Onderzoek naar de nadelige effecten van lage druk Plasma sterilisatie op het voortbestaan van Bacillus subtilis sporen met behulp van Live cel microscopie

Samenvatting

Dit protocol illustreert de belangrijke opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de beoordeling van de relevantie van het toezicht op de parameter van de vitaliteit en DNA-herstelsynthese in de heropleving van sporen van Bacillus subtilis na behandeling met lage druk plasma door tracking fluorescentie-gelabelde DNA repair eiwitten via time-resolved confocale microscopie en elektronenmicroscopie scannen.

Samenvatting

Plasma sterilisatie is een veelbelovend alternatief voor conventionele sterilisatie methoden voor industriële, klinisch, en ruimtevaart doeleinden. Lagedruk plasma (LPP) lozingen bevatten een breed spectrum van actieve soorten, die tot snelle microbiële inactivatie leiden. Studeren op de efficiëntie en de mechanismen van sterilisatie door LPP, gebruiken we sporen van het testorganisme Bacillus subtilis vanwege hun buitengewone weerstand tegen conventionele sterilisatie procedures. We beschrijven de productie van B. subtilis spore monolayers, het sterilisatieproces door lagedruk plasma in een dubbele inductief gekoppeld plasma reactor, de karakterisatie van spore morfologie met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM), en de analyse van kieming en uitgroei van sporen door levende cel microscopie. Een belangrijk doelwit van plasma soorten is genomische materiaal (DNA) en reparatie van plasma-geïnduceerde DNA laesies op spore opleving is van cruciaal belang voor het voortbestaan van het organisme. Hier, bestuderen we de capaciteit van de kieming van sporen en de rol van DNA herstellen tijdens spore ontkieming en uitgroei na behandeling met LPP door het bijhouden van fluorescently-gelabelde DNA reparatie eiwitten (RecA) met time-resolved confocal fluorescentie microscopie. Behandeld en onbehandeld spore monolayers zijn geactiveerd voor kieming en gevisualiseerd met een omgekeerde confocal levende cel Microscoop na verloop van tijd te volgen van de reactie van afzonderlijke sporen. Onze waarnemingen blijkt dat de Fractie van ontkiemen en ontgroei sporen afhankelijk van de duur van LPP-behandeling minimaal bereiken is nadat 120 s. RecA-YFP (gele fluorescentie eiwit) fluorescentie werd alleen in enkele sporen ontdekt en ontwikkeld in alle ontgroei cellen met een lichte verhoging in sporen LPP-behandeld. Bovendien, sommige van de vegetatieve bacteriën afgeleid van LPP-behandelde sporen sprake van een toename in cytoplasma en neiging lyse. De beschreven methoden voor de analyse van afzonderlijke sporen zou exemplarisch zijn voor de studie van andere aspecten van spore kieming en uitgroei.

Inleiding

Een belangrijk doel van de verkenning van de ruimte is de zoektocht naar handtekeningen van levensvormen en biomoleculen op andere planetaire lichamen en manen in ons zonnestelsel. De overdracht van micro-organismen of biomoleculen van terrestrische oorsprong naar kritieke gebieden van exploratie is bijzonder risico bestaat om de impact van de ontwikkeling en de integriteit van leven-detectie missies op planetaire lichamen zoals Mars en Europa¹. De internationale richtlijnen voor de bescherming van de planetaire, vastgesteld door het Comité voor ruimte onderzoek (COSPAR) in 1967, strikte regels op bemande en gerobotiseerde missies naar andere planeten, hun manen, asteroïden en andere hemellichamen opleggen en regelen de reiniging en sterilisatie van een ruimtevaartuig en essentiële hardwarecomponenten vooraf te lanceren om te elimineren besmetten terrestrische micro-organismen en het voorkomen van kruisbesmetting van hemellichamen². In het afgelopen decennium, heeft de toepassing van niet-thermisch plasma's opgedaan brede aandacht in biomedische en nutritionele onderzoek, evenals in de bemande ruimtevaart toepassingen^3,4,5. Plasma sterilisatie is een veelbelovend alternatief aan conventionele sterilisatie-methodes, want het biedt snelle en efficiënte microbiële inactivatie⁶, terwijl het zacht om gevoelige en hitte-labiele materialen. Plasma lozingen bevatten een mengsel van reactieve agenten zoals vrije radicalen, geladen deeltjes, fotonen in het ultraviolette (UV) en vacuüm ultraviolet (VUV) spectrum die tot snelle microbiële inactivatie^{3 leiden}neutrale/opgewonden atomen. In deze studie, we gebruiken lagedruk plasma gegenereerd door dubbele inductief gekoppeld lagedruk plasma (DICP) bron-^7,8 te inactivering van Bacillus subtilis endosporen verdeeld over test glasoppervlak.

Gram-positieve bacteriën van de familie Bacillaceae zijn op grote schaal verspreid in natuurlijke habitats van bodem, sedimenten en lucht evenals in ongewone omgevingen zoals schone Kamerfaciliteiten en de International Space Station^{9,10 ,11}. De meest duidelijke functie van het geslacht Bacillus is de mogelijkheid om zeer resistent slapende endosporen (hierna "sporen" genoemd) om te overleven van ongunstige omstandigheden, zoals de uitputting van de voedende¹²vormen. Sporen zijn over het algemeen veel bestendiger dan hun tegenhangers van de vegetatieve cel naar een groot aantal behandelingen en milieu benadrukt, met inbegrip van warmte, UV, gamma bestraling, uitdroging, verstoring van de mechanische en giftige chemische stoffen, zoals sterke oxidatiemiddelen of pH-veranderende agenten (herzien in verwijzingen^13,14) en zijn daarom ideaal objecten voor het testen van de efficiëntie van de microbiële inactivatie methoden. Aangezien genomic DNA een belangrijke doelstelling van de plasma behandeling van bacteriën^15,16, de reparatie van plasma-geïnduceerde DNA laesies is (bijvoorbeeld dubbele bundel van DNA breekt) op spore opleving is van cruciaal belang voor het voortbestaan van de bacteriën^{13, 17}.

Dus, we bestuderen de kiemkracht van de sporen en de rol van DNA-herstel tijdens spore ontkieming en uitgroei na behandeling van de sporen met lage druk argon plasma door volgende afzonderlijke sporen en hun uitdrukking van fluorescentie-gelabelde DNA herstellen eiwit RecA met time-resolved confocal fluorescentie microscopie. We geven een stap voor stap instructie van de voorbereiding van B. subtilis sporen in monolayers om reproduceerbare testresultaten, de behandeling van spore monolayers met lage druk plasma voor sterilisatie, de voorbereiding van plasma behandeld sporen voor Ultrastructurele evaluatie met behulp van scanning elektronen microscopie (SEM) en levende cel microscopie analyse op het niveau van individuele sporen in concert met het toezicht op de actieve DNA-herstelprocessen die zich voordoen binnen de cel op reactie op plasma behandeling.

Protocol

1. bacillus subtilis Spore productie en zuivering

1. Voor de productie van de spore, overdracht van een overnachting cultuur van 5 mL van de respectieve B. subtilis stam, aangevuld met de juiste antibiotica, 200 mL dubbele sterkte Schaeffer sporevorming vloeistof (per liter 16 g nutriënten Bouillon, KCl 2 g, 0,5 g MgSO ₄* 7 H₂O, 2 mL 1 M Ca (₃)₂, 2 mL 0,1 M MnCl₂ * • 4 H₂O, 2 mL 1 mM FeSO₄, 2 mL 50% (m/v) glucose¹⁸) en ontwikkelt met krachtige beluchting bij 37 ° C gedurende 72 uur of tot > 95% van de cultuur heeft sporevorm. De sporen van volgende stammen worden gebruikt: B. subtilis PY79 (wild type) B. subtilis PY79ΔrecA:: neo (tekort van DNA reparatie proteïne RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp:: kat (RecA gefuseerd met geel fluorescerende eiwit [YFP]¹⁹).
2. Oogst van sporen door centrifugeren gedurende 15 minuten op 3000 x g in 50 mL tubes en zuiveren van de monsters door herhaalde wassen stappen (maximaal 15 keer) die via steriel gedistilleerd H₂O en controleer de status van de zuiverheid en de kiemkracht door fase contrast microscopie. Ervoor zorgen dat spore schorsingen bestaan uit fase-lichte sporen (> 99%) en zijn vrij van vegetatieve cellen (staven), ontkiemde sporen (zwart / grijs verschijning) en cel puin, anders verder microscopie experimenten kunnen worden verstoord. Was het monster totdat het gewenste zuiverheid is bereikt.
3. De titer van de spore door beplating uit 50 µL 10-fold seriële verdunningen op LB-agar io (dat wil zeggen: gebruik 30 µL monster + 270 µL steriel water voor een 1:10 verdunning. Neem 30 µL van de bijzondere verdunning op 270 µL H₂O voor de verdunning van een 1:100 enzovoort) voor het berekenen van de CFU (kolonievormende eenheden) en Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts. Na de vaststelling van de CFU, aanpassen aan 10⁹ sporen per mL monster door zich te concentreren of verdunnen met steriel water.

2. bereiding van aërosol-gestort Bacillus subtilis sporen

Opmerking: Accumulatie en overlapping tussen de sporen kunnen leiden tot schaduw effecten tijdens de behandeling, uiteindelijk resulterend in vervalste inactivatie kinetiek. Om dit probleem te minimaliseren, spore monsters te bereiden door een aërosol-afzetting techniek²⁰. Kort, controleren de hoge precisie twee-stof-mondstuk met een elektrische timer die de vloeibare doorvoer in concert met de stroom van hydrofoor draaggas (hier N_{2 regelt}). Het verspreiden van het geïnjecteerde vloeistof monster via het mondstuk stopcontact met behulp van de gasstroming stikstof.

1. Plaats de drager van een monster in de vorm van gesteriliseerde microscopische dia's (voor overleving kinetiek) of ronde 25 mm coverslips (voor TL volgen van DNA-herstel processen/cLSM; confocale laser scanning microscopie) binnen het elektrisch bediende aërosol spuiten eenheid in afstemming met het mondstuk. De gebruikte spore-concentratie moet overeenkomen met een van de gewenste eindconcentratie honderdvoudig.
2. 1 mL van de cultuur van de spore overbrengen in het mondstuk vloeistof inlaat en leidt hij het sproeien proces van 0,1 s bij een druk van 1,3 bar. De gespoten entsuspensie (1 x 10⁷) vormt een dunne film over de microscopische dia die snel binnen een minuut droogt tot het vormen van een gelijkmatig verdeelde spore enkelgelaagde. De behandelde monster dragers worden opgeslagen in een steriele verpakking bij kamertemperatuur.

3. lage druk Plasma behandeling

1. Bereid de plasma-systeem voor de behandeling van biologische monsters en functioneren van het systeem op 5 Pa met argon plasma bij 500 W voor 5 min. Door dit, worden alle oppervlakken in het systeem gereinigd en opgewarmd. Hierdoor steken van moleculen uit de lucht, namelijk stikstof, zuurstof en water, terwijl de ontluchting van het systeem. Na de voorbehandeling van het systeem, luchten van de kamer en plaats de monsters zorgvuldig in het midden van het schip van de reactor met behulp van glas rekken.
2. Het gebruik van ten minste drie replicaat-biologische organismen. Sluit de zaal en evacueren hieronder 2 Pa. Vul daarna het proces gas in de kamer. Regelen van de druk in het systeem 5 Pa.
3. Uitschakelen van de elektriciteits- en gassector levering na de gedefinieerde verwerkingstijd, en zorgvuldig vent het systeem om te voorkomen dat de monsters van de monsterhouder waait. Na ventilatie, verwijderen van de monsters en plaats de monsters voor de volgende parameter in het systeem. Voor niet-plasma-behandelde controles bloot te vacuüm alleen monsters (5 Pa) in aanwezigheid van het proces gas gelijk aan de langste toegepaste plasma-tijd.

4. herstel en evaluatie van Spore Survival

1. Bereiden van een oplossing van gesteriliseerde met autoclaaf 10% polyvinylacetaat (PVA), dekken de vervoerder monster zorgvuldig met ongeveer 500 µL en laat ze aan voor 4 h. Strip uit de gedroogde PVA-laag (nu met het spore-monster) met behulp van steriele pincet en overbrengen naar een 2 mL reactiebuis. Voeg 1 mL steriel water aan de buis en los de PVA laag via vortexing. Deze procedure leidt tot > 95% terugwinning van sporen en heeft geen invloed op hun kiemkracht vermogen²¹.
2. Serieel Verdun het monster op 1:10 in steriel water in een 96-wells-plaat (d.w.z. 270 µL steriele H₂O + 30 µL monster/voormalige verdunning). Plaat uit 50 µL van elke verdunning op lysogenie Bouillon nutriënt agar (LB), Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts en opsommen en zo het aantal volwassen koloniën (CFU).

5. levende cel microscopie en Tracking van DNA-herstelsynthese in sporen ontkiemen

1. Voor de kieming experimenten, bereiden een 1 mm dik 1,5% LB-agar pad, door het koken van 700 µL medium en Pipetteer in een petrischaal steriele microscopie. Na 10 min, Knip een 8 x 8 mm x 1 mm LB-agar pad met een steriel scalpel en breng de agar voorzichtig op de top van de spore monolayers die op 25 mm glas coverslips rusten.
   Opmerking: Deze stap is cruciaal voor de visualisatie van afzonderlijke sporen en laten hun reactie, op weg naar de activering van kiemkracht geïnduceerd door de nutriëntagar. De LB-agar dient dus twee doelen, (1) het oplossen van de sporen aan het oppervlak, die Herlokalisatie langs het oppervlak en optische onscherp vermijdt, en (2) activeren van de spore voor de kiemkracht.
2. Na die betrekking hebben op het monster met agar, breng het dekglaasje glas aan snel in een imaging kamer en Microscoop de monsters met een geautomatiseerde confocale laser scanning microscoop met omgekeerde optica met behulp van een 63 X / 1.3 vliegtuig apochromatische olie onderdompeling doelstelling.
3. Uitvoeren van beeldvorming van fluorescentie (YFP) met een excitatie golflengte van 514 nm en emissie kan worden ontdekt tussen 520- en 560 nm.
   1. Record helder-veld beelden in de scanmodus met behulp van een van de foto multiplicatoren (verzonden-licht pad).
   2. Vastleggen van time-lapse serie met een kracht van de laser van 2,6%, en de confocal diafragma instellen tot 5 luchtige eenheden en met een samplefrequentie van 1 frame per 30 s van 0 h tot en met 5 h, afhankelijk van het experiment. Het is vermeldenswaardig dat hoge doses van monochromatisch laser verlichting op 514 nm remmen volledig kiemkracht (Figuur 1A, B).
4. Houd de monsters bij 37 ° C (de luchtvochtigheid) in een fase van verwarming tijdens de gehele procedure. Gebruik ten minste drie biologische replicatieonderzoeken voor elke voorwaarde. In geval van spore aggregatie, distributie van meerdere lagen spore of vervuiling door stofdeeltjes, blokkering van de plasma behandeling ("schaduwen") zou kunnen optreden en inschakelen van de ontkieming van schaduw sporen (Figuur 1C, D).

Figuur 1: potentiële problemen waargenomen tijdens de confocal levende cel fluorescentie microscopie van plasma behandeld sporen. (A, B) Remming van de spore kiemkracht door hoge doses van monochromatisch (514 nm) laser verlichting. (A) overzicht (3 x 3 gestikte beelden) van B. subtilis (LAS72, RecA-YFP) sporen 180 min na inleiding van kiemkracht. Het frame in het midden werd blootgesteld 30 s tussenpozen aan hoge doses van laserlicht (514 nm, 70% laser macht) Overwegende dat de omringende regio's (= frames) waren niet verlicht (samengevoegde afbeelding van helder-veld kanaal en RecA-YFP fluorescentie; besteld structuren werden veroorzaakt door het gebruik van 35 mm imaging gerechten met een raster ingeprinte 500 µm). (B) toont een 4 X vergrote weergave van de grens tussen het verlichte en niet-verlicht in de regio dat sporen, die werden blootgesteld aan hoge doses van monochromatisch laser verlichting niet ontkiemen en groeien, overwegende dat sporen niet-verlichte gebieden herstellen volledig naar vegetatieve bacteriën uiting van heldere RecA-YFP fluorescentie (groene signaal). (C, D) Sporen vallende verontreinigende deeltjes of meerdere lagen van spore (pijlen) lijkt onderliggende sporen behoeden voor inactivatie door plasma behandeling en laat hun kiemkracht en uitgroei ("schaduw effect"). (C) sporen waren plasma-behandeld voor 60 s en verbeelde 180 min na inleiding van kiemkracht of in (D) voor 120 s en beeld na 240 min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

6. scanning elektronen microscopie (SEM)

1. Gebruik scanning elektronen microscopie ultrastructurele informatie bieden over de bovengrondse morfologie van plasma behandeld sporen in vergelijking met onbehandelde controles. Jas van gedroogde spore monolayers op coverslips met goud-palladium (3 nm) met behulp van een sputter-coater. Gebruik een veld-emissie scannende elektronen microscoop voor de monsters, gevoed met 5 kV versnelling spanning met inbegrip van een in-lens secundaire electron detector te onthullen topografie contrast denkbaar.

7. de gegevensanalyse

1. Bepalen het voortbestaan van de spore uit het quotiënt₀is N/N, waar N staat voor het gemiddelde CFU van behandelde monsters en N₀ is de gemiddelde CFU van onbehandelde vacuüm controles. Plot spore inactivatie door argon plasma behandeling als een functie van de tijd (in seconden). Als gemiddelden en standaardafwijkingen uiting te geven aan alle gegevens (n = 3).
2. Analyseren van beelden verkregen door levende cellen geschikt zijn met behulp van het imaging software. Kwantificeren van het aandeel van de spore kieming en ontgroei na plasma behandeling, sporen in representatieve frames aan het begin van het experiment en na 4 uur tellen. Voor de bepaling van betekenis in spore overleving assays, gebruik one-way ANOVA-tests (variantie-analyse) met statistische software). P -waarden < 0.05 worden beschouwd als statistisch significant.

Resultaten

Voortbestaan van plasma-behandelde B. subtilis sporen

Plasma behandeling van de sporen van B. subtilis gebruikt in deze studie show een afname van de overleving met het verhogen van de duur van de plasma behandeling (Figuur 2). Sporen van de stam de recAuitdrukken-gen gesmolten tot YFP toonde overleving curven vergelijkbaar met sporen van de wild type stam, die aangeeft dat d...

Discussie

Sterilisatie van oppervlakken met behulp van lage-temperatuur, lagedruk plasma is een veelbelovend alternatief aan vrij conventioneel sterilisatie procedures zoals behandeling met ioniserende straling, chemische stoffen (zoals gassen als H₂O₂ of ethyleenoxide) of droge en vochtige warmte²³. Gewone sterilisatie methoden bieden meestal een doeltreffende sterilisatie, maar ze zijn bekend om te beïnvloeden het behandelde materiaal en vertegenwoordigen een potentieel risi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Two substance nozzle (model 970-8)	Schlick	14.404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0,8 mm boringdiameter
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Tube connectors	Festo	n/a	G 1/8
Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC	Bosch Rexroth	820005100
PLN Polyamid tube	Festo	558206	d = 6 mm
Glass slides	VWR	48300-026
Electric Timer 550-2-C	Gefran	F000074	220 V
attofluor cell chamber	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, rond
MgSO4*7 H2O	Sigma Aldrich	13152
Ca(NO3)2	Sigma Aldrich	202967
MnCl2 * 4 H2O	Sigma Aldrich	244589
FeSO4 * 7H2O	AppliChem	13446-34-9
Glucose	Merck	215422
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G
Nutrient Broth (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
96-wellplate	ThermoFisher	243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
Leo 1530 Gemini	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software)	Systat GmbH, Erkrath, Germany	n/a
Attofluor cell chamber	Invitrogen	A7816
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom	ibidi	81168