereerd dat gebreken in de synaps snoeien kunnen bestaan uit een van de initiatiefnemers van verschillende neurologische stoornissen. Het heeft bijvoorbeeld aangetoond dat mutaties in aanvulling onderdeel 4 (C4), waardoor aanvulling-bemiddelde synapse snoeien door microglia, sterk geassocieerd met de prevalentie van schizofrenie in mens12 zijn. Een recent document heeft ook aangetoond dat de klassieke complement pathway hyperactivated in de stadia van de initiatie van AD is en vroege synapse verlies in deze ziekte13induceert.

Vergeleken met microglia-gemedieerde fagocytose, is of Astrocyt-gemedieerde fagocytose bijdraagt tot de inleiding en de progressie van verschillende neurologische aandoeningen minder duidelijk. Echter, een recente papier suggereert dat factoren die veranderen van het tempo van de normale synapse snoeien door astrocyten kunnen hersenen homeostase te verstoren en aan AD gevoeligheid en pathologie14 bijdragen. Het tempo van de synaps snoeien door astrocyten wordt krachtig gecontroleerd door ApoE isomeren, met een beschermende allel voor AD (ApoE2) sterk verbeteren van het tarief en de allel van een risico voor AD (ApoE4) aanzienlijk verlagen het tarief. Bovendien, transgene muizen uitdrukken ApoE4 verzameld veel meer synaptic C1q dan controle of ApoE2 muizen14. Deze gegevens duiden erop dat verminderde Astrocyt-gemedieerde fagocytose in de vroege AD hersenen veroorzaken de accumulatie van verouderend C1q beklede synapsen/synaptic puin dat aanvulling-bemiddelde microglial fagocytose activeert, rijden van de degeneratie van synaptic . De verminderde fagocytische capaciteit van astrocyten bij ApoE4 vervoerders kan ook bijdragen aan de ongecontroleerde accumulatie van bèta amyloid plaques in de hersenen die getroffen zijn door AD.

Daarnaast is gebleken dat gliale cellen in de hersenen Drosophila leeftijd hun fagocytische vermogen als gevolg van verminderde vertaling van Draper, een homolog van Megf10 die astrocyten gebruiken verliezen voor het phagocytosing van de synapsen. Herstel van Draper niveaus redde de fagocytische capaciteit van gliale cellen, die efficiënt beschadigde axonale puin in de leeftijd hersenen in vergelijkbare mate als die in de jonge hersenen gewist, die aangeeft dat veroudering-geïnduceerde veranderingen in de fagocytische capaciteit van astrocyten kunnen bijdragen aan een verstoring van de hersenen homeostase15.

Op basis van deze nieuwe bevindingen, moduleren van de fagocytische capaciteit van astrocyten mogelijk een aantrekkelijke therapeutische strategie ter preventie en behandeling van diverse neurologische aandoeningen. In dit verband zijn er verschillende pogingen ondernomen om het verbeteren van de fagocytische capaciteit van astrocyten, bijvoorbeeld door verzuring van lysosomen met zure nanodeeltjes16 inducerende en overexpressing van de transcriptiefactor EB (TFEB), die kan verbeteren lysosoom biogenese17. Ondanks deze pogingen is het nog onduidelijk hoe de astrocyten en microglial cellen in hun fagocytische kinetiek verschillen en of we moeten vergroten of hun fagocytische capaciteiten in de verschillende ziekten verkleinen.

In deze paper presenteren we een nieuwe in vitro assay voor het opsporen van de fagocytische capaciteit van astrocyten in real-time. De gegevens wijzen verschillende kinetiek van engulfment en aantasting van astrocyten en microglia. Astrocyt-geconditioneerd medium (ACM), dat secreted factoren van astrocyten bevat, is essentieel voor effectieve fagocytose van astrocyten zowel microglia. Bovendien, Megf10, een fagocytische receptor in astrocyten en een homolog van Ced-1 en Draper, speelt belangrijke rol in Astrocyt-gemedieerde fagocytose8,18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Korea-geavanceerde Instituut voor wetenschap en technologie institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC), KA2016-08.

1. synaptosome zuivering

Opmerking: Deze procedures worden aangepast van een eerder gepubliceerde papier19 met verschillende wijzigingen ter verbetering van het rendement van gezuiverde synaptosomes (Figuur 1).

  1. Discontinue dichtheid kleurovergang media voor te bereiden.
    1. Plaats het volgende op het ijs: 3%, 10% en 23% dichtheid kleurovergang oplossingen in kleurovergang buffer (breng aan 250 mL water met 109.54 g van sacharose, 606 mg van Tris en 5 mL van 0,2 M EDTA, pH 7.4); homogenisator buffer (Voeg 25 mL 4 x kleurovergang buffer en 500 µL van 50 mM DTT in 74.5 mL water); homogenizer mortier en een stamper.
      Opmerking: Dichtheid kleurovergang oplossing en voorbereiding zijn gepresenteerd in de tabel 1. Ter voorbereiding van 3%, 10% en 23% dichtheid kleurovergang oplossingen, ruwe dichtheid kleurovergang oplossing te gebruiken.
    2. Zes ultra-heldere centrifuge buizen per drie volwassen muizen voor te bereiden.
    3. Voeg 3 mL van 23% dichtheid kleurovergang-oplossing op de bodem van elke centrifugebuis met een pipet 1 mL. Dan, langzaam maar zeker een een laag met 10% dichtheid kleurovergang oplossing op de top van de kleurovergang oplossing van 23% dichtheid met een grasland pipet en 1 mL pipet 3 mL. Ten slotte voeg 3 mL van 3% dichtheid kleurovergang-oplossing op de top. In deze stap voorzichtig om te voorkomen dat de invoering van de bubbels.
    4. Bedek de centrifuge buizen met plastic wrap en houden de buizen op ijs.
  2. Precool een high-speed centrifuge en ultracentrifuge tot 4 ° C.
  3. Steriliseren chirurgische apparatuur (bedrijfsresultaat schaar, Castroviejo voorjaar schaar en pincet gebogen) met 70% ethanol. Een klein glas bekerglas met 25 mL van de homogenisator buffer op ijs bereiden en wegen van het bekerglas.
  4. Pak de hersenen uit drie volwassene (ongeveer 12 weken oud) mannelijke muizen.
    1. Ontreddering van de cervicale wervel en snijd de nek met operationele schaar. De huid van het hoofd en schedel langs de middellijn met behulp van operationele schaar en pincet gebogen afschilferen. De bulbus bollen en cerebellum accijnzen met Castroviejo voorjaar schaar.
  5. De resterende hersenen gestoken in het bekerglas met een gebogen Tang en wegen van de hersenen. Spoel de hersenen verschillende malen met ijskoude homogenisator buffer om bloed op het oppervlak van de hersenen.
    Opmerking: Eerder, 9 mL homogenisator buffer à 1 g van hersenen weefsels werd aanbevolen.
  6. Voeg 4 mL buffer en 1 g hersenen tissues aan de homogenizer mortel homogenisatie. Terwijl de hersenen homogenisatie wordt toevoegen homogenisatie tot 8 mL buffer.
  7. Verdeel het homogenaat in twee 50 mL high-speed centrifuge buizen. Wassen van de mortel met 1 mL verse homogenisator buffer en toevoegen aan de buizen.
    Let op: Voer stappen 1.3-1.7 zo snel mogelijk. Minder dan 20 min wordt aanbevolen.
  8. Centrifugeer het homogenates in high-speed centrifuge buizen bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C met langzamere remmen.
    Opmerking: Stelt de vertraging tarief (rem) op twee of drie wanneer het maximumpercentage van de vertraging negen is.
  9. Zorgvuldig het supernatant toevoegen aan een nieuwe buis van 50 mL en voeg maximaal 12 mL homogenisator buffer.
  10. Zorgvuldig en langzaam Pipeteer 2 mL van de verdunde supernatant ten opzichte van de kleurovergang oplossing van 3% dichtheid met een 1 mL pipet en plaats de buizen op ijs.
  11. Centrifugeer bij 31.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C met geen remmen.
    Opmerking: Stelt de vertraging-tarief op een (nul) of kust.
  12. Plaatsen van de buizen op ijs en het verzamelen van de Fractie van de synaptosome tussen de 23% dichtheid kleurovergang oplossing en 10% dichtheid kleurovergang oplossing met een 2-mL pipet in een 50 mL-buis. Ijskoude sacharose/EDTA toevoegen tot 80 mL buffer en verdeel het in vier 50 mL high-speed centrifuge buizen.
    Opmerking: Zie Figuur 3 voor gespreide synaptosomes met gelabelde verlopen.
  13. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten op 4 ˚C met minder pauzes.
    Opmerking: Stelt de vertraging-tarief op twee of drie wanneer het maximumpercentage van de vertraging negen is.
  14. Zorgvuldig verwijderen van de bovendrijvende substantie met een pipet 1 mL, resuspendeer de pellet synaptosome met 1 mL isotone fysiologische buffer (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4en 10 mM HEPES 10 mM glucose, pH 7.4)20. Voeg 1 mL 10% DMSO in isotone fysiologische buffer (eindconcentratie van DMSO: 5%) en de synaptosomes verzamelen in één snelle centrifugebuis van 50 mL.
  15. Aliquot 1 mL in 1.5-mL buizen. Meet de eiwitconcentratie van de synaptosomes met behulp van de analyse van Bradford.
  16. Snel bevriezen van de buizen en bewaren van de buizen in een diepvriezer-80 ° C tot pH-indicator Woordherkomst en-opbouw.

2. pH Indicator Woordherkomst en-opbouw

  1. Centrifugeer 1.5-mL buisjes met synaptosomes bij 21,092 x g gedurende 3-4 min bij 4 ° C.
  2. Verwijder het supernatant, voeg 200 µL van 0,1 M Na2CO3 en mix goed door pipetteren.
    Opmerking: Na2CO3 toegevoegd om het verhogen van de pH als succinimidyl ester efficiëntst reageert met primaire amines op een alkalisch pH.
  3. Voeg 2 µL van pH-indicator om de buis en zachtjes vortex.
    Let op: Gebruik 1 µL van pH-indicator per 0.3 mg synaptosome oplossing.
  4. Blootstelling aan licht te minimaliseren door het bestuderen van de buizen met aluminiumfolie en hen Incubeer gedurende 1-2 uur op kamertemperatuur (RT) in een shaker twist met zachte agitatie bij 30 à 40 omwentelingen per minuut.
  5. Stoppen van agitatie en voeg 1 mL van DPBS.
  6. Centrifugeer de buizen bij 21,092 x g gedurende 1-2 min.
  7. Verwijder het supernatant en voeg 1 mL van DPBS naar resuspendeer de pellet door zachte pipetteren.
  8. Herhaal stap 2.6-2.7 minstens zeven maal voor het verwijderen van niet-afhankelijke pH-indicator.
  9. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 200 µL van DPBS met 5% DMSO.
    Opmerking: alle synaptosomes zijn op dit punt, niet-functioneel. Wij hebben bevestigd dat fosfatidylserine (PS) is blootgesteld aan de buitenmembraan van synaptosomes, die functioneert als een "eten-me" signaal (Figuur 4).

3. de astrocyten en Microglia zuivering

Opmerking: Dit protocol voor Astrocyt zuivering is aangepast van een eerder gepubliceerde papier21. In dit protocol, wordt de zuivering van rat astrocyten en microglia beschreven. Specifieke procedures voor het zuiveren van muis astrocyten en microglia worden ook beschreven in de toelichting.

  1. Eergisteren zuivering
    1. Voorbereiding vooraf gecoate cel cultuur gerechten en oplossingen.
    2. Bereiden van vijf 145 x 20 mm petrischalen met 25 mL van 50 mM Tris-HCl (pH 9.5). Plaats primaire of secundaire antilichaam behandeling in de petrischaaltjes afzonderlijk zoals hieronder beschreven. Na de gerechten in de vriezer een nacht bebroeden.
      BSL-1 schotel: 20 µL van 5 mg/mL BSL-1 (Griffonia simplicifolia lectine)
      Dit is een alleen-secundaire schotel: 60 µL van 2,4 mg/mL geit-antimuis IgG + IgM (H + L)
      CD45 schotel: 60 µL van 2,4 mg/mL geit-antimuis IgG + IgM (H + L)
      O4 schotel: 60 µL van 2,4 mg/mL geit-antimuis IgM (µ-keten specifiek)
      Itgb5 (integrine β5) schotel voor rat astrocyten: 60 µL van 2,4 mg/mL geit-antimuis IgG + IgM (H + L)
      Opmerking: Om te hechten secundair antilichaam aan de hydrofobe oppervlak van de petrischaal, langzame bijlage bij lage temperaturen wordt aanbevolen. Het is echter mogelijk om de jas van de petrischaal met secundair antilichaam gedurende 2 uur bij 37 ° C. Antilichamen voor Astrocyt pannen worden anders gebruikt afhankelijk van de diersoort; bijvoorbeeld, HepaCAM schotel voor muis astrocyten: 60 µL van 2,4 mg/mL geit-antimuis IgG + IgM (H + L)
  2. Dag van de zuivering
    1. Immunopanning voorbereiden.
    2. Bereiden van 50 mL tubes en bestanden toevoegen aan de buizen. De voorbereiding van de gedetailleerde stamoplossing wordt gepresenteerd in de tabel 1.
      1. Buis 1 (enzym) bereiden: 22 mL enzym voorraad (enzym voorraad: 1 x Earle's Balanced zoutoplossing (EBSS)+0.46% D (+)-glucose + 26 mM NaHCO3 en0,5 mM EDTA).
      2. Buis 2 (lage Ovo) bereiden: 42 mL remmer voorraad (remmer voorraad: 1 x EBSS+0.46% D (+)-glucose + 26 Mm NaHCO3).
      3. Bereiden van buis 3 (hoge Ovo): 10 mL remmer voorraad.
    3. 0.22-µm spuit filters hechten aan de uiteinden van 2 mL pipetten aangesloten op een CO2 (95% O2 en 5% CO2) tank. Bubble CO2 in buizen 1-3. Stoppen wanneer de oplossingen oranje borrelen.
    4. De totaaloplossingen.
      Let op: Voltooien en de oplossing in buis 1 bij 34 ° C gedurende 15 minuten staan alvorens het te gebruiken voor enzymactivering uit te broeden.
      1. Buis 1 (enzym) bereiden: 22 mL enzym voorraad + 180 U van papaïne + 0,004 g L-cysteïne.
      2. Buis 2 (lage Ovo) bereiden: 42 mL van de Inhibitor van de omwenteling voorraad + 3 mL lage Ovo 200 µL van DNase.
      3. Bereiden buis 3 (hoge Ovo): 10 mL van de Inhibitor van de omwenteling voorraad + 2 mL hoge Ovo 20 µL van DNase.
      4. Bereiden buis 4 (0,2% BSA): 19 mL voor 1 X DPBS + 1 mL 4% BSA 8 µL van DNase.
      5. Buis 5 (0,02% BSA) bereiden: 45 mL van de 1 X DPBS + 5 mL Tube 4 + 50 µL van DNase.
    5. Verwarm een water bad en warmte blok van 34 ° C.
  3. Pak de rat cortex.
    1. Steriliseren van chirurgische apparatuur met 70% ethanol en 100 mm petrischaaltjes met DPBS te bereiden.
    2. Een acryl box voor te bereiden. Zet twee tot drie lagen van weefsels in de bodem van de doos en voeg 1 mL Isofluraan in het vak.
    3. Anesthetize pups voor 20-40 s in het vak en bevestig afstomping met snuifje van de voet met een tang. De hart-22 bloot en perfuse van pups met behulp van een spuit van 10 mL met DPBS.
      Opmerking: Perfusie wordt gebruikt om te voorkomen dat bloedcellen besmetting tijdens de microglia panning stap.
    4. Snijd de pup de bovenste cervicaal regel van de nek met een operationele schaar en incise de hoofdhuid langs de middellijn. Maken van een sneetje op de schedel langs de middellijn en het openen van de schedel met gekromde pincet.
    5. Accijnzen het cerebellum met Castroviejo voorjaar schaar. Neem de resterende hersenen en plaatst u deze in een 100-mm petrischaal gevuld met DPBS.
    6. Andere gebieden zoals de veroorzaakt en hippocampus verwijderen door de cortex met Castroviejo voorjaar scharen onder de Microscoop. Verwijder de hersenvliezen met fijne pincet.
    7. De cortex overboeken naar een nieuwe schotel van 60 mm en verwijderen van de resterende DPBS in de schotel. Hak het weefsel met een mes No. 10.
  4. De cortex distantiëren in een enkele celsuspensie
    1. Giet de gefilterde buis 1 oplossing in een schotel van 60 mm en voeg 50 µL van DNase1. Swirl de oplossing in de schotel.
      Opmerking: DNase wordt gebruikt voor de remming van de samenvoeging van DNA van gescheurde cellen.
    2. Zet de schotel in een blok van 34 ° C warmte en bedek het met een deksel met een gat in het midden. Gebruik een soldeerbout te maken van het gat in het deksel van de petrischaal 60 mm.
    3. 22-µm spuit filters verbinden met een CO2 tank buis en plaats het uiteinde van de filter in het gat.
    4. Incubeer de schotel bij 34 ° C gedurende 45 min. Swirl de oplossing in de schotel elke 10 à 15 min.
  5. Beëindig de panning gerechten bereiden.
    1. Verwijder de panning gerechten die hebben zijn bekleed met secundaire antilichamen uit de vriezer een dag van tevoren. Laat de BSL-1 schotel en secundaire antilichaam-alleen schotel op RT.
    2. De afwas andere driemaal met 20 mL DPBS.
    3. Giet een passend bedrag van 0,02% BSA in de gerechten. Specifieke primaire antilichamen in de overeenkomstige gerechten plaatsen:
      CD45 schotel: 12 mL van 0,02% BSA + 20 µL van 0, 5 mg/mL Rat-antimuis CD45
      Itgb5 schotel: 12 mL van 0,02% BSA + 20 µL van 0, 5 mg/mL Itgb5
      O4 schotel: 8 mL 0,02% BSA en 4 mL van O4 antilichaam
      Opmerking: Gebruik voor immunopanning van de muis, muis anti-rat CD45 (0,5 mg/mL) voor microglia en HepaCAM (0,5 mg/mL) voor astrocyten.
    4. Bereiden van 30 mL van 30% FBS met neurobasal media en 10 mL 1 X EBSS. Beide oplossingen in een bad van 34 ° C water opwarmen.
  6. Remmen de papaïne reactie.
    1. De papaïne-behandelde weefsels overbrengen in een nieuwe 50 mL-buis. Wachten op de weefsels te regelen. Gecombineerd vloeistof door afzuigen.
    2. Voeg 4 mL lage Ovo oplossing aan de buis en swirl van de oplossing om te wassen van de cellen.
    3. Herhaal stappen 3.6.1-3.6.2 drie keer om te stoppen met de enzym-reactie.
  7. Triturate van de cortex weefsels.
    1. 6 mL lage Ovo toevoegen aan de kuip. Gecombineerd en laat de weefsels snel met een 5 mL-pipet.
      Let op: Geen bubbels invoeren.
    2. Voorbereiden van een nieuwe buis van 50 mL en voeg 5 mL van lage Ovo. Verzamelen van afzonderlijke cellen in een nieuwe buis.
    3. Herhaal stappen 3.6.1-3.6.2 twee keer en de 5 mL-Pipet verandert in een pipet 1 mL.
    4. Herhaal de verpulvering om meer dan 95% van de weefsels zijn niet zichtbaar.
    5. Maak een laag hoge Ovo oplossing uit buis 3 met een pipet 10 mL onder lage Ovo-bevattende losgekoppeld cellen.
    6. Centrifugeer bij 190 x g voor 6 min met paar remmen.
      Opmerking: Stelt de vertraging-tarief op een of twee wanneer het maximumpercentage van de vertraging negen is.
  8. Filtraat afzonderlijke cellen.
    1. Zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof door afzuigen en resuspendeer de pellet met 0,02% BSA oplossing met een 1 mL pipet 3 mL.
    2. Voeg 0,02% BSA oplossing tot 9 mL.
    3. Bereid een nieuwe 50 mL tube en 20-µm cel zeef op de top van de buis. Natte de cel zeef met 1 mL van 0,02% BSA oplossing.
    4. Spoel de suspensie van één cel in de cel zeef. Filter 1 mL per keer.
    5. Wassen van de cel zeef met 3 mL oplossing van 0,02% BSA. Maak niet meer dan 15 mL van de gefilterde eencellige schorsing.
    6. Incubeer de buis in een waterbad van 34 ° C gedurende 45-60 minuten voor herstel van de cel. De cel herstelstap voorziet Herlokalisatie van cel oppervlakte eiwitten aan het membraan.
  9. Uitvoeren panning van de cellen.
    1. Wassen van de schotel CD45 panning driemaal met 20 mL DPBS. Elk gerecht driemaal met 20 mL DPBS onmiddellijk vóór gebruik te wassen.
    2. Giet de schorsing van één cel in de CD45 pannen schotel. Laat het gerecht gedurende 28 minuten en schud de schotel voor 14 min. Niet-afhankelijke cellen uit de bodem te verwijderen, moet u zorgvuldig de schotel schudden.
    3. De celsuspensie overbrengen in de alleen-secundaire schotel. Wacht 20 min en zorgvuldig schudden de schotel voor 10 min. Voor het verkrijgen van microglia uit de schotel CD45, gaat u naar stap 3.9.2.
    4. Spoel de celsuspensie in de BSL-1 schotel. Laat de schotel voor 10 tot en met 12 min.
    5. Pipetteer in de O4 schotel. Wachten op 20 minuten en schud gedurende 10 minuten.
    6. Pipetteer in de Itgb5 schotel. Laat de schotel voor 40 min en elke 10 min zachtjes te schudden.
      Opmerking: Voor de muis pannen, breng de celsuspensie in de HepaCAM schotel.
  10. Loskoppelen van cellen uit de schotel.
    1. Mix-400 µL van trypsine (30.000 U/mL in EBSS) met gepreïncubeerd 8 mL 1 X EBSS.
    2. Giet de vrijstaande celsuspensie in de schotel in een afval emmer.
    3. Wassen van de schotel achtmaal met DPBS.
    4. Giet 8 mL EBSS met trypsine in de schotel.
    5. Incubeer de schotel voor 5 tot 10 min in de 37 ° C incubator. Incubeer gedurende 10 min voor de schotel CD45 en 5 min voor de Itgb5 en HepaCAM gerechten.
    6. Tik op de schotel en observeren van de schotel onder een microscoop.
      Opmerking: Als de meeste van de astrocyten hebben niet losgekoppeld, zet de schotel terug in de incubator voor een andere 5 min.
    7. Giet 10 mL van 30% FBS in de schotel te neutraliseren trypsine.
    8. Pipetteer op en neer in de hele schotel los astrocyten of microglia.
    9. Breng de oplossing kwantitatief over in een 50 mL-buis.
    10. Voeg 10 mL van 30% FBS en 200 µL van DNase in de schotel. De cellen weer loskoppelen. DNase wordt gebruikt voor de remming van de samenvoeging van DNA van gescheurde cellen.
    11. Breng de oplossing kwantitatief over in de buis. Als cellen in de schotel blijven, voeg een ander 10 mL van 30% FBS en de cellen weer losmaken.
  11. Plaat van de cellen.
    1. Centrifugeer de buis bij 213 x g gedurende 10 minuten.
    2. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet van de cel met de media.
      Opmerking: Gebruik immunopanned Astrocyt fundamentele media (IP-ABM) voor astrocyten en netvlies microglia fundamentele media (VBM) met immunopanned Astrocyt-geconditioneerd media (IP-ACM) voor microglia. De IP-ABM en MBM composities worden gepresenteerd in de Tabel van materialen.
    3. Telt de cellen met een hemocytometer.
    4. Plaat de astrocyten en microglia afzonderlijk in PDL beklede platen.
      Opmerking: Bereiden de PDL beklede plaat vóór gebruik. Ter voorbereiding van PDL beklede platen, voeg 50 µL van 1 mg/mL poly-D-lysine in 5 mL gedestilleerd water en giet een voldoende hoeveelheid van de oplossing in de goed plaat/schotel, en wachten 30 min. Wash de plaat/schotel driemaal met gedestilleerd water.
    5. Incubeer de plaat. De helft van de media elke 7 dagen voor de astrocyten en 3 dagen voor microglia wijzigen

4. het verzamelen van IP-ACM

  1. Bereiden een schotel van 100 mm wanneer de astrocyten zijn overdreven confluent.
  2. Negeren van de media en wassen van de schotel driemaal met 10 mL DPBS.
  3. Giet 15 mL laag eiwitgehalte media in de schotel.
    Opmerking: De samenstelling van de media laag eiwitgehalte wordt gepresenteerd in de Tabel van materialen.
  4. Incubeer de schotel gedurende 7 tot 10 dagen in de incubator 37 ° C.
  5. Verzamelen en concentreren van de media met 10k (of 30k) centrifugaal filter buizen.
  6. Centrifugeer de buizen bij 851 x g bij 4 ° C.
    Opmerking: Centrifugeer de buizen totdat de resterende media minder dan 1 mL is.
  7. Verzamelen geconcentreerde media (IP-ACM) in een nieuwe 1.5-mL-buis.
  8. Meten van de concentratie van IP-ACM met behulp van kwantitatieve analyse

5. fagocytose Live-imaging Assay (Figuur 2)

  1. Voorbereiden van een 24-well-plate (of elke plaat/schotel die is voorbereid op de live-imaging) in welke astrocyten confluente zijn (in het algemeen 7 tot 10 dagen incubatie na de zuivering ideaal is voor het stabiliseren van de cellen).
  2. Verwijder het medium in elk putje en was de putjes met 1 mL van de DPBS, drie keer. Was de putjes snel om te minimaliseren van blootstelling van de lucht.
  3. Voeg 300 µL van IP-ABM met 5 µL van pH-indicator-geconjugeerde synaptosomes en bijkomende factoren zoals IP-ACM dat gliale cel fagocytose moduleren kan.
  4. Incubeer de plaat in een CO2 incubator voor 40 min. Deze stap kan de pH-indicator-geconjugeerde synaptosomes om af te wikkelen naar de onderkant van de platen.
  5. Verwijder het medium met niet-afhankelijke pH-indicator-geconjugeerde synaptosomes en elk putje met 1 mL van de DPBS, drie keer wassen.
    Let op: Niet hard wassen. Was de putjes snel om te minimaliseren van blootstelling van de lucht.
  6. Voeg 500 µL van IP-ABM met aanvullende factoren om te testen in de putjes.
  7. Neem de plaat naar een live-imaging instrument en selecteer posities. Focus, belichtingstijd, helderheid en LED power aanpassen.
    Opmerking: De instellingen voor belichtingstijd, helderheid en LED power zijn variabele afhankelijk van de intensiteit van de fluorescentie en het doel van het experiment. In de live-imaging assay met pH-indicator-geconjugeerde synaptosomes, meestal zetten we deze waarden als volgt: blootstelling: ~ 150-200 ms, helderheid: 15 en LED power: 4-6.
  8. Het afbeeldingsformaat, tijdsinterval en het totale aantal cycli voor live-imaging instellen. Het tijdsinterval instellen op 1 of 2 uur afhankelijk van hoeveel posities zijn geselecteerd. 2 uur intervallen worden aanbevolen als er meer dan 150 posities zijn geselecteerd voor live-imaging.
  9. Start de live-imaging experimenten.
  10. Het analyseren van de gegevens.
    1. Open het programma van Fiji.
    2. Importeren van een reeks afbeeldingen. Afbeeldingen omzetten in 8-bits grijstinten.
    3. Uitvoeren van achtergrond aftrekken met rolling bar straal van 50 pixels.
    4. Start tijd serie analyzer V3 plugins.
      Opmerking: Het adres voor tijd serie analyzer V3 plugins wordt gepresenteerd in de Tabel van materialen.
    5. Sleep de regio van belang (ROI) in de afbeelding en klik op toevoegen in de manager van de ROI.
    6. Klik op "Get totale intensiteit" in de tijdreeks V3_0.
    7. Sla de resultaten en de gegevens integreren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze in vitro fagocytose assay met langdurige live-imaging gebruikten we synaptosomes van volwassen muis hersenen homogenates, die in de kleurovergang oplossing tussen 23% kleurovergang oplossing en kleurovergang 10%-oplossingligttussen werden gescheiden door ultracentrifugatie) Figuur 3). Na de voorbereiding blootgesteld synaptosomes PS in hun buitenste membraan (Figuur 4), wat suggereert dat ze hun functie verloren ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit artikel presenteren we methoden voor een langdurig wonen-imaging in vitro fagocytose assay met gezuiverde gliale cellen en pH-indicator-geconjugeerd synaptosomes. We tonen aan dat in vergelijking met microglia, astrocyten bezitten verschillende engulfment en afbraak capaciteit tijdens de fagocytose van synaptosomes. Bovendien, blijkt onze gegevens dat Astrocyt-uitgescheiden factoren, die een "passerelle" moleculen zoals MEGE8, GAS6 en eiwitten bevatten, essentieel voor de efficiënte PS-afhankelijke fagocy...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Yeon-Joo Jung voor haar experimental support tijdens synaptosome zuivering en Jungjoo Park voor beelden van synaptosomes met PS blootstelling. Bovendien, danken wij alle leden in Chung's laboratorium voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de National Research Foundation van Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 en NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Synaptosome zuivering
PercollGE healthcare life sciences17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2BIO-RAD5000202
pH indicator conjugatie
Dimethyl sulfaat (DMSO)LPS-oplossingDMSO100
pHrodo rood, succinimidyl esterMolecula probesP36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced zout oplossing (EBSS)SigmaE7510
Rund serum albumineBovogenBSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase)WorthingtonIs002007
(DMEM)Gibco11960-044
(dPBS)WelgeneLB001-02
Fetaal rund serum (FBS)Gibco16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectine(BSL-1)Vector LabsL-1100
Geiten anti-muis IgG+IgM(H+L)Jackson ImmunoResearch115-005-044
Geiten anti-muis IgM (μ-keten)Jackson ImmunoResearch115-005-020
Heparinevrije epidermale groeifactorSigmaE4643
Humaan HepaCAM antilichaamR&D systemsMAB4108
Integrine beta 5 monoklonaal antilichaam (KN52)eBioscience14-0497-82
L-cysteïneSigmaC7880
L-glutamaatGibco25030-081
N-acetly-L-cysteïne (NAC)SigmaA8199
Neurobasal mediaGibco21103-049
O4 hybridoma supernatant(muis IgM)Bansal et al.23
PapaïneWorthingtonIs003126
Penicilline/streptomycineGibco15140-122
Pluristrainer 20 μmPluriSelect43-50020-03
Poly-D-lysineSigmaP6407
ProgesteronSigmaP8783
Putrescine dihydrochlorideSigmaP5780
Gezuiverd rat anti-muis CD45BD Pharmingen550539
Gezuiverd muis anti-rat CD45BD Pharmingen554875
NatriumpyruvaatGibco11360-070
NatriumselenietSigmaS5261
TransferrineSigmaT1147
TrypsineSigmaT9935
Trypsine remmerWorthingtonLS003086
Ultra-heldere buis (buis, dunne wand, ultra-helder)Beckman Coulter344059
Verzamel IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices met Omega Membraan (10k)PALLMAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices met Omega Membraan (30k)PALLMAP030C37
Fagocytose live beeldvormingstest
Juli stageNanoEntek
Time Series Analyzer V3 pluginshttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

Referenties

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871(2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355(2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

AstrocytenfagocytosepH-indicator synaptosomengliale celopnamemicroglia-vergelijkingsynaptosomenpreparatietime-lapse imagingfluorescentiekwantificeringMEGF10-knock-outscreening van neurologische aandoeningen
Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.