In deze studie beschrijven we de achterste semicircular canal-benadering als een betrouwbare methode voor binnenoor gene levering in neonatale muizen. We laten zien dat gene levering door het posterieure semicircular-kanaal vermag perfuse het gehele binnenoor.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Achterste Semicircular Canal aanpak voor binnenoor Gene levering in neonatale muis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De therapie van het gen van de innerlijke oor biedt grote belofte als een mogelijke behandeling van gehoorverlies en duizeligheid. Een van de kritische determinanten van het succes van de therapie van het gen van de innerlijke oor is een leveringsmethode die tot consistente transductie efficiëntie van gerichte celtypes leidt terwijl het minimaliseren van verlies van het gehoor te vinden. In deze studie beschrijven we de achterste semicircular canal-benadering als een levensvatbare methode voor binnenoor gene levering in neonatale muizen. We laten zien dat gene levering door het posterieure semicircular-kanaal vermag perfuse het gehele binnenoor. De anatomische identificatie van het posterieure semicircular kanaal, alsmede minimale manipulatie van het bot van de temporale vereist, maken dit chirurgische aanpak een aantrekkelijke optie voor binnenoor gene levering.
Inleiding
De therapie van het gen van de innerlijke oor is een zich snel ontwikkelende gebied van onderzoek. Deze is vereffend in verschillende modellen van de dieren te bestrijden ototoxiciteit, lawaai trauma, erfelijke hoorzitting verlies1. Verschillende recente studies hebben aangetoond functionele herstel van gehoor en evenwicht functies in mutant muizen na binnenoor gene therapie levering2,3,4,5,6, 7. een van de belangrijkste factoren bij het bepalen van het succes van de therapie van het gen van de innerlijke oor is de chirurgische aanpak gebruikt voor toegang tot het binnenoor. In het ideale geval de chirurgische benadering zou zijn gemakkelijk uit te voeren, de anatomische bezienswaardigheden zou consistent zijn en gemakkelijk te identificeren, en de resulterende transductie van gerichte celtypes hoog zou zijn.
In een recente studie toonden we dat toen virale gentherapie werd geïnjecteerd door het posterieure semicircular-kanaal van de mutant muis van whirler (een model van verlies van het gehoor en vestibulair dysfunctie), efficiënte transductie van sensorische haarcellen werd gezien in de vestibulaire ook organen zoals in het slakkenhuis5. De hoge efficiëntie van sensorische Haarcel transductie geleid tot verbetering van de auditieve en vestibulaire functies in deze mutant muizen.
In dit artikel beschrijven we in detail de achterste semicircular canal aanpak voor toegang tot het binnenoor neonatale muis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité bij het National Institute on doofheid en andere communicatie stoornissen (NIDCD ASP1378-15).
1. procedure Setup en voorbereiding
- Steriliseren alle instrumenten in ethyleenoxide in het begin van het experiment. Reinig instrumenten met behulp van de kraal sterilisatie tussen dieren.
- Laden van de oplossing met virale gentherapie in een micropipet op de micro-injector. De virale vector gebruikt in deze studie was AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoom kopieën per milliliter, zie de inhoudsopgave materialen).
Opmerking: Doorgaans 1.1 µL totaalvolume wordt geladen in de micropipet.
2. anesthesie
Opmerking: De spanning van de muis gebruikt in deze studie is de whirler-muis. Homozygoot mutanten (Whrnwi/wi) zowel heterozygoot nestgenoten (Whrn+/ wi) werden gebruikt.
- Plaats de moeder in een aparte kooi (Los van het nest).
- Plaats de kooi met het nest (P0 - P5 pups) op een recirculatie warmte pad (set bij 37,5 ° C) de muizen om warm te houden.
- Knip uit het gedeelte van de duim van een latex handschoen, en plaats een pup in het.
- Plaats de pup in latex handschoen duim in een emmer van ijs voor ~ 2 min.
- Plaats de narcose pup op een groot plein commerciële kunststof bevriezen pack met een 4 "x 4" gaas tussen de pup en het pack van oppervlak.
- Vul een heavy-duty latex handschoen met crushed ijs en plaats de handschoen ijs rond de pup.
- Controleer als de pup voldoende is verdoofd door het volledig ontbreken van een reactie op verschillende stimuli (met inbegrip van een stevige teen snuifje). Laat de pup op de ice pack voor de duur van de operatie (ongeveer 5-10 min).
Opmerking: We raden aan het verlaten van de pups op de ice pack voor niet meer dan 15 min tijdens de operatie.
3. de chirurgische benadering (Figuur 1)
- Reinig de huid achter het oor met een veeg van jodium en een alcohol doekje zodra het dier wordt verdoofd.
- Maken van een postauricular incisie ~ 2 mm achter het oor met behulp van de micro-schaar, en verdeel de musculus sternocleidomastoideus met micro-schaar.
- Identificeer de nervus facialis en de ' bulla '. De ' bulla ' kraakbeenachtige en semi-transparante is op deze leeftijd en het ligt mediaal op de nervus facialis. De stapedial slagader kan worden gezien door de ' bulla ' op deze leeftijd, dat een nuttige mijlpaal is.
- Volg de nervus facialis superiorly en posteriorly te vinden van het posterieure semicircular kanaal (PSCC). Verwijder de spiervezels en het zachte weefsel overliggende het posterieure semicircular-kanaal met behulp van de micro-schaar.
Opmerking: De PSCC is kraakbeenachtige op deze leeftijd. - Doordringen de PSCC met behulp van een glas micropipet (~ 10 micrometer in diameter) op de micro-injector.
- Virale gentherapie injecteren in het binnenoor.
Opmerking: Doorgaans 20 injecties van 49 in totaal nL van de gentherapie worden geleverd in de achterste semicircular kanaal meer dan ~ 40 s (totale volume ~ 1 µL). De virale titer gebruikt was 1 x 1013 genoom kopieën per mL. - Sluit de insnijding van de huid met behulp van een 5-0 polyglactin hechtdraad.
4. de postoperatieve zorg
- Plaats de pup op een opwarming pad om te herstellen van een normale lichaamstemperatuur tijdens het herstel van anesthesie met constante handmatige stimulatie/rollen met gehandschoende menselijke vingers.
- Zodra de pup wakker is, plaats het terug in zijn kooi.
- Elke pup met een wattenstaafje dat is blootgesteld aan de kooi beddengoed strelen.
Opmerking: Het doel hiervan is dat de muizen ruiken zoals ze deden vóór de operatie, die vergroot u de kans van de moeder opnieuw haar nest na chirurgie aanvaarding. Indien mogelijk, kan urine van de moeder worden verzameld en wreef over de pups met behulp van een wattenstaafje om te verder verlagen de kans op afwijzing. - Toepassing van minerale olie op de Moederdag neus te desensibiliseren haar8, en opnieuw de moeder in hun kooi.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Injectie van gentherapie in neonatale whirler muizen door het posterieure semicircular-kanaal AAV8-whirlin resulteerde in de whirlin expressie (groen) in utricular haarcellen (Figuur 2), met de algehele efficiëntie van de infectie van 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Getransduceerde haarcellen had langwerpige stereocilia (rood) in vergelijking met de haarcellen van contralaterale niet-ingespoten oren (5.35 ± 2.11 µm vs. 3,20 ± 0.34 µm, respe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Verschillende chirurgische benaderingen zijn beschreven voor toegang tot knaagdier inner oren. Cochleostomy en ronde venster benaderingen zijn meestal gebruikt voor toegang tot het slakkenhuis, terwijl de achterste semicircular canal en de endolymphatic sac benaderingen doorgaans gebruikt worden voor toegang tot de vestibulaire organen1. In een recente studie toonden we dat posterieure semicircular canal injecties van virale gentherapie in hoge efficiëntie van Haarcel signaaltransductie in zowel d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen relevante informatie te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door fondsen van het NIDCD divisie van intramurale onderzoek /NIH (DC000082-02 tot W.W.C.), alsook DC000081 aan geavanceerde imaging core. We zijn dankbaar voor het NIDCD dier faciliteit personeel voor de zorg voor onze dieren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Operatiemicroscoop | Zeiss | OPMI Pico ENT-microscoop. Andere dissectiemicroscopen zouden ook werken. | |
| Micro-forceps | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 en #55 Dumont |
| Micro-schaar | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Nanoliter2000 micro-injector | World Precision Instruments | ||
| Verwarmingskussen | Mastex | Model 500/600 | |
| 5-0 vicryl hechtdraad | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| Glazen pipet | Sutter Instruments | B100-75-10 | Boorsilicaatglas |
Referenties
- Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
- Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295(2015).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
- Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
- Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
- Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
- Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
- Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).
- Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
- Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
- Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
- Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524(2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
