Chromatine verspreid preparaten voor de analyse van muis oöcyt progressie van profase naar metafase II

Samenvatting

Oögenese bij zoogdieren is bekend dat zij vergissing-geneigd, met name als gevolg van chromosoom missegregation. Dit manuscript chromatine verspreid voorbereiding worden methoden beschreven voor muis profase, metafase I en II-geënsceneerde eicellen. Deze fundamentele technieken toestaan voor de studie van chromatine-gebonden eiwitten en chromosoom morfologie in zoogdieren oögenese.

Samenvatting

Chromatine verspreiding technieken hebben wijd gebruikt om te beoordelen van de dynamische lokalisatie van verschillende eiwitten tijdens geslachtscel, met name voor de spermatogenese. Deze technieken kunnen voor visualisatie van eiwitten en DNA lokalisatie patronen tijdens Meiotische evenementen zoals homologe chromosomen in paren rangschikken, synapsis en DNA-reparatie. Terwijl een aantal protocollen zijn beschreven in de literatuur, zijn algemene chromatine verspreiding technieken met behulp van zoogdieren profase eicellen beperkt en moeilijk te wijten aan de timing van meiose Inleiding in de foetale eierstokken. In vergelijking, kunnen de profase spermatocyten worden verzameld van jonge mannelijke muizen met een hogere opbrengst zonder de behoefte aan microdissection. Het is echter moeilijk te verkrijgen van een zuivere gesynchroniseerde bevolking van cellen in specifieke stadia als gevolg van de heterogeniteit van Meiotische en post Meiotische geslachtscellen populaties in de jeugd- en volwassen testis. Voor de latere fases van de meiose is het voordelig om te beoordelen van oöcyten ondergaan meiose I (MI) of meiose II (MII), omdat groepen van rijpe eicellen kunnen worden verzameld van volwassen vrouwelijke muizen en gestimuleerd om te hervatten meiose in cultuur. Hier, methoden voor Meiotische chromatine verspreid preparaten met behulp van oöcyten ontleed van foetale, Neonatale en volwassen eierstokken worden beschreven met begeleidende video demonstraties. Chromosoom missegregation gebeurtenissen in zoogdieren eicellen zijn frequent, met name tijdens MI. Deze technieken kunnen worden gebruikt om te beoordelen en karakteriseren van de effecten van verschillende mutaties of milieu posities tijdens de verschillende fasen van de oögenese. Aangezien er duidelijke verschillen zijn tussen de oögenese en spermatogenese, zijn de technieken beschreven binnen onschatbare waarde voor het vergroten van ons begrip van zoogdieren ooegenese en de seksueel dimorphic kenmerken van chromosoom en eiwit dynamiek tijdens de meiose .

Inleiding

Tijdens de spermatogenese, zijn grote halfsynchrone golven van Meiotische kiemcellen snel en voortdurend bijgevuld in de testis bij het begin van de puberteit en volwassenheid¹. In tegenstelling tot mannen, wordt meiose bij vrouwtjes geïnitieerd uitsluitend tijdens de foetale ontwikkeling. Na geboorte, eicellen blijven gearresteerd in een fase van de langdurige dictyate van de profase I met een intact germinal Vesikel (GV; nucleaire envelop) tot de puberteit. Bij het begin van de puberteit, een subset van eicellen worden cyclisch geselecteerd om het ondergaan van de groei en rijping, markering van de inleiding van Meiotische hervatting. Meiotische hervatting in volgroeide eicellen manifesteert zich door het verdwijnen van de GV in een proces dat bekend staat als germinal vesikel verdeling (GVBD). De oöcyt ondergaat vervolgens chromosoom condensatie en segregatie, gevolgd door polar lichaam extrusie. Eicellen op de progressie naar MII worden gearresteerd en worden gestimuleerd om te voltooien van de tweede en laatste Meiotische divisie alleen na de bevruchting.

Vrouwelijke vruchtbaarheid is sterk afhankelijk van het succes van Meiotische profase ik progressie. Sleutel tot dit is vorming van een fysieke koppeling tussen homologe chromosomen, bekend als de chiasmata, die wordt gemedieerd door reparatie van geïnduceerde DNA dubbele strand einden (DSBs) via crossover recombinatie². Dit proces vindt plaats binnen de context van een dynamische eiwitrijke steiger bekend als het synaptonemal-complex (SC) die tussen homologe chromosomen vormt om hun synapsis³. De SC is een rits-achtige tripartiete structuur die bestaat uit twee parallelle laterale elementen met elkaar verbonden door regio Midden eiwitten die in het bezit van homologen samen gedurende de lopende DNA-herstel. Voorafgaand aan de synapsis vormen voorlopers van de laterale elementen, axiale elementen, genoemd tussen zuster chromatiden. Synaptonemal complex eiwitten zoals SYCP2 en SYCP3 vormen axiale elementen die colocalize aan de zuster-chromatide cohesie assen tijdens de vroege profase. Deze later dienen als bindend sites voor de dwarse gloeidraad eiwit, SYCP1, die centraal element vergadering en synapsis tussen de uitgelijnde homologen⁴vergemakkelijkt. In muis eicellen, wordt volledige synapsis aangegeven door de aanwezigheid van 20 volledig preparaten overlappende SYCP3 en SYCP1 stukken, die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van chromatine verspreid. Synapsis is voltooid bij binnenkomst in de pachytene substage, waarbij de volwassen crossovers die bestemd zijn om te formulier chiasmata tussen homologen zijn versierd met mutL homolog (MLH1/3) Dimeren ter bevordering van hun nauwkeurige verwerking^{5,6 , 7}. de structurele handhaving van de chromosomen (SMC) complexen, met inbegrip van cohesin, condensin en de SMC5/6 complex, zijn belangrijk voor de regulering van chromosoom dynamiek en structuur in de gehele meiose^{8,9, 10,11,12}. Collectief, zorgen deze gebeurtenissen voor goede bi-richting van homologe chromosomen naar tegengestelde Polen van de spindel na demontage van de SC.

De Meiotische celcyclus is een krachtig model te onderzoeken van de rol van verschillende eiwitten in het genoom onderhoud als gevolg van de geprogrammeerde inductie en latere reparatie van DNA-DSBs. Zoogdieren meiose is bovendien ook een relevante model voor de studie van de epigenetische aanpassingen en inprenting¹³. Het is echter technisch moeilijk in te schatten van deze gebeurtenissen tijdens vrouwelijke meiose, die in de foetale en neonatale eierstokken bij zoogdieren (Figuur 1 plaatsvindt). Profase ik kan worden onderverdeeld in 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema en dictyate. Hierin beschrijven we hoe u kunt isoleren en onderscheid maken tussen foetale en neonatale eierstokken en teelballen (Figuur 2). Aangepast van de eerder beschreven methoden, dit manuscript wordt ook uitgelegd welke een protocol (stap 1) met video demonstratie voor bereiding van vrouwelijke Meiotische profase ik chromatine verspreidt^14,15,16,17 . Wanneer in combinatie met immunolabelling, zoals beschreven in stap 6-7, dit protocol maakt een gedetailleerde microscopische analyse van profase ik gebeurtenissen in eicellen.

Oögenese is foutgevoelig en chromosoom missegregation gebeurtenissen tijdens de eerste Meiotische verdeling vertegenwoordigen de meest voorkomende bron van genetische ziekte in nakomelingen^18,19. In dit manuscript (protocol stap 2) beschrijven we een protocol waarin volwassen GV-geënsceneerde eicellen worden gewonnen uit primer eierstokken van volwassen vrouwelijke muizen. Ondersteunende voorwaarden ondergaan volgroeide eicellen luteïniserend hormoon-onafhankelijke hervatting van meiose na isolatie en cultuur²⁰. Na de hervatting van het Meiotische, eicellen vooruitgang door middel van meiose I, dan arresteren op metafase II. Eicellen blijven gearresteerd op metafase II, tenzij bevrucht. In stap 2 – 5, passen we eerder gemeld protocollen met video demonstratie om te beschrijven hoe te verzamelen, cultuur en MI en MII eicellen voorbereiden chromatine verspreid preparaten²¹. Deze techniek verspreidt chromatine zorgt voor duidelijke immunolabelling van eiwitten die zijn gekoppeld aan de chromosomen. Bovendien, dit protocol kan ook worden gebruikt om te onderscheiden tussen bivalente en univalent chromosomen en één zus verder kan oplossen chromatiden ter vergemakkelijking van de beoordeling van de oöcyt ploïdie. Daarom, naast onthullend lokalisatie patronen van Meiotische eiwitten, dit protocol kan ook dienen als een instrument van onschatbare waarde voor het ophelderen van de mogelijke oorzaken van chromosoom missegregation tijdens MI en MII.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Johns Hopkins University. Experimenten werden uitgevoerd op wild-type C57BL/6J muizen.

1. het oogsten van foetale of neonatale eierstokken en voorbereiding van de profase chromatine verspreidt

1. Om uit te pakken van de embryo's op 14,5 – 19.5 dagen opofferen post-coitum (dpc) de zwangere vrouwtjes via cervicale dislocatie of CO₂ verstikking volgens IACUC richtlijnen.
   Opmerking: voor postnatale dag die 1 – 5 eierstokken gaat u naar stap 1.3. Figuur 1 geeft een overzicht van de fasen van de Meiotische profase verrijkt op verschillende leeftijden van de embryonale en postnatale.
2. Open de holte van de abdominopelvic met behulp van steriele schaar, een V-vormige opening maken. Ontleden uit de maternale uteriene hoorn, scheiden van de embryo's van de placenta en embryo's Pipetteer in 35 mm petrischalen met 3 mL voorverwarmde 1 x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C.
   Opmerking: Een fliptop incubator ingesteld bij 37 ° C kan worden gebruikt om temperatuur te houden. Daarnaast kan een temperatuur geregeld glas stadium ook worden gebruikt om temperatuur te houden tijdens de manipulatie van de eierstok.
3. Offeren met een 3,5 inch chirurgische schaar, embryo's of pups via onthoofding volgens IACUC richtlijnen. Onthoofde embryo's of pups in voorverwarmde PBS vóór verdere dissectie plaatsen.
4. Ontleden van een embryo of pup op een moment in een aparte 35 mm petrischaal met 3 mL voorverwarmde PBS bij 37 ° C. Ga verder door te snijden langs de ventral midline van de achterste helft van het embryo, langs de voorste helft onder de voorpoten en direct boven de hind-ledematen en staart zoals aangegeven in figuur 2A-B.
5. Open de buik met behulp van 3,5-inch chirurgische scharen. Met behulp van fine-tipped pincet verplaatsen of verwijderen van de lever en de lusjes van de darm, bloot de eierstokken in een petrischaal voor nieuwe 35 mm, met 3 mL voorverwarmde PBS bij 37 ° C (zie gids in figuur 2B). De eierstokken liggen direct onder en achter de nier naar de achterste muur van de peritoneale Holte (figuur 2B-C). Een gids voor het onderscheid tussen mannelijke en vrouwelijke geslachtsklieren wordt gegeven in figuur 2D.
   Opmerking: Voor optimale omstandigheden, snel ontleden uit de eierstokken na zwangere vrouw wordt opgeofferd.
6. Verwijderen van beide eierstokken van elke vrouwelijke foetus met behulp van een paar van boete-tipped verlostang onder een dissectie toepassingsgebied en de plaats in een horloge glazen of aparte putten voor een multi goed plaat met 0,5 tot 1,0 mL voorverwarmde PBS en onderhouden bij 37 ° C.
7. Elk paar van eierstokken plaats in 0,5 mL hypo-extractie buffer (17 mM Trinatriumcitraat citraat dihydraat, sacharose bevat 50 mM, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, proteaseinhibitor, pH 8.2) in een schone horlogeglas of een klein putje van een 9-well plaat, ervoor zorgend om het onderdompelen van de eierstokken comp letely. Incubeer gedurende ten minste 15 minuten, maar niet meer dan 30 min.
   Opmerking: Maak hypo-extractie buffer verse en gebruik binnen 2 uur van DTT toevoeging.
8. Tijdens de incubatie, met behulp van een hydrofobe barrière PAP pen, tekent u twee 22 x 22 mm² vierkanten op een schone glas 25 x 75 mm², 1 mm dik microscoopglaasje zoals weergegeven in figuur 3A.
   Opmerking: Dia's kunnen tevoren bereid worden.
9. Pipetteer 45 – 50 µL van 100 mM sucrose op een schone dia en één paar eierstokken overbrengen in de druppel.
10. Met behulp van de scherpe uiteinden van twee 27 G naalden, plagen de eierstokken uit elkaar om cellen in de sacharoseoplossing vrij te geven. Met een tang, verwijderen van grote stukken eierstok en zorgvuldig Pipetteer sacharoseoplossing cellen verspreiden.
11. Plaats 40 µL van kleefpoeders oplossing (1% paraformaldehyde (PFA), 0,2% wasmiddel (Zie Tabel of Materials), pH 9.2) in elk vierkant van de voorbereide dia. Met een 200 µl pipette uiteinde, de kleefpoeders oplossing gelijkmatig verspreid over de dia oppervlak.
12. Pipetteer 20 µL van de mix van sucrose op het elk plein van de dia met de fixeerspray.
    Opmerking: Dit komt neer op het met behulp van een paar van eierstokken per dia.
13. Laat de dia's in een gesloten vochtige kamer 's nachts bij kamertemperatuur inwerken.
    Opmerking: De incubatie van overnachting kan variëren rond (12-15 uur) bij kamertemperatuur.
14. Open het deksel van de kamer en laat de dia's volledig drogen.
15. Wassen van de dia's in een pot van de Coplin met 50 mL 0,4% bevochtigingsmiddel-PBS oplossing (Zie Tabel of Materials) voor 2 min, droge lucht, en overgaan tot immunolabelling-protocol (stap 6).
    Opmerking: Het mogelijk is om op te slaan van de dia's bij-80 ° C voor later gebruik, maar dit varieert afhankelijk van de proteïne van belang. Voor optimale resultaten onmiddellijk overgaan tot het immunolabelling-protocol (stap 6).

2. de metafase ik oöcyt collectie

1. Het maximaliseren van het aantal follikelgroei follikels geïsoleerd van elke muis, intraperitoneally injecteren geslachtsrijpe Maagd vrouwelijke muizen met 5 IU van zwangere merrie serum gonadotrofinen (PMSG, ook bekend als paarden choriongonadotrofine (eCG)).
   Opmerking: Voor optimale oöcyt opbrengst, muizen moeten 1 tot en met 3 maanden van leeftijd, zoals het aantal eicellen geoogst met de leeftijd dalen zal. Ter voorbereiding van PMSG, ontbinden fles van 5000 IU in 100 mL steriele PBS (5 U/0.1 mL) winkel in eenmalig gebruik aliquots van 600 µL bij-20 ° C.
2. Na 44-48 h, bereiden collectie medium, minimale essentiële middellange alpha (MEMα) medium aangevuld met 5% foetale runderserum (FBS) en 3 mg/mL bovien serumalbumine (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Steriliseren media door een filter van de porie 0,2 µm. Decanteren 2,5 mL van MEMα/BSA/FBS middellange in één glas schotel per muis en warme tot 37 ° C in een 5% CO₂ incubator.
   Opmerking: Andere collectie en voedingsbodems die commercieel beschikbaar zijn (M2 en M16) worden ook vaak gebruikt.
   Let op: Wij raden cultuur gerechten uit de 5% CO₂ incubator een tegelijk voor beperkte duur om te minimaliseren van omgevingslucht blootstelling tijdens manipulatie stappen verwijderen.
3. Offeren de muizen via cervicale dislocatie of CO₂ verstikking volgens IACUC richtlijnen.
4. Open de holte van de abdominopelvic met behulp van steriele schaar, maken een grote V-vormige opening. Met behulp van Tang, verdringen darmen naar het hoofd van de muis. Zoek elke baarmoeder hoorn; de eierstokken zijn presenteren proximale aan de ribbenkast. Houd het oviduct met fijne pincet en snijd de dikke superior tot de eierstok met behulp van de dissectie schaar (Figuur 4). Blijven de oviduct houd, en met een andere set van fijn verlostang release het vruchtbeginsel van de slijmbeurs en de plaats in collectie schotel met MEMα/BSA/FBS medium.
   Opmerking: Net als in stap 1 is het noodzakelijk om te houden van de eierstokken bij 37 ° C en zorg ervoor dat u 5% CO₂. Een fliptop incubator vastgehaakt aan 5% CO₂ mix kan worden gebruikt om te zorgen voor optimaal onderhoud van temperatuur en CO₂ niveaus. Daarnaast moet een temperatuur geregeld glas stadium ook worden gebruikt om temperatuur te houden tijdens de oöcyt manipulatie.
5. Cumulus oöcyt complexen met behulp van een injectiespuit 1 mL met een 27-gauge naald (of vergelijkbare grootte), vrijgeven door de grote follikelgroei follikels handmatig te prikken.
6. Met inachtneming van door een Microscoop dissectie, verzamelen GV-geënsceneerde eicellen met capillaire, een mond bediende glazen pipet of met een handbediende micrometer-spuit (Figuur 5). Alleen ophalen eicellen die zijn uitgebracht follikelgroei follikels. GV eicellen hebben een diameter van ongeveer 90 GV eicellen µm. kan worden omringd door 2-3 lagen van granulosa cellen, en hebben een totale diameter van ongeveer 200 µm.
7. Cultuur van de eicellen in een schone horlogeglas of een 9-well plaat met MEMα/BSA/FBS medium voor 6 h te bereiken metafase ik bij 37 ° C in een 5% CO₂ incubator.
8. Ga verder met stap 4.

3. de metafase-II (MII) oöcyt collectie

1. Maximaliseren van oöcyten geïsoleerd van elke muis, intraperitoneally injecteren geslachtsrijpe Maagd vrouwelijke muizen met 5 IU van PMSG. Na 44-48 h, intraperitoneally injecteren met 5 IU van humaan choriongonadotrofine (hCG).
   Opmerking: Voor optimale oöcyt opbrengst, muizen moeten 1 tot en met 3 maanden van leeftijd, zoals het aantal eicellen geoogst met de leeftijd dalen zal. Ter voorbereiding van hCG, het ontbinden van een fles van 10.000 U in 200 mL PBS (5 mL van de U/0.1). Opslaan in eenmalig gebruik aliquots van 600 µL bij-20 ° C.
2. Na 12-14 uur, door MEMα/BSA/FBS collectie medium, te bereiden zoals beschreven in stap 2.2, hierboven.
3. Offeren de muizen via cervicale dislocatie of CO₂ verstikking volgens IACUC richtlijnen.
4. Open de holte van de abdominopelvic met behulp van steriele schaar, maken een grote V-vormige opening. Met behulp van Tang, verdringen darmen naar het hoofd van de muis. Zoek elke baarmoeder hoorn, de eierstokken zijn presenteren proximale aan de ribbenkast. Houd het oviduct met fijne pincet en snijd de dikke superior tot de eierstok met behulp van de dissectie schaar (Figuur 4). Daarna verwijderen van de eierstok en oviduct en plaats in de collectie schotel met MEMα/BSA/FBS medium.
   Opmerking: Net als in stap 1 en 2 is het noodzakelijk om te houden van de eierstokken bij 37 ° C en zorg ervoor dat u 5% CO₂. Een fliptop incubator vastgehaakt aan 5% CO₂ mix kan worden gebruikt om te zorgen voor optimaal onderhoud van temperatuur en CO₂ niveaus. Daarnaast moet een temperatuur geregeld glas stadium ook worden gebruikt om temperatuur te houden tijdens de oöcyt manipulatie.
5. Met behulp van een spuit van 1 mL met een 27 G (of een vergelijkbare grootte) of scherpe pincet, een gat in de Papil van het oviduct vrij de MII eicellen te scheuren.
   Opmerking: Wees voorzichtig niet te beschadigen de eicellen in de ampul. De ampul verschijnt gezwollen en doorschijnende zodanig dat de eicellen zichtbaar (Figuur 4 zijn).
6. Oogst MII eicellen van de Papil van het oviduct in een nieuwe schotel met collectie medium met een mond bediende glazen pipet of capillaire, met een hand bediende micrometer-spuit (Figuur 5).
7. Ga verder met stap 4.

4. oöcyt leegvissen en Zona zitten verwijdering

1. Bereiden 300 IU/mL hyaluronidase in MEMα medium aangevuld met 3 mg/mL, BSA denude eicellen van omringende cumulus cellen (2,5 mL/muis) in een horlogeglas, en blijven bij 37 ° C, 5% CO₂.
   Opmerking: Hyaluronidase werkzaamheid sterk vermindert na 1 h van voorbereiding. Voor MII eicellen is hyaluronidase behandeling niet vereist.
2. Bloot oöcyt-cumulus cel complexen tot 300 IU/mL van hyaluronidase in MEMα/BSA gedurende 3 minuten aan denude eicellen van de omringende cellen van cumulus.
   Let op: Overschrijd niet 3 min blootstelling aan hyaluronidase, zoals het beschadigt de eicellen.
3. Wassen van de eicellen, eicellen overbrengen in een vers opgewarmd MEMα/BSA middellange schotel. Met behulp van een kleine mond bediende glazen pipet of capillaire (iets groter dan de diameter van de oöcyt, die ongeveer 90 µm), de complexen Pipetteer omhoog en omlaag als u wilt volledig loskoppelen van de cumulus cellen. Toestaan dat de eicellen te herstellen in de incubator terwijl de voorbereiding van de volgende stap.
4. Warme zure Tyrode oplossing, MEMα/BSA en Waymouth de media tot 37 ° C (500 µL/muis). Plaats 300 µL in elk putje van kleine 9-well glasplaten.
5. Pipetteer 5-10 eicellen in Tyrode de oplossing als u wilt verwijderen van de zona zitten (ZP). Bloot de eicellen voor slechts 30-45 s aan de oplossing.
   Opmerking: Te weinig blootstelling aan de oplossing zal niet de ZP volledig verwijderen, die zal voorkomen dat de eicellen barsten en chromosomen zich verder verspreidt. Teveel blootstelling zal beschadigen en doden van de oöcyt. Kijken naar het ZP Los onder de Microscoop dissectie kan helpen in het optimaliseren van de blootstellingstijd.
   Let op: Het gebruik van verse Tyrode de oplossing is kritisch, naarmate de functie met de leeftijd afneemt. Gebruik een verse putje van Tyrode de oplossing voor elke groep van eicellen behandeld om uniforme vertering van de ZP.
6. Wassen onmiddellijk na verwijdering van de ZP, de eicellen door de overdracht in verwarmde MEMα/BSA/FBS medium. Herhaal deze stap wassen.
   Opmerking: Wees voorzichtig bij het overbrengen, zoals eicellen gemakkelijk aan elkaar plakken zal en aan de glazen pipet of capillaire volgende verwijdering van het ZP. Vooraf bevochtigen de glazen pipet of viscometerbuizen in hun Waymouth van medium zal het minimaliseren van oöcyten steken samen.
7. Overdracht en laat de eicellen te herstellen gedurende 30 minuten in de Waymouth medium bij 37 ° C in een 5% CO₂ incubator.
8. Ga verder met stap 5.

5. MI en MII oöcyt chromatine Spreads

1. Met behulp van een pen van de PAP, een rechthoek 11 x 44 mm² op het glasplaatje zoals weergegeven in figuur 6A.
2. Jas van de dia met een dunne laag fixeer (1% paraformaldehyde, 0,2% Triton-X 100 H₂O, pH 9.2) door pipetteren 100 µL van fixeerspray op de dia en de dia heen en weer schommelen. Tik op de dia om zich te ontdoen van overtollige fixeerspray.
3. Tussen 5-10 eicellen met een kleine mond Pipetteer naald met als weinig media mogelijk halen en sleep de naald in een lijn over de dia fixeerspray beklede tijdens het storten van de eicellen vanaf 1 cm boven de dia in de kleefpoeders oplossing. Voer deze stap met behulp van een Microscoop dissectie om ervoor te zorgen dat de eicellen zijn nedergelegd en dat hebben ze barsten.
   Opmerking: De eicellen moeten onmiddellijk barstte op de dia. De hoogte waarop de eicellen zijn gedeponeerd effect de mate van de chromatine verspreiden. Zie representatieve resultaten in Figuur 6 voor meer informatie.
4. Incubeer dia's bij kamertemperatuur in een gesloten bevochtigde kamer 's nachts om de chromatine te houden.
5. Laat de dia's volledig drogen en spoel van dia's in een pot van de Coplin met 50 mL 0,4% bevochtigingsmiddel-H₂O, pH 8,0.
6. Ga verder met stap 6.

6. Immunolabelling

1. Bereiden de antilichaam verdunning buffer (ADB) beschreven in tabel 1.
2. Bereiden van twee Coplin potten met 50 mL wassen (WB) bufferoplossing (10% ADB verdund in PBS), en één Coplin jar met 50 mL WB en 0,05% schoonmaakmiddel (b.v.250 µL van 10% wasmiddel toevoegen aan 50 mL WB).
3. Wassen van de dia's die werden opgesteld in sectie 1 en 5 van dit protocol gedurende 10 minuten in een Coplin pot met 50 mL WB.
   Let op: Laat niet de dia's drogen op elk gewenst moment tijdens de immunolabelling.
4. Wassen van de dia's gedurende 10 minuten in de Coplin jar met 50 mL WB en 0,05% schoonmaakmiddel. Vervolgens wassen de dia's in de resterende Coplin jar met 50 mL WB oplossing voor 10 min.
5. Tik uit overtollige vloeistof en dekking dia met 100 µL van geselecteerde primaire antilichamen verdund in ADB. Incubeer bij 4 ° C's nachts in een gesloten vochtige kamer.
   Opmerking: Incubatie kan worden verkort tot 2 tot 3 uur bij 37 ° C. Gebruik kleinere volumes van antilichaam (b.v., 50 µL) door die betrekking hebben op de dia met een dekglaasje aan of parafilm.
6. Spoel de dia's in een pot van de Coplin met 50 mL 0,2% bevochtigingsmiddel-PBS oplossing, pH 8,0.
7. Herhaal stap 6.2 tot 6.5.
8. Tik uit overtollige vloeistof en dekking dia met 100 µL van geselecteerde secundaire antilichamen verdund in ADB. Incubeer de dia's 1 tot en met 2 uur bij 37 ° C in een gesloten vochtige kamer.
9. Dia's 2 keer gedurende 10 minuten in Coplin potten met 50 mL 0,2% bevochtigingsmiddel-PBS oplossing, pH 8,0 wassen.
10. Dia's 2 keer gedurende 5 min. in potten van de Coplin met 50 mL 0,2% bevochtigingsmiddel-H₂O-oplossing, pH 8,0 wassen.

7. montage dia 's

1. Voor profase chromatine spreads bereid in stap 2, voeg 100 µL van montage medium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Voor MI en MII chromatine bereid in stap 5 verspreidt, voeg 50 µL van montage medium met DAPI (1.5µg / mL). Zachtjes vlek weg overtollige vocht.
2. Plaats een dekglaasje 22 mm x 60 mm aan op bovenkant en verzegel met duidelijke nagellak. Bewaren in een dia doos bij 4 ° C of -20 ° C tot beoordeling via fluorescentie microscopie.
   Opmerking: Kraan licht op cover slip te ontdoen van overtollige montage medium voor afdichting met nagellak.

Resultaten

Wij hebben twee technieken voor het visualiseren en beoordeling van Meiotische chromosomen in eicellen beschreven. De eerste techniek wordt verzorgd naar profase progressie in embryonale en neonatale eierstokken te beoordelen. Profase chromatine verspreiding preparaten zijn ongelooflijk waardevol voor het visualiseren van tal van dynamische processen tijdens meiose, met inbegrip van de chromosomen in paren rangschikken, synapsis en desynapsis, homologe recombinatie, en epigenetische chrom...

Discussie

Chromatine verspreiding preparaten kunnen onderzoekers chronologisch studeren vrouwelijke zoogdieren meiose en de dynamische lokalisatie van eiwitten die betrokken zijn. De embryonale en neonatale chromatine spreads zorgen voor nauwe analyse van de gebeurtenissen in de gehele Meiotische profase. Metafase I en II metafase chromatine spreads kunnen worden gebruikt om te onderscheiden van één zuster chromatiden van gepaarde zusters en gepaarde homologe chromosomen, evenals ploïdie beoordelen. Ter vergelijking: het protocol ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4	Quality Biological	119-069-161
60 mm x 15 mm petrischalen	Denville	T1106
35mm x 12mm petrischalen	Denville	T1103
Fijne pincet	VWR	300-050
Micro dissectiescharen	Ted Pella	1340
Dissectie schaar, scherpe punt, 41/2"	VWR	82027-578
Horlogeglas vierkant 1 5/8	Carolina Biological Supply Company	742300	Autoclave voor elk gebruik
Sucrose	Sigma	S8501
Trinatriumcitraat Dihydraat	Sigma	S1804
EDTA	Sigma	E6758
Trizma Base	Sigma	T1503
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	646563	Voeg toe aan hypotone buffer onmiddellijk voor gebruik
50x Protease Inhibitor	Roche	11873580001	Voeg toe aan hypotone buffer onmiddellijk voor gebruik
Tuberculin spuit met naald (1cc, 27 G x 1/2 in)	Becton, Dickinson (BD)	309623
Gold seal ultra frost glas slides (25X75mm, 1mm dik)	Thermo	3063-002
Super PAP pen, groot (vloeibare blocker)	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71310
16% Paraformaldehyde waterig	Electron Microscopy Sciences (EMS)	15710
Triton X-100	Sigma	T8787	Detegeren in manuscript
Immuno stain vochthuidkamer	Evergreen	240-9020-Z10
Coplin potten	Fisher	08-815
Photo-flo 200	Electron Microscopy Sciences (EMS)	74257	Bevochtigingsmiddel in manuscript
Pregnancy mare serum gonadotropin (PMSG)	Sigma	G4877	Bewaar aliquots op -20C
Human chorionic gonadotropin (HCG)	Sigma	C0434	Bewaar aliquots op -20C
PYREX Spot Plates met negen concave holtes	Fisher	13-748B	Autoclave voor elk gebruik
Glas capillair	Fisher	22260943	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
Brand Parafilm M	Sigma	BR701501	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
Latex rubber buis (3,2 mm binnendiameter x 6,4 mm buitendiameter)	Fisher	14-178-5B	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
Latex rubber buis (6,4 mm binnendiameter x 11,1 mm buitendiameter)	Fisher	14-178-5D	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
Flexibele siliconenrubber neusstuk, harde plastic mondstuk en 15 inches latex buis	Sigma	A5177-5EA	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
Mitutoyo micrometer hoofd	Mituoyo	150-208	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
Spuit 5 mL	BD Biosciences	309646	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
Spuitfilter 0,45 μm filter	Corning	431220	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
Glas Pasteur Pipette 5 3/4"	Fisher	13-678-6A	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
83 x 0,5 mm pipette tip	Denville	P3080	Voor het maken van oöcyt collectie naalden
α-MEM	Invitrogen	11415049
Waymouth's media	Life Technologies	11220035
Fetaal bovien serum	Fisher	A3160602
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma	A3311	Voor oöcyt cultuur media
500ml filter units 0,22um	Denville	F5227
Hyaluronidase	Sigma	H3506
Tyrode’s oplossing	Sigma	T1788	Bewaar aliquots op -20C
Paarden serum	Sigma	H-1270	Voor ADB/was buffer
Bovine serum albumine (BSA)	Sigma	A1470	Voor ADB/was buffer
VECTASHIELD antifade montage medium met DAPI	Vector Labs	H-1200
Microscoop dekglasjes (22mmx60mm)	Fisher	12-544-G
Klare nagellak	Amazon	N/A
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Microscopen
SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Observer Z1	Zeiss
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Primaire antilichamen
Muis anti-MLH1	Life Technologies	MA5-15431	Verdunningsfactor - 1:100
Konijn anti-SYCP1	Life Technologies	PA1-16763	Verdunningsfactor - 1:1000
Geit anti-SCP3	Santa Cruz	sc-20845	Verdunningsfactor - 1:50
Mens anti-centromeer eiwit	Antibodies Incorporated	15-235	Verdunningsfactor - 1:100
Konijn anti- TOPOII	Abcam	ab109524	Verdunningsfactor - 1:100
Muis anti-Histon H4 (di methyl K20, tri methyl K20)	Abcam