Een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay voor het detecteren van Autoantibody tegen de N-Methyl-D-aspartaat (NMDA)-Receptor in het bloed

Samenvatting

Wij hebben ectopically NR1 subeenheid van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescent proteïne in menselijke embryonale cellen (HEK293) als antigeen te detecteren autoantilichamen tegen NMDA receptor in het bloed van patiënten verdacht met auto-immune encefalitis. Deze eenvoudige methode kan geschikt voor screeningonderzoek in klinische instellingen zijn.

Samenvatting

De aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantibody kan verschillende neuropsychiatrische symptomen veroorzaken in de betrokken patiënten, genoemd anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis. Opsporing van de specifieke autoantibody tegen de NMDA-receptor in het bloed of de cerebrospinale vloeistof (CSF) is essentieel voor de accurate diagnose van deze aandoening. De NMDA-receptor is een ion kanaal eiwit complex dat vier subeenheden bevat, waaronder twee verplichte NMDA receptor subeenheid 1 (NR1) en één of twee NMDA receptor subeenheid 2A (NR2A), NMDA receptor subeenheid 2B (NR2B), NMDA receptor subeenheid 2C (NR2C), of NMDA receptor subeenheid 2D (NR2D). De epitoop van anti-NMDA receptor autoantibody werd gemeld om aanwezig te zijn bij het extracellulaire N-terminale domein van de NR1 subeenheid van de NMDA-receptor. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een eenvoudige cel-gebaseerde immunofluorescentie-test die kan worden gebruikt als een screeningtest voor het detecteren van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NR1 subeenheid van de NMDA-receptor in het bloed te vergemakkelijken van de klinische en fundamentele onderzoek van anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis.

Inleiding

Anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis is een nieuw herkende ziekte-entiteit die kan optreden bij patiënten van alle leeftijden, en beïnvloedt overwegend vrouwelijke patiënten^1,2. Het is een van de meest frequent gediagnosticeerde encefalopathie bij patiënten met eerste onbekende etiologie van encefalitis³. Patiënten getroffen met anti-NMDA receptor encefalitis meestal hebben prodromal symptomen van een hoofdpijn of koorts, gevolgd door de snelle ontwikkeling van de wijzigingen in bewustzijn en een verscheidenheid aan acute neuropsychiatrische symptomen, met inbegrip van agitatie, prikkelbaarheid , angst, slapeloosheid, hallucinaties, wanen, agressie, bizar gedrag, afwijkingen van de beweging, autonome disregulatie en inbeslagneming aanvallen^4,5. Vroege erkenning van deze aandoening en tijdige behandeling met immunotherapie zijn belangrijk voor een beter resultaat en zelfs volledig herstel in getroffen patiënten⁶. Vandaar, wordt voorgesteld dat de anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis moet worden beschouwd als een belangrijke differentiële diagnose van patiënten met acute of nieuwe-onset psychotische kenmerken^7,8te presenteren.

Naast klinische eigenschappen is detectie van autoantibody tegen de NMDA-receptor in het bloed of LIQUOR essentieel voor de accurate diagnose van anti-NMDA receptor auto-immune encefalitis⁹. De meeste van de immunologische tests voor de opsporing van de anti-NMDA receptor autoantibody zijn beschikbaar in een paar onderzoek laboratoria-^10,11, en er is slechts één verkrijgbare cel-gebaseerde immunofluorescentie assay voor screening de anti-NMDA receptor autoantilichamen¹². Het doel van deze studie is het ontwikkelen van een eenvoudige in-house cel-gebaseerde immunofluorescentie-bepaling die op het scherm van de aanwezigheid van anti-NMDA receptor autoantilichamen ter vergemakkelijking van het klinische onderzoek van anti-NMDA receptor gunstig in het laboratorium kan worden gebruikt auto-immune encefalitis. De NMDA-receptor is een heterotetramer ion kanaal eiwit complex specifiek uitgedrukt in de hersenen. Het bestaat uit twee verplichte NR1 subeenheden, en de combinatie van een of twee subeenheden van NR2A, NR2B, NR2C of NR2D¹³. Een eerdere studie gemeld dat de belangrijkste epitoop door de antilichamen gericht op het extracellulaire N-terminale domein van de NR1 subeenheid^{5 was}. Vandaar, in dit protocol, we uiten het menselijke recombinante eiwitten van de NR1-subunit van NMDA receptor gelabeld met groen fluorescente proteïne (GFP) in de menselijke embryonale nier epitheliale cellijn (HEK293), en ontwikkelen van een cel-gebaseerde immunofluorescentie assay te detecteren de IgG-klasse van anti-NMDA receptor autoantilichamen in het bloed.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de institutionele Review Board van Chang Gung Memorial Hospital in Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).

1. bereiding van de NR1-GFP expressie plasmide

1. Mix 10 ng van NR1-GFP plasmide met 100 µL van Escherichia coli bevoegde cellen stam DH5α in een steriele 1,5 mL Centrifugeer buis, Pipetteer het mengsel voorzichtig omhoog en omlaag 4 - 6 keer, en de buis op ijs gedurende 20 minuten uit te broeden.
2. Incubeer de buis bij 42 ° C gedurende 1 minuut in een waterbad, verwijderen van de buis van het waterbad, voeg 1 mL lysogenie Bouillon (LB) medium in de buis en Incubeer de buis bij 37 ° C in een broedmachine met schudden 1 h.
3. Verspreid 50 µL van het mengsel op een LB agar bord met ampicilline (0,1 mg/mL), en na een nacht bebroeden de LB agarplaat bij 37 ° C in een broedstoof.
4. Kies een één kolonie van de overnachting LB agarplaat met behulp van een steriele tip, en swirl van de tip in een in een buis van de bacteriële cultuur met 5 mL van LB medium en ampicilline (0,1 mg/mL). Incubeer de buis bij 37 ° C in een broedmachine met 's nachts te schudden.
5. Aliquot 3 mL van de overnachting bacteriecultuur in een maatkolf van 500 mL met 250 mL steriele LB medium en ampicilline (0,1 mg/mL). Incubeer de kolf bij 37 ° C met schudden. Controleer regelmatig de optische dichtheid (OD) van de bacteriecultuur bij golflengte van 600 nm met behulp van een spectrometer, totdat de OD600 0.6-1.0 bereikt.
   Opmerking: Meng goed 800 µL van de overnachting bacteriële cultuur met 200 µL glycerol bereiden de voorraad van glycerol en de glycerol voorraad tot-80 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.
6. Bereiden NR1-GFP expressie plasmide van de bacteriecultuur 250 mL
   1. De cellen verzamelen door centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
   2. Resuspendeer de pellet bacteriën in 10 mL resuspensie buffer met RNase A; Vortex grondig totdat geen klomp wordt gezien.
   3. Voeg toe 10 mL lysis-buffermengsel aan de bacteriële suspensie zachtjes omkeren van het mengsel 4 - 6 maal en Incubeer de lysate bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
   4. Voeg toe 10 mL pre gekoeld neerslag buffer aan de lysate, voorzichtig omkeren het mengsel 4 - 6 keer.
   5. Giet de lysate in de loop van een filterelement met het GLB op; wachten op 10 min op RT.
   6. Verwijder de dop van de cartridge outlet mondstuk, een zuiger invoegen de cartridge en druk zachtjes op de plunjer. Verzamelen de gefilterde lysate in een tube van 50 mL.
   7. 2,5 mL merkgebonden buffer van de fabrikant om de gefilterde lysate toevoegen, meng het mengsel door het omkeren van de buis ongeveer 10 keer en laat het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten inwerken.
   8. Breng het gefilterde lysate mengsel op een filter kolom die vooraf werd geëquilibreerd met 10 mL evenwichtsinstelling buffer. Laat de kolom voor de afvoer door de zwaartekracht.
   9. Was de kolom met 30 mL was buffer tweemaal en elueer DNA uit de kolom met 15 mL elutie buffer.
   10. 10,5 mL (0.7 volumes) isopropanol en toevoegen aan de eluted DNA-buffer, meng goed en Centrifugeer het mengsel bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
   11. Giet het supernatant zorgvuldig wassen van de DNA-pellet met 5 mL endotoxine-gratis 70% ethanol eenmaal en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten.
   12. De bovendrijvende vloeistof decanteren, droog de pellet gedurende 5-10 min. in een chemische kap, en los van de pellet in 300-500 µL van endotoxinen-vrije buffer.
   13. Bepaal de concentratie van de plasmide door het meten van de absorptie van de oplossing bij UV 260/280 nm met behulp van een spectrofotometer.
       Opmerking: Bereiden de expressie plasmide GFP hetzelfde protocol gebruiken.

2. de transfectie van HEK293 cellen met NR1-GFP expressie plasmide

1. Aliquoot 200 µL van 2% gelatine oplossing voor elk goed van een 48-well cultuur-plaat en de plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten uit te broeden.
2. De oplossing van de gelatine van de cellen in 200 µL van cel kweekmedium dat 10% foetale runderserum (FBS) in elk putje goed en zaad 5 x 10⁴ HEK293 gecombineerd. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde incubator geleverd met 5% CO₂ 's nachts.
   Opmerking: De cellen werden geteld met behulp van een hemocytometer.
3. Op de volgende dag, vervangen door het gebruikte kweekmedium 200 µL van verse kweekmedium dat 10% FBS per putje.
4. Voor elke single Nou, bereid oplossing A door het mengen van 100 ng van NR1-tGFP plasmide met 20 µL cultuurmedium en oplossing B door het mengen van 0.8 µL transfectiereagens met 20 µL cultuurmedium. Vermenigvuldig het aantal putten die nodig zijn ter voorbereiding van het totale volume van elk experiment.
5. Bereid oplossing C door het mengen van oplossing A en B-oplossing, en het mengsel op RT voor 20-30 min uit te broeden.
6. Aliquoot 40 µL van oplossing C aan elk putje met de cellen van de HEK293, zachtjes swirl van de plaat, en de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde incubator geleverd met 5% CO₂ 's nachts uit te broeden.
7. Controleer de expressie van NR1-GFP recombinante eiwitten in de cellen van de gastheer onder fluorescente microscoop met 40 X-200 X vergroting (excitatie/emissie: 482/502 nm), en gaat u verder met de bepaling van cel-gebaseerde immunofluorescentie.
   Opmerking: Transfect de expressie plasmide GFP in de cellen van de HEK293 met behulp van hetzelfde protocol.

3. cel-gebaseerde immunofluorescentie Assay

1. Het gebruikte medium de putjes gecombineerd, dan wassen elk putje met 200 µL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) drie keer.
2. Voeg 200 µL van 4% paraformaldehyde-oplossing aan elk putje; Incubeer de plaat duikt met RT gedurende 15 minuten.
3. Gecombineerd de paraformaldehyde-oplossing van de putten en wassen elk goed met 200 µL van PBS driemaal.
4. Voeg 200 µL van 10% magere melk in PBST (0,1% Tween-20 in PBS) oplossing voor elk goed, en de plaat duikt met RT voor 1 h met zacht schudden uit te broeden.
5. De 10% magere melk in PBST oplossing uit de put gecombineerd, dan was de putjes met 200 µL PBST eens.
6. Incubeer de putjes met verdunde plasma (1:100 in PBST) als het primaire antilichaam met zacht schudden bij RT gedurende 1 uur.
   Opmerking: Plasma wordt gehaald uit het bloed van patiënten verdacht te hebben van auto-immune encefalitis.
7. Gecombineerd het verdunde plasma uit de putten en wassen elk goed met 200 µL van PBST driemaal.
8. Voeg 200 µL van anti-menselijke geit IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 594 (1:1, 000 verdunning in PBST) aan elk putje en Incubeer de plaat van de cultuur op RT met zacht schudden voor 1 h.
9. De geit anti-menselijke IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 594 oplossing gecombineerd, en was goed met 200 µL van PBST driemaal.
10. Voeg 100 µL glycerol oplossing (50% glycerol in PBS en 1:100,000 van 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) aan elk putje.
11. Observeren en beeld van de cellen onder een fluorescente microscoop met behulp van een 10 X oculair, en 4 X, 10 X en 20 X doelstellingen.
    Opmerking: Gebruik het juiste filter voor elke kleurstof: voor NR1-GFP (excitatie/emissie = 482/502 nm), voor de Alexa Fluor 594 (excitatie/emissie = 561/594/nm), voor de DAPI (excitatie/emissie = 358/461 nm). Het gedrag van de negatieve controle de HEK cuvetten GFP op dezelfde manier uiten.

Resultaten

We kunnen gemiddeld 200-300 µg endotoxine-vrije expressie plasmide NR1-GFP en GFP krijgen van 250 mL bacteriecultuur na de procedures in sectie 1 van het protocol. Een bedrag van 100 ng/putje van de expressie plasmide werd gebruikt voor de transfectie van de HEK293 cellen gekweekt in de 48-well plaat zoals beschreven in de sectie 2 van het protocol. 24-30 uur na de transfectie, de cellen uitgesproken de NR1-GFP en GFP recombinante eiwitten onder fluorescente microscoop kon worden opgespoo...

Discussie

Er zijn verschillende cel-gebaseerde immunologische tests op het scherm van de aanwezigheid van Autoantilichamen tegen NMDA receptor gemeld in de literatuur, met inbegrip van de levende cel-gebaseerde immunofluorescentie assay¹¹, vaste cel-gebaseerde immunofluorescentie assay⁹ , en stroom cytometry gebaseerde assay¹⁴. De levende cel-gebaseerde immunofluorescentie bepaling moet kort na de voorbereiding van cellen die zijn ectopically uiting geven aan ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GRIN1 (GFP-gelabeld) - Humaan glutamate receptor, ionotropisch, N-methyl D-aspartaat 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	NR1-cDNA-kloon gelabeld met C-terminale tGFP-sequenties
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	zoogdiervector met C-terminale tGFP-tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden, Duitsland)	12362
Lipofectamine 2000 Transfectie Reagens	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, Hoge Glucose, Pyruvaat	Thermo Fisher	11995-065
Gekarakteriseerde foetaal bovien serum, US-origine	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Geit anti-Humaan IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 594-conjugaat	Thermo Fisher	A-11014
Positieve controle: anti-glutamaat receptor (type NMDA)	Euroimmun AG, Lübeck, Duitsland	CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit