Een neuraal netwerk-gebaseerde identificatie van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen

Summary

Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beoordeling van ontwikkelingsstoornissen bekwaamheid oöcyt uitgevoerd tijdens hun rijping in vitro van het vesikel germinal aan de metafase-II. Deze methode combineert time-lapse imaging met particle image velocimetry (PIV) en neurale netwerk analyses.

Abstract

Onvruchtbaarheid klinieken zou profiteren van de mogelijkheid om te kiezen van ontwikkelingsachterstand bevoegde vs. incompetent eicellen met behulp van niet-invasieve procedures, dus de verbetering van de algehele uitkomst van de zwangerschap. We onlangs ontwikkelde een methode van de classificatie gebaseerd op microscopische levende observaties van muis eicellen tijdens hun rijping in vitro van de germinal Vesikel (GV) naar de metafase-II fase, gevolgd door de analyse van de cytoplasmatische bewegingen Deze time-lapse periode optreedt. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen van deze procedure. Eicellen zijn geïsoleerd van volgroeide follikelgroei follikels en gekweekte voor 15u binnen een microscoop voorzien voor time-lapse analyse bij 37 ° C en 5% CO₂. Foto's zijn genomen op 8 min intervallen. De beelden worden geanalyseerd met behulp van de Particle Image Velocimetry (PIV) methode die berekent, voor elke oöcyt, het profiel van cytoplasmatische beweging snelheden (CMVs) die zich voordoen gedurende de cultuur. Tot slot, de CMVs van elke één oöcyt worden gevoed via een wiskundige indeling-hulpprogramma (Feed-forward kunstmatig neuraal netwerk, FANN), die de kans op een gameet ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente met een nauwkeurigheid van 91.03% voorspelt. Dit protocol, ingesteld voor de muis, kon nu worden getest op de eicellen van andere soorten, inclusief de mens.

Introduction

Vrouwelijke onvruchtbaarheid is een pathologie die een steeds groter aantal vrouwen treft. Volgens de World Health Organization zijn ongeveer 20% van de paren onvruchtbaar, met een 40% als gevolg van vrouwelijke onvruchtbaarheid. Bovendien is eenderde van de vrouwen kankerbehandelingen ondergaan (300.000/jaar en 30.000/jaar in de VS of Italië, respectievelijk) ontwikkelen van prematuur ovarieel falen.

Een strategie ter voorkoming van onvruchtbaarheid bij kankerpatiënten is het isolement en de cryopreservatie van ovariële follikels voordat de oncologische behandeling, gevolgd door in vitro maturatie (GODT) van GV eicellen naar de MII fase (GV-naar-MII overgang). De beschikbaarheid van niet-invasieve merkers van oöcyt developmental bevoegdheid zou verbeteren de bevruchting en de ontwikkelings processen en de algehele zwangerschap succes^1,2.

Op basis van de configuratie van de chromatine waargenomen na kleuring met de supravital fluorescerende Hoechst 33342, zoogdieren volgroeide eicellen worden geclassificeerd als een omgeven Nucleolus (SN) of een niet omgeven Nucleolus (NSN)³. Naast de organisatie van hun verschillende chromatine weer deze twee soorten eicellen vele morfologische en functionele verschillen^{3,4,5,6,7,8 ,9}, met inbegrip van hun bevoegdheid Meiotische en ontwikkelingsproblemen. Als geïsoleerd van het ovarium en verviel in vitro, beide typen van oöcyten reach de MII-fase, en na inseminatie behandeld zijn sperma ontwikkelen naar de fase 2-cel, maar alleen degenen met een SN chromatine organisatie kunnen ontwikkelen tot en met⁹van de termijn. Hoewel goed als een indelingsmethode voor het selecteren van bevoegde vs. incompetent eicellen, is het belangrijkste nadeel de mutagene werking die de fluorescerende zelf en, vooral, het UV-licht wordt gebruikt voor de detectie zou kunnen op de cellen hebben.

Om al deze redenen, we hebben gezocht naar andere niet-invasieve merkers die is gekoppeld aan de SN of NSN chromatine conformatie die het gebruik van Hoechst met behoud van dezelfde hoge classificatie nauwkeurigheid kan vervangen. De time-lapse waarneming van cytoplasmatische beweging snelheden (CMVs) is in opkomst als een functie kenmerkend voor de status van de cel. Bijvoorbeeld, recente studies aangetoond dat de associatie tussen CMVs opgenomen op het moment van bevruchting en de capaciteit van muis en mens zygoten volledige pre-implantatie te voldragen ontwikkeling^10,11.

Op basis van deze eerdere studies, beschrijven we hier een platform voor de erkenning van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen^5,6,7,8. Het platform is gebaseerd op drie hoofdstappen: 1) eicellen geïsoleerd uit follikelgroei follikels zijn eerst ingedeeld op basis van hun chromatine configuratie ofwel als een omgeven nucleolus (SN) of een niet-omringd nucleolus (NSN); 2) time-Lapse beelden van CMVs die zich voordoen tijdens de overgang van de GV-naar-MII van elke één oöcyt worden genomen en geanalyseerd met particle image velocimetry (PIV); en 3) de gegevens die zijn verkregen met PIV worden geanalyseerd met een Feed-forward kunstmatige neurale netwerk (FANN) voor blind classificatie^12,13. Wij geven details van de belangrijkste stappen van de procedure die is ontworpen voor de muis om het beschikbaar worden getest en worden gebruikt voor andere soorten zoogdieren (bijvoorbeeld runderen, aap en mens) klaar te maken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik en ethische commissies aan Universiteit van Pavia. Dieren werden onderhouden onder omstandigheden van 22 ° C, luchtvochtigheid van 60% en een licht/donker cyclus van 12:12 h.

1. eierstok isolatie

1. Intraperitoneally 2 vier-tot-elf weken oude CD1 vrouwelijke muizen met 10 U van follikelstimulerend hormoon met een steriele 1 mL insuline spuit te injecteren.
2. 46-48 h wachten.
3. Weeg de muis en anesthetize met een intramusculaire injectie van 50 mg/kg Zoletil (Tiletamina en Zolazepan cloridrate). Euthanaseren door cervicale dislocatie.
4. Het begrijpen van de huid die betrekking hebben op de buikwand met behulp van een paar dissectie pincet. De huid en lichaam muur knippen met een schaar en trek de snede open met een tang.
5. Met behulp van een pincet, verplaatsen de ingewanden opzij, de baarmoeder horens lokaliseren en lokaliseren van de eierstokken op hun extremiteit.
6. Zachtjes Houd het ovarium horlogemaker pincet gebruiken en gebruik van schaar te snijden van de ligament naar de baarmoeder. Herhaal met de andere eierstok.
7. Breng de verzamelde eierstokken in een 35-mm cel cultuur petrischaal met 1 mL van M2 isolatie medium vooraf bij 37 ° C, 5% CO₂ in lucht opgewarmd.
8. Verwijder het vet en het oviduct met fijne schaar onder een stereomicroscoop.

2. isolatie van Cumulus oöcyt complexen

1. Het aanprikken van de eierstokken oppervlak met behulp van steriele pincet en een 1G steriele insuline naald tot follikelgroei cumulus oöcyt complexen (COCs) zijn passief vrijgegeven.
2. Verzamelen COCs met meer dan drie lagen van cumulus cellen met behulp van een mond-gecontroleerde hand-getrokken Pasteur micropipet (200 µm in diameter) en ze vervolgens overbrengen naar een daling van de 300 µL van verse M2 medium.
3. De cellen van de cumulus rondom de eicellen met behulp van een hand-getrokken Pasteur micropipet (80 µm in diameter) verwijderen door zachtjes pipetteren in en uit gedurende enkele seconden,
4. Herhaaldelijk eicellen van een daling van de 20 µL van M2 medium te overbrengen naar een andere, totdat cumulus cellen worden volledig geëlimineerd.

3. chromatine oöcyt organisatie gebaseerde indeling

1. Bereiden Hoechst 33342 kleurstofoplossing op een eindconcentratie van 0,05 µg/mL in M2 middellange vanaf een moeder-oplossing van 5 mg/mL verdund in 1 x PBS.
2. Plaats 3.5 µL micro druppels van Hoechst kleurstofoplossing aan de onderkant van een 35 mm petrischaal deksel.
3. Elke één oöcyt overboeken naar een Hoechst kleuring drop, zet de schotel op een voorverwarmde (37 ° C) Verwarming bord en bedek het met een donkere deksel om te voorkomen dat lichte expositie.
4. Na 10 min van incubatie bij kamertemperatuur, observeren de eicellen met een fluorescentie Microscoop op 10 X vergroting onder UV-licht (330-385 nm), voor niet meer dan 1-2 s.
5. Eicellen te classificeren als een omgeven nucleolus (SN) (figuur 1A), als ze een ring van Hoechst-positieve chromatine rondom de nucleolus presenteren.
6. Eicellen te classificeren als een niet omgeven nucleolus (NSN), als hun nucleolus wordt niet omringd door Hoechst-positieve chromatine en shows hétérochromatique plekken binnen de kern (figuur 1B verspreiden).

4. neurale netwerk-gebaseerde oöcyt classificatie

1. Bereiden vier 2 µL druppels van α-MEM medium aangevuld met 5% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 2 mM L-glutamine, 5 mM taurine, 100 U/mL penicilline, 75 µg/mL streptomycine en 23,5 µg/µL natrium pyruvaat in een 35-mm glas onderste petrischaal en bestrijk ze met voorverwarmde (37 ° C) en vooraf zijn geëquilibreerd minerale olie om te voorkomen dat middelgrote verdamping.
   Opmerking: Als een levende cel-screening-systeem gebruikt, houd de druppels op een bepaalde afstand met behulp van een getekende raster van 7 x 7 mm als leidraad.
2. Overdracht 3 - 4 eicellen tot elke druppel.
3. Plaats de glazen bodem petrischaal in een levende cel-screening systeem, voorzien van time-lapse opnamesoftware (Zie Tabel of Materials), waardoor de waarneming van de oöcyt rijping in een omgeving met stabiele temperatuur (37 ° C) en CO₂ concentratie (5%).
4. De time-lapse opnamesoftware niet openen. Op het scherm verschijnt een venster met een live opname van de oöcyt aan de linker kant en de instelling alle knoppen aan de rechterkant.
5. Selecteer het midden van de oöcyt te plaatsen in het midden van het scherm. Focus aanpassen indien nodig.
6. Selecteer de knoop van de Ph en de Lamp van de DIA ingesteld op 192; de belichtingstijd te 1/125 s; de krijgen tot 1.99; en de resolutie tot 1600 x 1200.
7. Selecteer FL2 en de Lamp van de DIA ingesteld op 5; de belichtingstijd voor 3 s; de krijgen tot 2.37; en de resolutie tot 1600 x 1200.
8. Selecteer de knop New wijs om het opnemen van het standpunt van de oöcyt in de daling van de cultuur. Herhaal dezelfde routine voor elke oöcyt binnen de daling van de cultuur.
9. Selecteer tijd en stel de overname cyclus op 8 min en de totale tijd om 15u.
10. Selecteer time-lapse starten om te beginnen met de opname-cyclus.
11. Open de software MATLAB en schrijf >>cell_piv; en selecteer vervolgens de PIV-Tool.
12. Kies de map met de opgenomen film en selecteer een van de JPEG-bestanden te laden van de hele Afbeeldingsvolgorde. Selecteer voor elke oöcyt, de regio van belang (ROI) door te klikken op het gereedschap gebied selecteren.
13. Selecteer Proces PIV in het menu bestand. Selecteer de knop Viewer Tool .
    Opmerking: Het programma berekent de vectoren van de snelheid binnen de ROI en automatisch produceert een gegevensbestand, opgeslagen als een .mat-bestand.
14. Selecteer het bestand .mat te openen. Selecteer de knop Selecteer ROI tool en teken een cirkel rond de omtrek van de oöcyt. Klik op opslaan in het menu bestand.
    Opmerking: De vectoren in deze regio worden nu weergegeven en de gegevens van de gemiddelde omvang in de graph-venster bijgewerkt voor deze nieuwe ROI.
15. Open de gegevens verzameld van de gemiddelde omvang van de hele time-lapse frames opgenomen in een werkblad, met de rijen, de framereeks en op de kolommen, elke één oöcyt geanalyseerd.
16. De gegevens van zowel NSN en SN eicellen ingedeeld in subgroepen van 10.
17. 9 subgroepen kunt trainen de feed-forward kunstmatig neuraal netwerk iteratief (FANN) en 1 subgroep voor het testen van de blind.
    1. Herhaal een ander 9 keer, veranderen de blinde testen monster (10-fold Kruis-validatie).
18. MATLAB open, rennen de op maat gemaakte script- belangrijkste en, desgevraagd, invoegen de naam van het bestand met de trainingsgegevens (train.txt), het aantal NSN en SN eicellen gebruikt voor de opleiding en de time-lapse interval om te worden geanalyseerd (meestal vanaf frame # 1-2 om frame # 112-113).
19. Druk op enter om uit te voeren van de opleiding.
20. Invoegen de naam van het bestand met de testgegevens (test.txt).
21. Open het vector test_outputs_cyt in MATLAB werkruimte.
    Opmerking: Er verschijnt een venster op het scherm weergegeven, in de eerste rij, de kans op het verkrijgen van True Positives (TP of ware NSN) en valse positieven (FP of valse NSN) voor NSN en SN eicellen, respectievelijk; in plaats daarvan, in de tweede rij, de kans op het verkrijgen van valse negatieven (FN of valse SN) en echte negatieven (TN of ware SN) voor NSN en SN eicellen, respectievelijk.
22. Gebruik de formule: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), voor de berekening van de FANN nauwkeurigheid, uitgedrukt als een percentage.

Results

Figuur 2 toont een representatieve ontwikkelingsachterstand bevoegde en incompetent oöcyt, respectievelijk aan het begin (GV) en aan het einde (MII) van de GODT-procedure. GODT van volgroeide muis eicellen optreedt tijdens 15u cultuur. De Time-Lapse observatie registreert de progressie van meiose en grote Meiotische evenementen, waaronder de GVBD en de extrusie van de eerste polar lichaam detecteert.

Discussion

Er zijn verschillende kritische stappen een zorgen moet voor tijdens het uitvoeren van dit protocol met muis eicellen alsook met die van andere soorten. Het geïsoleerde uit hun follikels eicellen overgedragen moeten worden onmiddellijk in de opname druppels, zoals de scheiding van de metgezel-cumulus triggers cellen het begin van de overgang van de GV-naar-MII. Een mogelijke wijziging van het huidige protocol zou de toevoeging van 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) naar de M2 medium gebruikt voor isolatie van de COCs. IB...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Hormonale behandeling
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Voor heterochromatine-kleuring van oocyten
Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm	Corning	430165	Voor COCs isolatie
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, met fenol rood	Merck-Millipore	MR-015-D	Voor COCs isolatie
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	Voor oöcyte in vitro rijping
Cell culture Petri-dish 35 mm met glazen bodem	WillCo	GWSt-3522	Voor beeldvormingsexperimenten
BioStation IM-LM	Nikon	MFA91001	Systeem voor live celscreening
Pasteur pijpje	Delchimica Scientific Glassware	6709230	Voor follikel manipulatie
Mineralolie	Sigma-Aldrich	M8410	Om besmetting en medium verdamping te voorkomen
Penicilline / Streptomycine	Life Technologies	15070063	Om mediumbesmetting te voorkomen
Foetaal runderserum (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	Voor het maken van αMEM medium
L-Glutamine	Life Technologies	25030	Voor het maken van αMEM medium
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Voor het maken van αMEM medium
Rund serumalbumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	Voor het maken van αMEM media
Natriumpyruvaat	Sigma-Aldrich	P4562	Voor het maken van αMEM media
Zoletil (Tiletamina en Zolazepan cloridrate)	Virbac Srl	QN01AX9	Voor muizenanesthesie
Cell_PIV software	Vriendelijk verstrekt door Dr. Shane Windsor, Universiteit van Bristol, VK	-	-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	-	Voor numerieke berekeningen met meerdere paradigma's