Voorbijgaande expressie van buitenlandse genen in Insect cellen (sf9) voor eiwit functionele Assay

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een warmte schok-geïnduceerde proteïne expressie systeem (pDHsp/V5-zijne/sf9 cel), die kan worden gebruikt voor het uitdrukken van vreemde proteïnen of evaluatie van de anti-apoptotic activiteit van potentiële buitenlandse eiwitten en hun afgeknotte amino zuren in insect cellen.

Samenvatting

Het voorbijgaande gen expressie systeem is een van de belangrijkste technologieën voor het uitvoeren van de functionaalanalyse eiwit in de baculovirus in vitro celcultuur. Dit systeem werd ontwikkeld om de uitdrukkelijke buitenlandse genen onder de controle van de promotor van de baculoviral in voorbijgaande expressie plasmiden. Dit systeem kan bovendien worden toegepast op een functionele test van de baculovirus zelf of vreemde eiwitten. Het meest algemeen en commercieel beschikbare voorbijgaande gen expressie systeem is ontwikkeld op basis van de promotor van de onmiddellijke-vroege gen (IE) van Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Echter werd een lage expressie niveau van buitenlandse genen in insect cellen waargenomen. Dus werd een voorbijgaande gen expressie systeem gebouwd om eiwituitdrukking te verbeteren. In dit systeem, werden recombinante plasmiden gebouwd om bevatten de volgorde van de doelgroep onder de controle van de Drosophila warmte schok 70 (Dhsp70) promotor. Dit protocol stelt de toepassing van deze warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-Hsi (V5 epitoop met 6 histidine) /Spodoptera frugiperda cel (sf9 cel) systeem; Dit systeem is niet alleen beschikbaar voor de expressie van genen maar ook voor de evaluatie van de activiteiten van de anti-apoptotic van kandidaat-eiwitten in insect cellen. Bovendien, dit systeem ofwel kan zijn transfected met één recombinant plasmide of mede twee potentieel functioneel antagonistische recombinante plasmiden in insect cellen transfected. Het protocol toont de doeltreffendheid van dit systeem en biedt een praktisch voorbeeld van deze techniek.

Inleiding

Twee eiwit expressiesystemen zijn meestal gebruikt voor de productie van eiwitten: prokaryote eiwit expressie (Escherichia coli gen expressie systeem) en eukaryote eiwit expressiesystemen. Een populaire eukaryote eiwit expressie systeem is de baculovirus expressie vector systeem (BEVS)¹. Baculoviruses werden voor het eerst gebruikt als wereldwijd biologische bestrijders van landbouw en bosbouw van ongedierte. In de afgelopen decennia, werden baculoviruses ontwikkeld als biotechnologische instrumenten voor eiwit expressievectoren evenals. Het genoom van de baculoviruses bestaan uit circulaire dubbelstrengig DNA en omhuld nucleocapsids². Tot op heden meer dan achtenzeventig baculovirus geweest isolaten gesequenceerd³. Op basis van de temporele cascade van baculoviral gen expressies in insect cellen van de gastheer, kan de transcriptie van het gen worden ingedeeld in vier temporele cascades, met inbegrip van direct-vroege, vertraagd-vroege, late en erg laat genen⁴.

BEVSs werden aangewezen, zodat het zeer laat gene initiatiefnemers (d.w.z., veelvlak of p10 promotor) werden gebruikt om te rijden de doelgenen, terwijl de recombinante baculovirus werd gegenereerd door homologe recombinatie. Uitdrukking van vreemde proteïnen in insect cellen door recombinant baculovirus is vergelijkbaar met die van zoogdieren eiwitten in posttranslationele modificaties (geschikt voor de productie van glycoproteïne). Aldus, is de baculovirus gebruikte^5,6,7. Een beperking is echter de aanwezigheid van verschillende N-glycosylation routes in insect cellen⁷.

Daarom werd een nieuwe baculovirus expressie systeem, het voorbijgaande gen expressie systeem, ontwikkeld. Dit systeem geeft uiting aan buitenlandse genen onder de schijf van baculoviral onmiddellijk-vroege initiatiefnemers (dwz 1 promotor) in insect cellen. Met behulp van dit systeem, kan de doel-eiwit worden onmiddellijk uitgedrukt onder de controle van ie-1 promotor tijdens het wijzigen van de route van de N-glycosylation in insect cellen, wat resulteert in betere N-linked oligosacchariden⁷. Bovendien, baculoviral onmiddellijke-vroege genen worden getranscribeerd door de gastheercel RNA polymerase II en vereisen geen enige virale factor voor activering⁴. Daarom kunnen vreemde eiwitten worden uitgedrukt in insect cellen binnen een korte tijd. Tot op heden, de voorbijgaande is gen expressie systeem een van de belangrijkste technologieën voor het uitvoeren van functionele testen van eiwit in de baculovirus in vitro celcultuur. Het systeem kan worden toegepast om de functie van baculovirus of vreemde eiwitten te analyseren. Een van de verkrijgbare voorbijgaande gen expressiesystemen is gebaseerd op de onmiddellijke-vroege gen (IE) initiatiefnemers van Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 en OpIE1 initiatiefnemers).

Het lagere niveau van de expressie van buitenlandse genen in insect cellen was echter nog steeds een probleem toen het OpIE promotor gebaseerde voorbijgaande gen expressie systeem gebruikte^8,9,10. Dus, een ander voorbijgaande gen expressie systeem werd gebouwd op basis van de promotor van de Drosophila warmte schok eiwit 70 (hsp70) gen^8,9. De promotor van hsp70 werkt efficiënter dan baculoviral IE promotor wanneer geïnduceerd door warmte schok in insect cellen¹⁰. In dit systeem, werden de doelgenen uitgedrukt onder het station van Drosophila warmte schok 70 (Dhsp70) promotor. Buitenlandse genen kunnen gemakkelijk worden gekloond in het voorbijgaande gen expressie plasmide door PCR-gebaseerde klonen methoden. Bovendien is de controle van de timing voor de expressie van genen kan worden uitgevoerd door warmte schok inductie.

In dit verslag, we volgen de aanpak en uiten van drie verschillende opschoningen van het baculoviral gen (remmer van apoptosis 3, iap3 vanaf Lymantria xylina MNPV) met behulp van de warmte schok gebaseerde voorbijgaande eiwit expressie systemen en Verder gelden deze uitgedrukte proteïnen op anti-apoptotic activiteit analyse. Dit systeem kan ofwel express vreemde eiwitten snel of verder worden toegepast op de evaluatie van eiwit anti-apoptotic activiteit in sf9 cellen, terwijl ook het potentieel om te worden toegepast op andere eiwit activiteit testen te hebben.

Protocol

1. voorbereiding

1. Insect celkweek
   1. 50 mL cel kweekmedium voor te bereiden. Om dit te doen, voeg 500 µL van antibiotica (Amfotericine B = 0,25 µg/mL penicilline = 100 eenheid/mL streptomycine = 100 µg/mL) en 5 mL van de warmte-geïnactiveerd foetale runderserum in cel serumvrij cultuurmedium (zonder FBS of antibiotica).
      Opmerking: Verwarm de foetale runderserum bij 65 ° C gedurende 30 minuten in een waterbad vóór gebruik.
   2. Spodoptera frugiperda handhaven (Lepidoptera: Noctuidae, de uilen), sf9 insect cellen. Ontkoppel ca. 80% van de cellen van de kolf van de cultuur van de cel van 25 cm² door schudden de kolf en controleer onder de lichte microscopie. Vervolgens 50% van de celsuspensie overbrengen in een nieuwe cultuur maatkolf van 25 cm² cel en de cellen te voegen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur toestaan. Het medium te vervangen door 5 mL verse cel kweekmedium en groeien in een incubator bij 28 ° C. Passage cellen elke 2 tot 3 dagen afhankelijk van de celgroei.
2. Voorbereiding van plasmiden, cel transfectie
   1. Invoegen de target-DNA-fragmenten (bijvoorbeeld Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen en de constructies van de schrapping) pDHsp/V5-zijn door PCR-gebaseerde klonen methode¹¹. Controleer de groei van getransformeerde kolonies door kolonie PCR met behulp van PCR Master Mix (2 X) en de pDhsp-F2/Op-IE2R primer instellen. Bevestig de plasmide sequenties door commerciële sequencing-service.
      Opmerking: Tabel 1 bevat de inleidingen voor PCR en de bijbehorende constructies gebruikt.
   2. Cultuur één gesequenceerd bacteriële kolonies, waarin de bovengenoemde plasmide constructies (stap 1.2) in 200 mL LB middellange bevattende geselecteerd antibiotica (50 µg/mL), respectievelijk.
   3. Pak de plasmiden uit de gekweekte E. coli met behulp van Midi plasmide Kit volgens fabrikant instructies¹².
3. Bereid plating medium door het mengen van 1,5 mL cel kweekmedium en 8,5 mL cel serumvrij cultuurmedium.
4. Actinomycin D (ActD) cel kweekmedium bereiden door 1,5 µL van ActD voorraad (1 mg/mL) toe te voegen in 10 mL cel kweekmedium (eindconcentratie = 150 ng/mL). Bewaren bij 4 ° C.

2. eiwituitdrukking voorbijgaande

1. Cel zaaien
   1. Oogst van de sf9 cellen door schudden de kolf van de cultuur, omver vallen de celsuspensie aan tube 50 mL en hemocytometer 10 µL overbrengen door een pipet P10. Het nummer van de cel onder een lichte Microscoop te tellen.
   2. Plaat 3 × 10⁵ sf9 cellen in elk putje in een 24-well plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Vervang het medium met 0,5 mL medium plating.
2. De transfectie van plasmiden
   1. Verdunde cel transfectiereagens: Verdun 8 µL van cel transfectiereagens in 100 µL cel serumvrij cultuurmedium en meng door de vortexing voor 1 s.
   2. 2 µg plasmide DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-Hsi) in 100 µL van cel serumvrij cultuurmedium en mix toevoegen door de vortexing voor 1 s (Figuur 2).
   3. Combineer de verdunde plasmide DNA en verdunde cel transfectiereagens (210 µL), en meng door de vortexing voor 1 s. Incubate gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Voeg 210 µL van DNA transfectie reagens mengsel ontkleuring op de cellen door een pipet P1000. Incubeer bij 28 ° C gedurende 5 uur.
   5. Vervang het medium beplating met 0,5 mL van cel kweekmedium met behulp van een precisiepipet P1000. Zegel van de 24-well plaat met tape en Incubeer de cellen bij 28 ° C gedurende 16 h.
3. Warmte schok transfected cellen: zet de plaat in een waterbad van 42 ° C (drijvend op het watervlak). Verwarm gedurende 30 minuten en de 24-well plaat terug te keren naar de 28 ° C incubator.
4. Detectie van eiwit expressie
   1. Spoel de cellen met 0,5 mL 1 x PBS buffer kort driemaal na 1 h of 5 h warmte schok.
      Opmerking: Verdun 10 x PBS buffer op 1 x PBS buffer door toevoeging van 1 mL 10 x PBS buffer 9 mL gesteriliseerd ddH₂O
   2. Lyse de cellen met 40 µL 1 x SDS laden kleurstof door pipetteren omhoog en omlaag.
      Opmerking: Verdun 4 x SDS laden kleurstof door het mengen van 30 µL 1 x PBS buffer en 10 µL van 4 x SDS monster Buffer.
   3. Verwarm de eiwitsteekproeven bij 98 ° C gedurende 10 minuten in een warmte blok spin down voor 1 min en ijs voor westelijke vlek assay zetten.
   4. Western blot test
      Volg de procedure voor westelijke vlek assay van Eslami en Lujan¹³. SDS-pagina¹⁴gels worden uitgevoerd: één gel onderworpen aan Coomassie blue kleuring (controle op laden om te controleren dat de hoeveelheid EiwitSteekproeven geladen in elk goed gelijke bedragen is) en de andere onderworpen aan de Western blot assay, volgens Eslami en Lujan¹³ .
   5. Detecteren van fusion V5-gelabelde proteïnen met konijn anti-V5 antilichaam (5 mg/mL) (1:5000 verdunning in de buffer TBST te werken concentratie 1 µg/mL) en geit anti-konijn IgG-horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerde (0,8 mg/mL) (1:10000 verdunning in de buffer TBST te werken concentratie 0.08 µg/mL).
      Opmerking: Aanpassen van het percentage van polyacrylamide tot 17,5% wanneer het molecuulgewicht van de eiwitten als < 17 kDa.

3. anti-apoptotic activiteit assay

1. Cel gen-veroorzaakte apoptosis: Herhaal de bovengenoemde procedure van 2.1 tot 2.3. Co transfect 1 microgram van pDHsp/D-rpr/vlag-Hsi plasmide DNA (met apoptosis inductor gene) met 1 µg plasmide DNA [pDHsp70/V5-Hsi vector (negatieve controle), pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn (positieve controle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-Hsi of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-zijn, respectievelijk.]. Voeren op 5 h post-warmtebehandeling schok, de cel levensvatbaarheid assay (Figuur 2).
2. Chemische-geïnduceerde cel apoptosis: Herhaal de bovengenoemde procedure van 2.1 tot 2.3. Plaat in stap 2.1.2, 1 x 10⁶ sf9 cellen in elk putje in een 6-well-plate. Transfect 4 µg plasmide DNA [pDHsp70/V5-Hsi vector (negatieve controle), pDHsp70-Ac-P35/V5-zijn (positieve controle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-zijn, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-zijn of pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-zijn, respectievelijk.]. 5 h na warmte schok, sf9 cellen met 2 mL gestolde voedingsbodem van de cel van de ActD voor 16 h behandelen en uitvoeren van de cel levensvatbaarheid assay (Figuur 2).
   Opmerking: Minimumhoeveelheid ter dekking van een put van 6-well plaat is 1 mL.
3. Het uitvoeren van de bovenstaande anti-apoptotic activiteit assay experimenten, met inbegrip van 3.1 en 3.2 in triplicates.

4. cel levensvatbaarheid assay

1. Het wassen van de behandelde cellen door toevoeging van 1 mL 1 x PBS buffer voor 1 min 3 keer. Resuspendeer de cellen door 1 mL 1 x PBS buffer met 0,04% trypan blauwe pipetteren en vlek gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Breng de celsuspensie in een 1,5 mL microtube.
   Opmerking: Verdun 0,4% trypan blauwe oplossing door het mengen van 9 mL 1 x PBS buffer en 1 mL 0,4% trypan blauwe oplossing.
2. 10 µL trypan blauw gebeitste celsuspensie overbrengen in de hemocytometer met een pipet P10 en levensvatbare intact cellen onder een lichte Microscoop tellen.
3. Statistische analyse
   1. De opgenomen gegevens berekenen en presenteren als de middelen ± S.D. voor alle tellingen.
   2. Het analyseren van de gegevens van de Student tweezijdige t-test door met Microsoft Excel. Statistisch significante gegevens definiëren als P-waarde < 0.05.

Resultaten

De volledige lengte en andere twee opschoningen (BIR en RING domeinen) van Ly-IAP3 van LyxyMNPV werden overexpressie in sf9 cellen, op basis van de warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-Hsi /Spodoptera frugiperda cel (sf9 cel) systeem. De pDHsp/V5-Hsi bevatte een Drosophila warmte schok eiwit promotor, die downstream genexpressie bij een temperatuur van 42 ° C aandoening rijdt met behulp van cellulaire transcriptionele factoren en de vertaling systeem (Fi...

Discussie

Het concept van warmte schok gebaseerde pDHsp/V5-zijne/sf9 cel systeem werd voor het eerst beschreven door Clem et al. in 1994⁸. Vergelijking van de baculoviral gen promotor (IE1) en Drosophila hsp70 toonde aan dat hsp70 had een hogere efficiëntie in mug cellen¹⁰. Bovendien, als gevolg van de hitte schok inductie, de timing van eiwit expressie kan worden gecontroleerd juist na de schok van de warmtebehandeling. Dit systeem werd vervolgens...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062	voor insectencelcultuur
Certified Foetal Bovine Serum	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	serum-vrij celcultuurmedium
Sf9 cellen	ATCC	CRL-1711
25cm2 celcultuurkolf	Nunc, Thermo Fisher	156340
Omgekeerd lichtmicroscoop	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)	Bioman	LBL407
Agar, bacteriologisch graad	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	selectieantibioticum
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (endotoxine vrij)	Geneaid	PIE25
Actinomycine D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL centrifugebuizen	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL buizen
Hemocytometer	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II Reagens	Thermo Fisher	10362100	celtransfectie reagens
PBS-fosfaat-bufferoplossing (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS-ladingenbeits	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF-blotmembranen)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF-membranen
Mini Trans-Blot Cell-systeem	BIO-RED	1703930	blotapparaat
Ponceau S-oplossing	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	konijnenanti-V5-antilichaam
Geitenanti-konijn IgG-paardenradish-peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0,4 % trypanblauw oplossing	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson	F123602
Tape	Symbio	PPS7	24 well tape ( 19 mm×36 M)