Een neuraal netwerk-gebaseerde identificatie van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen

Summary

Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beoordeling van ontwikkelingsstoornissen bekwaamheid oöcyt uitgevoerd tijdens hun rijping in vitro van het vesikel germinal aan de metafase-II. Deze methode combineert time-lapse imaging met particle image velocimetry (PIV) en neurale netwerk analyses.

Abstract

Onvruchtbaarheid klinieken zou profiteren van de mogelijkheid om te kiezen van ontwikkelingsachterstand bevoegde vs. incompetent eicellen met behulp van niet-invasieve procedures, dus de verbetering van de algehele uitkomst van de zwangerschap. We onlangs ontwikkelde een methode van de classificatie gebaseerd op microscopische levende observaties van muis eicellen tijdens hun rijping in vitro van de germinal Vesikel (GV) naar de metafase-II fase, gevolgd door de analyse van de cytoplasmatische bewegingen Deze time-lapse periode optreedt. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen van deze procedure. Eicellen zijn geïsoleerd van volgroeide follikelgroei follikels en gekweekte voor 15u binnen een microscoop voorzien voor time-lapse analyse bij 37 ° C en 5% CO₂. Foto's zijn genomen op 8 min intervallen. De beelden worden geanalyseerd met behulp van de Particle Image Velocimetry (PIV) methode die berekent, voor elke oöcyt, het profiel van cytoplasmatische beweging snelheden (CMVs) die zich voordoen gedurende de cultuur. Tot slot, de CMVs van elke één oöcyt worden gevoed via een wiskundige indeling-hulpprogramma (Feed-forward kunstmatig neuraal netwerk, FANN), die de kans op een gameet ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente met een nauwkeurigheid van 91.03% voorspelt. Dit protocol, ingesteld voor de muis, kon nu worden getest op de eicellen van andere soorten, inclusief de mens.

Introduction

Vrouwelijke onvruchtbaarheid is een pathologie die een steeds groter aantal vrouwen treft. Volgens de World Health Organization zijn ongeveer 20% van de paren onvruchtbaar, met een 40% als gevolg van vrouwelijke onvruchtbaarheid. Bovendien is eenderde van de vrouwen kankerbehandelingen ondergaan (300.000/jaar en 30.000/jaar in de VS of Italië, respectievelijk) ontwikkelen van prematuur ovarieel falen.

Een strategie ter voorkoming van onvruchtbaarheid bij kankerpatiënten is het isolement en de cryopreservatie van ovariële follikels voordat de oncologische behandeling, gevolgd door in vitro maturatie (GODT) van GV eicellen naar de MI....

Protocol

Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik en ethische commissies aan Universiteit van Pavia. Dieren werden onderhouden onder omstandigheden van 22 ° C, luchtvochtigheid van 60% en een licht/donker cyclus van 12:12 h.

1. eierstok isolatie

1. Intraperitoneally 2 vier-tot-elf weken oude CD1 vrouwelijke muizen met 10 U van follikelstimulerend hormoon met een steriele 1 mL insuline spuit te injecteren.
2. 46-48 h wachten.
3. Weeg de muis en anesthetize met een intramusculaire injectie van 50 mg/kg Zoletil (Tiletamina en Zolazepan cloridrate). Euthanaseren door cervicale d....

Results

Figuur 2 toont een representatieve ontwikkelingsachterstand bevoegde en incompetent oöcyt, respectievelijk aan het begin (GV) en aan het einde (MII) van de GODT-procedure. GODT van volgroeide muis eicellen optreedt tijdens 15u cultuur. De Time-Lapse observatie registreert de progressie van meiose en grote Meiotische evenementen, waaronder de GVBD en de extrusie van de eerste polar lichaam detecteert.

Discussion

Er zijn verschillende kritische stappen een zorgen moet voor tijdens het uitvoeren van dit protocol met muis eicellen alsook met die van andere soorten. Het geïsoleerde uit hun follikels eicellen overgedragen moeten worden onmiddellijk in de opname druppels, zoals de scheiding van de metgezel-cumulus triggers cellen het begin van de overgang van de GV-naar-MII. Een mogelijke wijziging van het huidige protocol zou de toevoeging van 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) naar de M2 medium gebruikt voor isolatie van de COCs. IB.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Hormonal treatment
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	For oocyte heterochromatin staining
Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm	Corning	430165	For COCs isolation
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red	Merck-Millipore	MR-015-D	For COCs isolation
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	For oocyte in vitro maturation
Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom	WillCo	GWSt-3522	For imaging experiments
BioStation IM-LM	Nikon	MFA91001	Live cell screening system
Pasteur pipette	Delchimica Scientific Glassware	6709230	For follicles manipulation
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410	To prevent contamination and medium evaporation
Penicillin / Streptomycin	Life Technologies	15070063	To prevent medium contamination
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	For making up αMEM medium
L-Glutamine	Life Technologies	25030	For making up αMEM medium
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	For making up αMEM medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	For making up αMEM media
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562	For making up αMEM media
Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)	Virbac Srl	QN01AX9	For mice anesthesia
Cell_PIV sofware	Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK	-	-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	-	For multi-paradigm numerical computing