Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

11.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56675

⸱

17 november 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Samenvatting

Cel-autonome neuronale functies van genen kunnen worden onthuld door het veroorzaken van verlies of winst van de functie van een gen in een kleine en spaarzame bevolking van neuronen. Vereist voor het genereren van een mozaïek waarin neuronen met verlies of winst voor de functie van een gen zijn omringd door genetisch onverstoorbaar weefsel om dit te doen. Hier combineren we het Cre-lox recombinatie systeem met in utero electroporation om te genereren van mozaïek hersenweefsel die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de cel-zelfstandige functie van genen in neuronen. DNA constructies (beschikbaar via repositories), codering voor een fluorescerende label en Cre recombinase, worden ingevoerd in de ontwikkeling van de corticale neuronen met genen geflankeerd met loxP sites in de hersenen van muis embryo's met behulp van in utero Electroporation. Daarnaast beschrijven we verschillende aanpassingen aan de in utero electroporation methode waardoor overlevingsvermogen en reproduceerbaarheid. Deze methode omvat ook tot oprichting van een titer voor Cre-gemedieerde recombinatie bij een schaars of dichte bevolking van neuronen. Histologische preparaten van gelabelde hersenweefsel vereisen geen (maar kan worden aangepast aan) immunohistochemistry. De constructies gebruikt garanderen dat label fluorescently neuronen dragen het gen voor Cre recombinase. Histologische preparaten toestaan morfologische analyse van neuronen via confocal beeldvorming van dendritische en axonale arbors en dendritische spines. Omdat verlies of winst van functie in sparse mozaïek weefsel wordt bereikt, wordt deze methode kunnen de studie van cel-autonome noodzaak en de toereikendheid van gene producten in vivo.

Inleiding

Het genereren van een genetische mozaïek is een klassieke experimentele paradigma voor het begrijpen van de functie van een gen van belang. Om te bepalen als een gen noodzakelijk voor een cellulaire fenotype is, wordt de eenvoudigste aanpak veroorzaakt door een verlies van functie van het gen in het organisme (bijvoorbeeld knock-out). Om te bepalen als een gen specifiek in een bepaalde celtype vereist is, is knock-out van het gen in het organisme echter niet een geldige benadering. In plaats daarvan een methode is verplicht die zal leiden tot het verlies van functie van een gen in een bepaalde cel terwijl het wordt omringd door wildtype (dat wil zeggen genetisch onverstoorbaar) weefsel — met andere woorden, het maken van mozaïek weefsel. Als de gemuteerde cel een mutant fenotype toont, maar omringende wildtype cellen niet, de functies van het gen in een cel-autonome wijze. Analyse van mozaïek weefsel, waarin mutantcellen zijn omringd door wildtype weefsel, is ideaal voor het begrijpen van de cel-autonome functies van genen, met name in de hersenen waar neuronen en glia een uitgebreid, onderling verbonden netwerk van weefsel vormen.

Verschillende vormen van mozaïek hersenweefsel hebben verstrekt krachtige modellen om te onderzoeken van cel-autonome functies van genen. Studies gericht op neuronale transplantatie1, vrouwelijke X-gebonden mozaïcisme2,3,4, en endogene somatische mozaïcisme5,6 hun conclusies op basis van mozaïek hebben getrokken hersenweefsel. Voorwaardelijke schrapping van een gen door middel van de Cre-lox recombinatie systeem is een methode die volledig gebruik van de grote beschikbaarheid van transgene muis lijnen maakt. Bij deze methode worden twee loxP sites geïntroduceerd aan weerszijden van een vereiste sequentie van een gen (zoals een exon), waarbij het geflankeerd door loxP sites dat beide in dezelfde richting ("floxed") worden geconfronteerd. CRE recombinase excises de volgorde tussen de sites loxP7. CRE-gemedieerde recombinatie kan worden bereikt door Overstekende floxed muizen naar een andere muis lijn uiting van Cre recombinase samen met een fluorescerende marker in een subset van cellen ("Cre verslaggever lijn"). Dit is aangetoond in een verscheidenheid van manieren om de functies van een gen in subsets van cellen, zoals de excitatory neuronen of astrocyten8bloot te leggen. CRE verslaggever lijnen kunnen uitdrukken CreERT2 zodat Cre-gemedieerde recombinatie als drug-afleidbare (single-neuron labelen met afleidbare Cre-gemedieerde knockout of SLICK)9. In een andere strategie genaamd mozaïek analyse met dubbele markeringen (MADM)10,11, laat Cre-gemedieerde interchromosomal recombinatie een homozygoot mutant naast heterozygoot weefsel worden gemaakt. In deze benaderingen moet een nieuwe lijn van muizen worden geproduceerd elke keer voor elke kandidaat-gen of cellulaire subtype dat wordt getest. Als alternatief, Cre recombinase kan worden ingevoerd postnatale stadium manifesteren door middel van Iontoforese12 of via virale vectoren (b.v. virussen adeno-geassocieerde13 of lentivirussen14 cellulaire subtype-specifieke uitvoering initiatiefnemers). Deze strategie maakt sterke en postnatale labeling. Te richten op ontwikkeling van cerebrale corticale neuronen dunbevolkte en geïnduceerd, is een ideale strategie in utero electroporation van Cre recombinase met een fluorescerende marker.

Naast het combineren van Cre-lox recombinatie door in utero electroporation te produceren mosaic weefsel in vivo, we verscheidene aanpassingen kennismaken met procedures van andere gepubliceerde protocollen15,16, 17,18,19,20,21. Wij bieden informatie om succes in de getimede-zwangere vrouwelijke fokdieren. Wij ook een overzicht van onze twee strategieën in te voeren schaars en heldere labeling van neuronen in de corticale weefsel: een strategie is om de niveaus van een enkele construct codering voor Cre recombinase en een fluorescerende marker22Titreer. Een andere strategie is het gebruik van de "Supernova"-systeem, ontworpen specifiek met deze parameters in gedachten23,24. Daarnaast bieden wij verbeteringen op het produceren van consistente microinjection pipetten en vereenvoudigingen van de in utero electroporation operatie. Tot slot schetsen we kritische stappen in een vereenvoudigde histologisch preparaat dat de analyse van dendritische spines en dendritische en axonale arbors, zonder verdere kleuring of immunohistochemistry toelaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van James Madison University, en zijn overeenkomstig en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren.

1. muis Set-up

  1. Huis van een jonge (> P60) mannelijke en vrouwelijke homozygoot floxed muis samen aan het opzetten van een kweker paar25.
    Opmerking: Een goede negatieve controle is het opzetten van een paar extra Fokker van wildtype muizen, in welke Cre recombinase expressie niet leiden een mozaïek-26 tot zal.
  2. Toestaan dat de vrouw te bevallen en verhogen haar eerste nestje met het mannetje. Houd het mannetje samen met het vrouwtje te verhogen van het nest overleven. Na het spenen van het nest, bijvoorbeeld op postnatale dag (P) 21, scheiden de vrouwelijke en mannelijke.
  3. Lymfkliertest fokken
    1. Een getimede paring tussen de vrouwelijke en mannelijke25instellen Gebruik visuele aanwijzingen te bepalen van de cyclus van de estrus van de vrouwelijke27, voor vaginale stekkers de ochtend na de paring25.
    2. Als een stekker wordt gevonden, scheiden, en wegen van het vrouwtje. Rekenen van de dag als embryonale dag (E) 0,5.
    3. Blijven met een gewicht van het vrouwtje elke 3-5 dagen om te bepalen als zij zwanger is. Zwangere vrouwen hebben een 10-20% toename in lichaamsgewicht 7-10 dagen na de bevruchting (E0).
      Opmerking: Deze stap bevestigt zwangerschap eerder en meer betrouwbaar dan de visuele inspectie25.
    4. Als de vrouw niet zwanger is, herhaal stap 1.3.1-1.3.3.
  4. Zodra de zwangerschap bevestigd is, de datum van de in utero electroporation kiezen. Te richten op laag II/III corticale piramidale neuronale voorlopercellen, electroporation op E15.5 uit te voeren.

2. DNA set-up

  1. Kies een enkele DNA construeren dat codes voor Cre recombinase evenals een fluorescerende marker, zoals groen fluorescente proteïne (GFP)28,29. Alternatief, gebruik de "Supernova" systeem in detail beschreven in eerdere publicaties23,24. Zie lijst van materialen bijvoorbeeld construeert.
  2. Versterken de bedrijfsscholen DNA uit stap 2.1 in E. coli met behulp van standaard microbiologische technieken30.
  3. Het zuiveren van de DNA-constructie met een plasmide endotoxine-gratis reiniging kit na instructies van de fabrikant. Elueer de constructie met endotoxine-gratis water.
    Opmerking: Het kiezen van een endotoxine-gratis reiniging kit over een standaard zuivering kit is van cruciaal belang.
  4. Het concentreren van het eluaat DNA tot 1-3 mg/mL afhankelijk van gewenste labeling dichtheid26.
    Opmerking: Een titer moet altijd worden vastgesteld bij het werken met een nieuwe DNA-constructie, gezien het feit dat ze verschillende lengtes en initiatiefnemers hebben. Overweeg het injecteren van een constructie op verscheidene verschillende concentraties en/of bedragen te evalueren expressie. Bijvoorbeeld injectie van 1 µL of 1,5 µL van 2,0 mg/mL GFP. CRE is kundig voor sparse (1 µL) of dichte (1,5 µL) veroorzaken labeling van laag II/III visuele corticale piramidale neuronen26.
  5. Toevoegen van 0,4% trypan blauw in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 H2O, aangepast aan de pH 7.4 met HCl) 1:10 tot en met de geconcentreerde oplossing van DNA.
  6. 10 x PBS 1:10 aan de geconcentreerde oplossing van DNA toevoegen.
  7. Opslaan van de geconcentreerde oplossing van DNA bij 4 ° C. De oplossing kan voor onbepaalde tijd worden opgeslagen.

3. Pipet Set-up

  1. Via een glazen capillaire puller, trek een pipet met een zeer lange (10-15 mm) taper en zeer fijne tip, typisch voor pipetten voor embryonale stamcellen injectie of nucleaire overdracht31.
    Opmerking: Om te verhinderen dat puin besmetten de pipetten, ze moeten plaatsvinden binnen 2 dagen na de operatie.
    1. Kalibreer de glazen capillaire trekker door het uitvoeren van een test van de oprit, na instructies van de fabrikant. Gebruik de resulterende waarde van de warmte te programmeren een trekken protocol met de volgende parameters: warmte = (oprit Testwaarde + 15), trekken = 30, vel = 120, tijd = 100, druk = 200. De glazen viscometerbuizen invoegen, zet vast te klemmen aan de trekker, en activeert u het geprogrammeerde trekken protocol, het creëren van een taper op de glazen viscometerbuizen.
    2. Zorg ervoor dat de conus lengte tussen 10-15 mm met behulp van een microscoop met samengestelde licht (bijvoorbeeld 10 X doelstelling)31.
  2. Breken terug de pipet om een ruwe randen tip tot 20-25 µm diameter.
    1. Centreren van een éénlaags taak veeg (Zie materiaallijst) over een 50 mL bekerglas en stretch veeg strak met één hand. Houden met de andere hand, en druk op een pipet (taper zijde naar beneden) loodrecht en volledig door het centrum voor de wipe, waardoor een clean break in de conus31.
      Opmerking: Duwen de pipet volledig via de wipe zal produceren een 20-25 µm diameter tip ongeveer 70% van de tijd.
    2. Bevestigen onder een samengestelde microscoop van licht (bijvoorbeeld 20 x doelstelling).
      Let op: Gebruik de bescherming van de ogen tijdens het breken van de ruit.
  3. Kalibreren van een pipet door zuigen 1 µL van 0,4% trypan blauw in 1 x PBS in een gedeeltelijk gevulde piptte, dan zijn afstuderen van de pipet met 1 µL aftekeningen op basis van de hoogte van 1 µL in de pipet, met behulp van een schone-tipped alcoholbestendig markering. Gebruik de geijkte pipet om af te studeren van de andere pipetten voordat de teruggooi. Houd pipetten in een pipet houder vrij van stof en andere deeltjes.

4. in Utero Electroporation

  1. Graefe pincet, iris schaar Hartman mug pincet, niet-geweven gaas sponzen, ring-tipped pincet en petrischalen plaats op een roestvrijstalen dienblad en wikkelen met aluminiumfolie. Plaats de lade en 1 L 0.9% zoutoplossing (0,9% wt/vol NaCl in water) in autoclaaf. Autoclaaf bij 121 ° C en 3,5 kPa voor 40 min. uit autoclaaf verwijderen en plaatsen in een gedesinfecteerde chirurgische gebied.
    Opmerking: Het is van cruciaal belang voor het handhaven van de steriele omstandigheden tijdens de operatie.
  2. Warm de gesteriliseerde met autoclaaf zoute 1 L-fles in een kleine waterbad tot 38 ° C ten minste 2 uur vóór de operatie.
  3. Sluit de pincetten-type elektroden en het voetpedaal aan de generator (zie lijst van materialen). Na instructies van de fabrikant, stellen de generator te leveren vijf 50 ms pulsen van 50 V (met een interval van 950 ms) wanneer geactiveerd door het voetpedaal. Desinfecteren van de pincetten-type elektroden en plaats op het ontsmet chirurgische gebied.
  4. Een verdoving neus kegel als eerder gepubliceerde32maken, maar het einde van een nitril of latex handschoen vinger gebruiken om te vormen van een membraan dat stevig over de opening van de neus past. Een gat in het middenrif groot genoeg om te passen over de snuit van de muis.
  5. Diep anesthetize zwangere muizen op E15.5 in een inductie kamer gevuld met Isofluraan (2-4%) in zuivere zuurstof stromen om 1 L/min. Na ~ 1 min, test de restarmen reflex (zachtjes kantelen van de kamer van de inductie en ervoor zorgen dat de muis niet zelf recht). Weeg muis om te bepalen van de dosering van analgesie toegediend later tijdens de operatie.
  6. De muis overbrengen in het chirurgische gebied en beheren van geïnhaleerde Isofluraan (1-2%) in zuivere zuurstof stromen om 1 L/min door een neus kegel te houden muis in chirurgische vlak. Pincet gebruiken voor het testen van de pedaal reflex (de poot zachtjes knijpen en ervoor zorgen dat de muis niet een reflex terugkeert) om te controleren of afstomping. Ademhaling en inspanning, op zoek naar diepe, regelmatige ademhaling controleren (~ 70-100 adem/min), en dat de slijmvliezen roze kleur en vochtig zijn.
  7. Toepassing genoeg veterinaire ophthalmic zalf zand in de ogen te hen volledig te dekken voor bescherming tegen drogen tijdens de procedure.
  8. Flex de metalen activator disc van een verzegelde zak gevuld met oververzadigd zoutoplossing (zie lijst van materialen), activering van een exotherme kristallisatie van het zout. Leg 2 éénlaags taak doekjes op de top van het zakje, en plaatst u de muisaanwijzer op het zakje te handhaven van de lichaamstemperatuur.
  9. Massage ontharende room op de buikstreek met katoen swabs tot buik bont oplost (ongeveer 20-40 s), dan vegen abdominale bont. Zorgvuldig schoon uit eventuele resterende residu en ontharende room met 70% ethanol en katoenen wissers. Plaats een fenêtré steriele chirurgische draperen over de buikstreek.
  10. Met behulp van aseptische techniek, trek de huid omhoog en weg van de buik met een Graefe Tang, en maak een incisie van de ventral midline ~ 2 cm op de huid met behulp van iris schaar, ervoor te zorgen dat de onderliggende spier wordt niet gesneden.
    Opmerking: Een aanvaardbaar alternatief voor het maken van een incisie met Graefe pincet en iris schaar is met een scalpel, zoals eerder gepubliceerd17.
  11. Vinden van de linea alba te visualiseren van de middellijn van de rectus abdominis. Spier trekken omhoog en weg van de buik met een Graefe Tang, en een ander ~ 2 cm middellijn incisie er te maken met iris schaar, bloot de buikholte (de baarmoeder is doorschijnend en embryo's zullen zichtbaar onder). Zorg ervoor dat onderliggende baarmoeder en intestinale weefsel niet wordt gesneden. De incisie slechts groot genoeg zijn (meestal ~ 2 cm) uitlichten en maken de baarmoeder comfortabel bloot.
    Opmerking: Een aanvaardbaar alternatief voor het maken van een incisie met Graefe pincet en iris schaar is met een scalpel, zoals eerder gepubliceerd17.
  12. Met behulp van een steriele 10 µL micropipet tip, afzien carprofen (ontbonden in steriele zoutoplossing 0,9%) bij 4 mg/kg in de buikholte voor analgesie.
  13. Klem een Hartman mug pincet op de linkerrand van de rectus abdominis incisie. De verlostang stilhoudt boven gekanteld petrischaal aan de linkerkant van de incisie, het open houden van de linker kant van de snede. Een ander Hartman mug pincet klem op de rechterrand van de rectus abdominis incisie en de verlostang stilhoudt boven een gekanteld petrischaal rechts van de incisie, het open houden van de rechterkant van de incisie. Plaats gaas spons rond het gedeelte van de incisie.
  14. Met behulp van ring pincet (zonder een bijgevoegde limiet schroef), trek op de baarmoeder tussen elke twee naburige embryo's zonder breken of verwonden van een weefsel. Beginnen te trekken uit alle embryo's door middel van de incisie, leggen ze op de top van het gaas spons. Wanneer trekken uit de laatste embryo's uit de buikholte, zorg ervoor dat niet te trekken op de eierstokken of de baarmoederhals. Zodra blootgesteld, is het essentieel de baarmoeder om vochtig te houden met warme zoutoplossing. De baarmoeder bevinden zich doorgaans tussen 5 en 8 embryo's.
    Opmerking: Het is mogelijk om penicilline en streptomycine toevoegen aan de zoute17.
  15. Een geijkte pipet verbinden met de binnenband aspirator (zie lijst van materialen), en precies 1 µL van de DNA-oplossing bereid in stap 2 tot en met de baarmoederwand in een laterale ventrikel van elk embryo te injecteren. Laterale ventrikels verschijnen als twee patches op de dorsale telencephalon van het embryo (patches zijn donkerder dan de omringende weefsel van telencephalon). Gebruik de duim en wijsvinger tijdens microinjection en electroporation te manipuleren van de embryo's, onthullen de laterale ventrikels en waardoor de embryo's worden zachtjes duwde tegen de baarmoederwand tijdens de injectie. Bevestig succesvolle injectie door het observeren van trypan blauwe vullen de laterale ventrikel.
  16. Plaats de kathode van pincetten-type elektroden (Zie materiaallijst) op de baarmoeder, direct boven de mediale en caudal cortex te richten op de visuele cortex (gericht op alternatieve gebieden van de hersenen zullen vereisen verschillende elektrode plaatsing)16, 26. Plaats de anode op de baarmoeder, gewoon minderwaardig en anterior to de embryo's hoofd.
  17. Bevestigen dat de anode en de kathode de baarmoeder rondom het embryo op de juiste locaties zijn ontroerend. Met een voetpedaal, leiden tot de levering van vijf 50 ms pulsen van 50 V (met een interval van 950 ms) over de elektroden.
    Opmerking: De ingespoten, negatief-geladen DNA gaan naar de kathode en zullen worden opgenomen in de ventriculaire zone cellen zich het dichtst bij de kathode.
  18. De baarmoeder terugkomen in de buikholte in dezelfde afdrukstand bleek. Zoutoplossing gebruiken om te smeren van de baarmoeder, terwijl begeleiden het handmatig en zeer zacht, verzorgen niet te verdringen van embryo's uit hun positie in de baarmoeder.
  19. Sluit de buikspieren aan te spannen met absorbeerbare hechtingen (Zie materiaallijst) met behulp van een eenvoudige onderbroken steek, de uiteinden voorzien van een knot chirurg van koppelverkoop. Niet clip die de uiteinden te dicht bij de knoop niet of de knoop wordt ze.
    Opmerking: Het is van cruciaal belang hechtdraad de buikspieren aan te spannen zodat de randen van de wond volledig gesloten zijn dicht, maar zonder Blancheren van de spier. Knopen moet strak zodat ze niet ze kunnen worden.
  20. Sluit de huidlaag met absorbeerbare draadjes (eenvoudige onderbroken stitch, chirurg van knot, zoals in stap 4.19). Breng een kleine hoeveelheid weefsel lijm voor het afdichten van de wond. Breng weefsel lijm op de knopen om te voorkomen dat unfastening. Gebruik een micropipet om te verwijderen van een lijm van weefsel rond de wond die door de micropipet kan worden aanzuiging.
  21. Lagere Isofluraan niveaus tot 0,5-1,5%. Eenmaal weefsel lijm droog (test door het aanraken van de handschoen lijm), verwijderen van Isofluraan en vrouwelijke herstellen alleen in een warme kooi toestaan. Beheren van buprenorfine intraperitoneally bij 0,03 mg/kg met behulp van een injectiespuit 1 mL met een 26G, ½" naald.
  22. Blijven volgen van de muis totdat de muis is volledig hersteld en normaal gedraagt (dat wil zeggen het verzorgen, verkennen van de kooi, eten of drinken). Eenmaal hersteld, zet vrouwelijke weer kooi met man.
    Opmerking: Als alle stappen worden gevolgd, de muis zal meestal herwinnen bewustzijn binnen 2 min en onmiddellijk beginnen met het verplaatsen over de kooi, geen tekenen van ongemak.
  23. Als de muis tekenen van ongemak (bijvoorbeeld gebogen houding, porfyrine afscheidingen)33 vertoont, beheren carprofen bij 0,1 mg/mL in watervoorziening. Als verschillende tekens van ongemak aanwezig zijn, of als het ongemak aanhoudt voor meer dan 4 uur ondanks carprofen administratie, onmiddellijk door het toedienen van een intraperitoneaal dodelijke injectie van ketamine (240 mg/kg) - xylazine (48 mg/kg) - de muis euthanaseren Acepromazine (1.85 mg/kg) cocktail met behulp van een injectiespuit 1 mL met een 26 G, ½" naald en volgen met een goedgekeurde secundaire vorm van euthanasie33.
  24. Het vergroten van het voortbestaan van electroporated embryo's na de geboorte, houden de kooi in een rustige kamer, vrij van geluiden en trillingen te houden. Verrijken van het milieu met kunststof iglo's, materialen, nesten en voedingssupplementen zoals zonnebloempitten (zie lijst van materialen). Niet bewegen of verstoren van de kooi, met name tijdens de eerste 3 dagen na de bevalling.

5. histologisch preparaat voor fluorescentie microscopie

Opmerking: Dit protocol histologie is geoptimaliseerd voor het opstellen van weefsel van dieren ouder dan postnatale dag (P) 13 die electroporated in utero werden. Ter voorbereiding van weefsel van jongere postnatale dieren (P0-P13), is het aanbevolen om Volg alle stappen (waaronder transcardial perfusie), hoewel de hersenen moet worden ingesloten in agar voorafgaand aan de voorbereiding van de secties (stap 5,9). Weefsel kan ook bereid worden uit embryo's binnen 1-2 dagen na electroporation, met behulp van methoden eerder beschreven18,20.

  1. Bereid paraformaldehyde (PFA) oplossing.
    Opmerking: Het is noodzakelijk om te bereiden verse PFA, binnen één dag na het experiment.
    Let op: Paraformaldehyde is giftig en moet worden behandeld in een zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
    1. Om 50 mL 4% PFA, warmte 40 mL water tot 60 ° C. Voeg 2 g PFA al roerend met glazen staaf of roeren bar. Voeg 10 µL van 10 M NaOH elke 2 min tot PFA oplost.
    2. Voeg 5 mL van de 10 x PBS en oplossing brengen een eindvolume van 50 mL met water.
    3. Na het brengen oplossing tot 50 mL, pH aan 7.4 naar wens aanpassen met 10 M HCl. toestaan oplossing om te koelen en bewaren bij 4 ° C.
  2. Euthanaseren muis met een intraperitoneale injectie van ketamine (240 mg/kg) - xylazine (48 mg/kg) - acepromazine (1.85 mg/kg) cocktail met behulp van een injectiespuit 1 mL met een 26G, ½" naald. Transcardially perfuse 10 of 20 mL ijskoud 1 x PBS, gevolgd door 25 of 40 mL vers-en-klare, ijskoude 4% PFA17. Lagere volumes gebruiken voor jonge postnatale (P0-P13) muizen en hogere volumes voor oudere muizen (P14 en hoger).
  3. Onmiddellijk na de perfusie, decapitate muis karkas tussen occipitale bot en C1 wervel met een grote schaar en schil weg en negeren de meeste van de huid rondom de schedel met behulp van iris schaar, met name huid omliggende frontale, pariëtale en occipitale botten. De schedel en de hersenen intact houden.
  4. Plaats de schedel en de hersenen in 10 mL 4% PFA in een conische buis van 50 mL gedurende 24 uur bij 4 ° C na weefsel vast te stellen. Voeg toe 30 mL 1 x PBS aan conische buis te Verdun de oplossing tot 1% PFA voor opslag bij 4 ° C.
    Opmerking: Gebruik een aparte conische buis voor elke schedel en hersenen vast te stellen na. Doen de hersenen niet broeden in 1% PFA langer dan 2 weken, of fluorescentie zal beginnen te vervagen.
  5. Plaats de hersenen en de schedel op een vlakke ondergrond met éénlaags taak doekjes bevochtigd met 1 x PBS. Gebruik een paar pincet (zie lijst van materialen) te verwijderen van alle resterende huid of membraan rond de schedel.
  6. Pincet gebruikt, verwijdert u eerst het achterhoofdsbeen, dan verwijder voorzichtig de pariëtale botten, verplaatsen de pincet uit en weg van het oppervlak van de hersenen. Verwijder voorzichtig alle hersenvliezen om schade te voorkomen aan de cortex.
  7. De achterkant van de pincet wig onder de hersenen langs de schedel te verbreken alle hersenzenuwen en verwijderen van de hersenen.
  8. Voor jonge postnatale (P0-P13) hersenen
    1. Breng 25 mL 4% agar door verwarming van 25 mL 1 x PBS tot 80 ° C. Roer en los 1 g agar met een glazen staaf of roeren bar).
    2. Cool oplossing tot 35 ° C terwijl steeds roer. Hersenen plaats in een kleine container (bijvoorbeeld het GLB van een conische buis van 50 mL) en giet agar oplossing over hersenen. Toestaan agar te verharden.
  9. Het maken van een coronale cut handmatig met behulp van een single-edge scheermesje via de hersenen, ongeveer 0,5 mm rostraal van bregma. Maken een andere coronale knippen door de hersenen ongeveer 0,5 mm caudal visuele cortex. Een pool van Cyanoacrylaat lijm met dezelfde diameter als de rostraal einde van de hersenen op het midden van de vibrerende microtoom specimen schijf plaatsen. Plaats de rostraal uiteinde van de hersenen op de top van de pool van lijm, ervoor te zorgen dat de gehele rostraal oppervlak van het weefsel is gebonden aan de specimen schijf met lijm.
  10. Mount buffer lade op vibrerende microtoom en veilig met ingebouwde klemmen hefboom. Blade invoegen meshouder en meshouder op vibrerende microtoom met ingebouwde klemmen schroef monteren. Beveilig specimen disc met hersenen op buffer lade met behulp van ingebouwde klemmen apparaat. De instelling van de ingestelde snelheid aan 5.70 (= 0.285 mm/s) en frequentie-instelling te 5.33 (53.3 Hz).
  11. Vul de zaal boven het niveau van de hersenen met 1 x PBS en lager het mes in de PBS. Om te beginnen nemen 100 µm coronale secties door middel van het weefsel.
  12. Als geen vereisen verdere verwerking, zoals 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nucleaire kleuring of immunohistochemistry.
    1. Gebruik een fijne omver te werpen verfkwast secties rechtstreeks van de vibrerende microtoom op een microscoopglaasje, montage 4-6 secties op elke dia overzetten.
    2. Toestaan de secties te drogen door wicking weg oplossing met een fijne penseel omver te werpen, zodat de segmenten van de hersenen niet meer op de dia's drijven.
    3. Dan, plaats één druppel inbedmiddel (Zie materiaallijst) op elke sectie op de dia.
    4. Voorzichtig leggen een dekglaasje 24 x 50 mm aan bovenop, ervoor te zorgen dat 1) geen luchtbellen formulier op de secties, 2) de secties niet verplaatsen en 3) de inbedmiddel volledig de oppervlakte tussen de dia en dekglaasje aan. Laat de inbedmiddel te genezen voor ten minste 24-48 uur.
  13. Om vlek kernen met DAPI voor histopathologisch onderzoek van corticale laminae
    1. Gebruik een fijne omver te werpen verfkwast overdracht van elke sectie in een oplossing met 10 µg/mL DAPI (Zie materiaallijst) verdund in 1 x PBS van stamoplossing (20 mg/mL DAPI in water).
    2. Incubeer in DAPI oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gebruik dan een fijne omver te werpen verfkwast om sectie van de DAPI oplossing overbrengen naar 1 x PBS en incubeer in 1 x PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Overbrengen in sectie twee vaker verse 1 x PBS voor elke 5 min. Vervolgens met een fijn penseel omver te werpen, overdracht de sectie op een microscoopglaasje, volg stappen 5.11.2-5.11.4, en ga verder met stap 5.13.
  14. Verwarm een glas petrischaal met Valap (gelijke delen Vaseline, lanoline en paraffine) op een hete plaat op een laag vuur instelling tot volledig gesmolten. Randen van dia's zegel blootgesteld door borstelen op gesmolten Valap.
  15. Inspecteren van fluorescentie in weefsel, een lichte Microscoop of confocal microscoop te gebruiken (zie lijst van materialen) en een filter ingesteld voldoende voor het bekijken van de fluorophore (b.v. DAPI: excitatie 325-375 nm, emissie 435-485 nm; GFP: excitatie 450-490 nm, emissie 500-550 nm)17. Confocale images kunnen worden geschoten met lage - (4 X, numerieke diafragma, NB = 0,20), medium-(20 X, NB = 0,75), en high-power (60 X, NB = 1,40) doelstellingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De single construeren GFP. CRE (Zie materiaallijst) was electroporated op E15.5 en gevisualiseerd op P14. Afhankelijk van de concentratie van de constructie en de omvang van de injectie, kan een schaars of dichte resultaat worden verkregen van22,26. Bijvoorbeeld injectie van 1 µL van 2 mg/mL GFP. De resultaten van het CRE in een verspreide verdeling van gelabelde cellen, waarvan sommige helder (figuur 1A

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier introduceren we de combinatie van in utero electroporation met Cre recombinase bij floxed muizen voor het genereren van mozaïek hersenweefsel. Een voordeel van deze aanpak is dat een nieuwe lijn van de muis niet hoeft te worden gegenereerd elke keer een verschillende cellulaire subtype is gericht: in utero electroporation kan worden gebruikt om te richten excitatory neuronen, remmende neuronen of glia afhankelijk van de tijd en de locatie van electroporation15,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de gulle steun van het James Madison University Department of Biology, James Madison Universiteit licht microscopie en de Imaging faciliteit. Dr. Mark L. Gabriele voor nuttig advies met betrekking tot jonge postnatale weefsel voorbereiding, en Drs. Justin W. Brown en Corey L. Cleland voor gulle coördinatie van chirurgische materialen en ruimte. Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door een gezamenlijke onderzoeksbeurs door 4-VA, een samenwerkingspartnerschap ter bevordering van de Commonwealth van Virginia (G.S.V.), en door een Virginia Academie van Science kleine onderzoek projectsubsidie (G.S.V.). Ondersteuning is royaal voorzien door een Betty Jo liefdevolle Butler ' 58 Endowment Undergraduate Research beurs (aan K.M.B.), een Farrell zomer onderzoek beurs (voor K.M.B.), een James Madison universiteit tweede eeuw beurs (voor K.M.B.), een James Madison Universiteit Centennial beurs (voor C.J.H.), een James Madison Universiteit Lucy Robinson Search ' 30 Memorial Scholarship (aan Z.L.H.) en een James Madison Hogeschool voor wetenschap en wiskunde de toekenning van de bijstand van de faculteit (aan G.S.V.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C57BL/6J muizenThe Jackson Laboratory#000664Zie "1. Muisopstelling" (stap 1.1, "wildtype muizen")
GFP.Cre lege vectorAddGene#20781Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "enkelvoudige DNA-construct die codeert voor Cre-recombinase evenals een fluorescente marker"). GFP.Cre lege vector was een geschenk van Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen#12362Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.3 "endotoxine-vrije plasmide-zuiveringskit")
Trypanblauw poeder, BioReagent-kwaliteitSigmaT6146-5GZie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "trypanblauw")
Natriumchloride, ACS, 2,5 kgVWRBDH9286-2.5KGZie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "NaCl")
Kaliumchloride, ACS, 500 gVWR#97061-566Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "KCl")
Natriumfosfaat dibasisch, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichS0876-100GZie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "Na2HPO4")
Kaliumfosfaat monobasisch, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichP5379-100GZie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "KH2PO4")
Zoutzuur, ACS-reagens, 500 mLFisher ScientificA144-500Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "HCl")
P-97 Micropipet PullerSutter InstrumentP-97Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1 "glas capillaire puller")
3,0 mm brede trog gloeidraadSutter InstrumentFT330BZie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1 "glas capillaire puller")
Dünnwandige Glaskapillaren, 4", 1 / 0,75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1.1 "glas capillair")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5"PhenixLW-8148Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.2.1 "single-ply taakdoek"); andere single-ply doeken (bijv. Kimwipes) kunnen worden gebruikt.
Graefe-pincetten, 7 cm, recht, 0,7 mm 1x2 tandenWorld Precision Instruments#14140Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Graefe-pincetten")
Iris-schaar, 11,5 cm, recht, 12-packWorld Precision Instruments#503708-12Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "iris-schaar")
Hartman-muggenpincetten, 9 cm, recht, 12-packWorld Precision Instruments#503728-12Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Hartman-muggenpincetten")
Algemene niet-geweven sponzen, 2" x 2", 4-laagsMedrepexpress#2204-cZie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "niet-geweven gaas sponzen")
Ring-tip-pincetten, 10 cm, recht, 2,2 mm IDWorld Precision Instruments#503203Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "ring-tip-pincetten")
Pyrex petrischalen compleet, O.D. × H 100 mm × 20 mmSigma-AldrichCLS3160102-12EAZie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Petrischalen")
Vlak type instrumentenbak, roestvrij staal, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"AmazonB007SHGAHAZie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "roestvrij stalen bak")
Platinum Tweezertrode, 5 mmBTX#45-0489Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.3 en 4.16 "pincet-type elektroden")
ECM 830 vo

Referenties

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641(2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163(2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747(2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232(2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Genetische Moza ekanalyseStudie naar Neuronaal FenotypeInjectie van DNA constructTrypanblauw kalibratieConfocale BeeldanalyseSparse Labeling techniekTargeting van Corticale Lagen
Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.