Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom

13.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56739

⸱

2 april 2018

 ,  , 
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een twee-dimensionale gelelektroforese (2DE) dat is gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) te scheiden en te identificeren menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom, waarin een goede en reproduceerbare 2DE patroon. Veel eiwitten worden bij elke 2DE plek waargenomen bij het analyseren van complexe kanker Proteoom met het gebruik van hoog-gevoeligheids MS.

Samenvatting

Menselijke hypofyse-adenoom (PA) is een gemeenschappelijk tumor die voorkomt in de menselijke hypofyse in de as orgaansystemen hypothalamus-hypofyse-gericht, en kan worden aangemerkt als klinisch functionele of deactiveren PA (FPA en NFPA). NFPA is moeilijk voor vroege fase diagnose en therapie toe te schrijven aan de hormonen in het bloed in vergelijking met de FPA nauwelijks te verheffen. Ons langetermijndoel is het gebruik van proteomics methoden om te ontdekken van betrouwbare biomarkers voor verduidelijking van moleculaire mechanismen van PA en erkenning van doeltreffende diagnostische, voorspellende markers en therapeutische doelen. Effectieve tweedimensionale elektroforese van het gel (2DE) gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) methoden werden hier gepresenteerd voor het analyseren van menselijke PA-proteomes, met inbegrip van de voorbereiding van de monsters, 2D gelelektroforese, eiwit visualisatie, beeldanalyse, in-gel spijsvertering van de trypsine, peptide massa vingerafdruk (PMF) en tandem massaspectrometrie (MS/MS). 2-dimensionale gel elektroforese laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI-MS/MS en MS/MS-methoden van 2DE-vloeibare chromatografie (LC) met succes zijn toegepast in een analyse van de NFPA Proteoom. Met het gebruik van een hoog-gevoeligheids-massaspectrometer, werden veel eiwitten geïdentificeerd met de 2DE-LC-MS/MS methode in elke plek in een analyse van complexe PA weefsel te maximaliseren van de dekking van menselijke PA Proteoom 2D gel.

Inleiding

PA is een gemeenschappelijk tumor dat zich voordoet in de menselijke hypofyse in de hypothalamus-hypofyse-gerichte as orgaansystemen, die een belangrijke rol in de menselijke hormoonhuishouding spelen. PA bevat klinisch functionele en functioneert PAs (FPA en NFPA)1,2. NFPA is moeilijk in de vroege fase diagnose en therapie door slechts licht verhoogde hormoonspiegels (bijvoorbeeldLH en FSH) in het bloed in vergelijking met de FPA, die aanzienlijk niveaus van overeenkomstige hormonen in bloed3,4 verhoogde heeft ,5. De verduidelijking van de moleculaire mechanismen en ontdekking van effectieve biomarkers heeft belangrijke klinische betekenis in de diagnose, therapie en prognose van NFPA. Ons langetermijndoel is te ontwikkelen en gebruiken van proteomic methoden voor de analyse van NFPA voor de ontdekking van betrouwbare biomarkers te verduidelijken van de moleculaire mechanismen en herkennen van effectieve therapeutische doelen evenals diagnostische en prognostische markeringen. 2-DE combinatie met MS-methoden zijn uitgebreid gebruikt in onze lange termijn onderzoeksprogramma met betrekking tot menselijke PA Proteoom1,2,6,7, met inbegrip van de oprichting van Proteoom referentie 3,8, analyse van differentially uitgedrukte proteïnen profielen9,10,11,12,13, hormoon varianten14 kaarten ,15, posttranslationele modificaties zoals fosforylatie14 en tyrosine nitratie16,17,18, de proteomic variatie van invasieve ten opzichte noninvasive NFPAs19, en de heterogeniteit van proteomic NFPA subtypen13, die tot de ontdekking van meerdere belangrijke traject netwerken (mitochondriale dysfunctie, celcyclus disregulatie, oxidatieve stress en MAPK signalering leidde systeem de abnormaliteit) die worden gewijzigd in NFPA13,19,20.

2de scheidt proteïnen volgens hun elektrisch punt (pI) (elektrisch gericht, IEF) en moleculair gewicht (via natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide-gelelektroforese, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dit is een gemeenschappelijke en klassieke scheiding techniek op het gebied van proteomics, sinds de invoering van de begrippen van de Proteoom en proteomics in 199524. MS is de cruciale techniek voor het vinden van de identiteit van de 2DE gescheiden eiwitten, met inbegrip van PMF en MS/MS strategieën. De razendsnelle ontwikkeling van MS instrumenten, met name in de aspecten van detectie gevoeligheid en resolutie, in combinatie met de verbetering van de LC systeem, sterk verbetert de identiteit van de laag of zeer laag overvloed eiwitten in een Proteoom te maximaliseren de dekking van een Proteoom. Het daagt ook onze traditionele concepten dat slechts één of twee eiwitten aanwezig zijn in een plek in een analyse van de complexe menselijke weefsels Proteoom 2D gel en biedt een kans om het identificeren van meerdere eiwitten in een 2D gel ter plaatse in een analyse van de complexe menselijke weefsels Proteoom en de dekking van de NFPA Proteoom te maximaliseren.

Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen van 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI-MS/MS en 2DE-LC-MS/MS die met succes zijn gebruikt bij de analyse van menselijke NFPA Proteoom. De protocollen zijn voorbereiding van monsters, eerst dimensie (elektrisch gericht, IEF), tweede dimensie (SDS-PAGE), visualisatie van eiwitten (Zilveren kleuring en Coomassie blue kleuring), beeld analyse van 2D gel, in-gel trypsine spijsvertering, zuivering van al peptiden, PMF, MS/MS en schroeiende3,8,25,26-database. Dit protocol vertaalt bovendien gemakkelijk voor de analyse van de proteomes van andere menselijke weefsels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de Xiangya ziekenhuis medische ethiek Commissie van centrale zuiden Universiteit, China. Een hoofd muts en handschoenen moeten gedragen worden voor de gehele experimentele procedure om keratine verontreiniging van huid en haar8te voorkomen.

1. bereiding van de monsters

  1. Verzamelen PA weefsels (0.2 - 0.5 mg) van de neurochirurgische afdeling. Onmiddellijk bevriezen in vloeibare stikstof, en vervolgens verplaatsing tot-80 ° C voor opslag.
  2. Voeg toe 2 mL 0.9% NaCl in gedeïoniseerd gedestilleerd water (ddH2van O). Gebruik deze oplossing te licht wassen het bloed van het weefsel oppervlak (3 x).
    Opmerking: ddH2O met een geleidingsvermogen van 18.2 MΩ/cm in het gehele protocol wordt gebruikt. Sommige van het tissuemight is verloren bij het wassen uit bloed van een weefsel van oppervlak.
  3. Toevoegen van een volume (10 mL; 4 ° C) van de oplossing met 2 M azijnzuur en 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol voor elke 0,5 - 0,6 g weefsel, meng (1 min, 13.000 rpm, 4 ° C, 10 x) met de homogenizer van een weefsel, bewerk ultrasone trillingen ten het homogenaat voor 20 s, lyophilize , en op te slaan bij −80 ° C.
  4. Meten van het eiwitgehalte van het gelyofiliseerd, gehomogeniseerde monsters met behulp van bicinchoninic zuur (BCA) assay kit.
    Opmerking: BCA kwantificering is niet een absolute kwantificering, en het meetresultaat zal worden gewijzigd met een verschillende technicus en de experimentele agent. Een vaste concentratie monster standaard moet worden gebruikt voor verschillende experimenten. Daarom zal de definitieve laden hoeveelheid eiwitten voor elke 2D gel met het zilver gebeitste of Coomassie gebeitste goed-resolutie afbeelding in de vooraf ontworpen experimenten worden bepaald.
    1. Ongeveer 300 µg van het gelyofiliseerd gehomogeniseerde monster toevoegen aan één volume (282 µL) eiwit-winning buffer (8 M ureum en CHAPS van 4%), gevolgd door permanent voor 2 h, sonicating in een waterbad voor 5 min, roterende voor 1 h, sonicating weer in het waterbad voor 5 min , weer voor 1 h roteren, en bij 15.000 x g gedurende 20 minuten centrifugeren.
    2. Bereiden van BSA standaardoplossingen met concentraties zoals: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1500, 2000 µg Mo/mL met de commerciële BSA-standaard (2 mg/mL).
    3. Mix BCA reagens A en B (A:B = 50: 1) als BCA werkoplossing voorafgaand aan gebruik.
    4. Voeg 0,1 mL van het monster of de standaardoplossing tot 2 mL van de werkoplossing BCA in een microfuge buis, gevolgd door het mengen en vervolgens incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Ten slotte afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en maatregel A562 nm OD-waarde.
    5. De standaard lineaire lijn berekenen (A562 nm vs. BSA concentratie) te verkrijgen van een regressievergelijking voor de berekening van de steekproef proteïne genoegen nemen met een562nm -waarde.
  5. Gebruik 150 µg voor de equivalente gelyofiliseerd eiwitSteekproef voor zilver kleuring of 500 µg van eiwitten voor Coomassie kleuring, voor een 18 cm geïmmobiliseerdet pH verloop (IPG) strip pH van 3-10 niet-lineaire (NL).
    Opmerking: De IPG droge strip is 0,5 mm dik en 3 mm breed, met verschillende lengtes met inbegrip van 7, 11, 13, 18, en 24 cm en verschillende pH bereiken met inbegrip van pH 4-5, 4-7, 6-9 en 3-10 in ofwel een lineaire of niet-lineaire pH verloop. De IPG-buffer die wordt gebruikt, moet de strip27,28passen.
  6. 1.6.add 250 µL van het extraheren van de buffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 4% (m/v) KINNEBAKSPEK, 100 mM DTT (toevoegen vóór gebruik), 0,5% v/v pharmalyte (toevoegen vóór gebruik), en een spoor van bromophenol blauw).
  7. Bewaar deze oplossing onder 30 ° C, gevolgd door de vortexing voor 5 min, sonicating voor 5 min en roteren voor 50 min.
  8. Voeg 110 µL van rehydratie buffer (7 M ureum, 2 M thioureum, 4% (m/v) KINNEBAKSPEK, 60 mM DTT (toevoegen vóór gebruik), 0,5% v/v IPG buffer (toevoegen vóór gebruik), en een spoor van bromophenol blauw). Bewerk ultrasone trillingen ten voor 5 min. Vervolgens draaien het monster gedurende 50 minuten, vortex voor 5 min en Centrifugeer gedurende 20 min bij 15.000 x g.
  9. Verzamelen het supernatant (350 µL) als de eiwit monster oplossing8.

2. twee-dimensionale gelelektroforese

  1. IEF (eerste dimensie): IEF op de elektrisch scherpstelsysteem uitvoeren zoals hieronder beschreven.
    1. Voeg 350 µL van de monsteroplossing eiwit in de sleuf van de houder van een 18-cm IPG strip.
    2. Zet een 18 cm IPG strip gel-side-down op de oplossing van het monster van het eiwit (Vermijd bubbels).
    3. Voeg 3-4 mL minerale olie ter dekking van de IPG-strip.
    4. Monteer de IPG strip houder in het elektrisch gericht systemwith het puntige einde op de rug (+) plaat en vierkante stekker op de voorkant (−) plaat.
    5. Hydrateren overnachting (~ 18 h bij kamertemperatuur).
    6. De IEF parameters instellen: maximale huidige 30 µA per strip, 20 ° C; 250 V, 1 h, 125 Vh, stap en vasthouden; 1000 V, 1 h, 500 Vh, verloop; 8.000 V, 1 h, 4.000 Vh, verloop; 8.000 V, 4 h, 32.000 Vh, stap en vasthouden; en 500 V, 0.5 h, 250 Vh, stap en vasthouden. Laat het oplopen tot een totale tijd van 7,5 h en 36,875 Vh.
    7. Na IEF, haal uit elke strip IPG en verwijder de extra minerale olie met een onoplosbare papieren handdoek. Nu de strip wikkel in een vel plastic omslag, en opslaan bij −80 ° C.
      Opmerking: De houder van de IPGstrip moet worden gereinigd met de houder van de IPGstrip schoonmaakvloeistof en gedestilleerd water.
  2. SDS-pagina (tweede dimensie): SDS-pagina uit te voeren in een verticale cel elektroforese systeem
    Opmerking: De grootte van elke SDS-pagina gel moet 255 x 190 x 1 mm.
    1. Een multi gel caster kunt 12% uitbrengen pagina oplossen gels. Gieten 12% pagina gels, voer de volgende stappen uit.
      1. Voeg 270 mL ddH2O, 150 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8,8), 180 mL van de stockoplossing van 40% (m/v) acrylamide/bisacrylamide (29:1, 40% w/v acrylamide en 1,38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 mL 10% ammoniumnitraat persulfate en 150 µL van TEMED om de gel oplossing in een bekerglas. Meng voorzichtig en luchtbellen voorkomen.
      2. Giet de oplossing van de gel zachtjes in de multicasting zaal tot de hoogte van de verwachte gel (19 cm).
      3. Voeg ongeveer 3 mL ddH2O onmiddellijk toe op elke oplossen gel ter dekking van de gels. Laat de gel polymeriseren gedurende ongeveer 1 uur.
    2. 20 L elektroforese buffer (25 mM Tris, 192 mM glycerine en 0,1% SDS) voor te bereiden. Vul de elektroforese scheiding eenheid buffertank met deze buffer.
    3. De gerichte IPG strips uit de diepvries nemen, en de strips voor 10 min equilibreer door rocken zachtjes in 4 mL vermindering van evenwicht buffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M ureum, 2% (g/v) SDS, 20% (v/v) van glycerol 2% w/v DTT (toevoegen vóór gebruik) en een spoor van bromophenol blauw).
    4. Equilibreer gedurende 10 min door voorzichtig rocken de verminderde IPG strips in 4 mL alkylatie evenwicht buffer (375 mM Tris-HCl (pH 8,8), 6 M ureum, 2% (g/v) SDS, 20% (v/v) glycerol, 2,5% w/v iodoacetamide (toevoegen vóór gebruik), en een spoor van bromophenol blauw).
    5. Demonteren van de multicasting zaal tijdens gel evenwicht, en nemen de bereid oplossen gel cassette. Spoel 3 x met ddH2O. verwijderen overtollige ddH2O met een onoplosbare papieren handdoek, en zet in een gel-stander.
    6. Spoel de equilibrated IPG strips met elektroforese buffer en verwijder overtollige vocht op het oppervlak van de strip IPG met de onoplosbare papieren handdoek.
    7. Een IPG-strip op het oplossen gel voor SDS-pagina, en laat de IPG strip de plastic kant neem contact op met de langere glasplaat en het puntige einde aan de linkerkant.
    8. 3-4 mL hete 1% agarose in SDS elektroforese buffer (~ 80 ° C) snel te verzegelen de IPG strook op de bovenkant van elke SDS-pagina gel, en zet van de kant van IPG strip aan de bovenkant van de kortere glasplaat zonder bubbels, en vervolgens polymeriseren gedurende 10 minuten.
    9. Plaats de cassette gemonteerd gel verticaal tussen kunststof afdichtingen in het verticale elektroforese systeem. De bovenkant van de gel met de IPG strip naast de kathode (−) plaatsen
    10. Pas het niveau van elektroforese buffer om onder te dompelen de gel-cassette.
    11. Sluit de Power Supply/controle-eenheid in de constante spanning-modus instellen en bij 200 V voor ongeveer 370 min lopen terwijl het toezicht op de kleurstof.
    12. Na het lopen, neem de gel cassette uit de Elektroforese van het systeem, en de gel zachtjes te verwijderen van de gel-cassette, het vermijden van scheuren van de gel, gevolgd door de kleuring van 2DE gescheiden eiwitten.
  3. -Verkleuring van de 2DE gescheiden eiwitten
    1. Zilveren kleuring
      1. Zachtjes Breng de gel met twee handen in een lade met daarin 250 mL van fixatie oplossing (50% methanol (v/v) en 5% (v/v) azijnzuur), en de gel gedurende 20 minuten zachtjes te schudden.
      2. Negeren van de oplossing en voeg 250 mL methanol van 50% (v/v) in de lade en zachtjes schudden voor 10 min.
      3. Negeren van methanol en voeg 250 mL van ddH2O ter naar de schenkblad. Schud gedurende 10 min zachtjes.
      4. Voorzichtig schudden van de gel voor 1 min in 250 mL sensibilisatie buffer met 0,02% (m/v) natrium thiosulfate, en gooi de vloeistof.
      5. Schud de gel zachtjes in 250 mL van ddH2O voor 1 min (nog een keer herhalen). Gooi de vloeistof na elke stap.
      6. Voorzichtig de gel gedurende 20 minuten schudden in 250 mL zilver reactie oplossing (zilvernitraat 0,1% (g/v) met 200 µL 37% (v/v) formaldehyde toegevoegd vóór gebruik).
      7. Schud de gel zachtjes in 250 mL van ddH2O voor 1 min (nog een keer herhalen). Gooi de vloeistof na elke stap.
      8. Schud de gel zachtjes in de oplossing van de gegevensbestandontwikkeling van 250 mL (3% (m/v) natriumcarbonaat met 100 µL 37% (v/v) formaldehyde toegevoegd vóór gebruik) totdat de gewenste intensiteit van kleuring is bereikt (meestal 1-3 min), de vloeistof dan negeren.
      9. Voorzichtig schudden van de gel gedurende 10 minuten in 250 mL oplossing (5% (v/v) azijnzuur) stoppen en gooi de vloeistof.
      10. Voorzichtig schudden gedurende 5 min. in 250 mL van ddH2O en gooi de vloeistof.
      11. Houd de gel in 250 mL opslag oplossing 8,8% glycerol bij 4 ° C.
    2. Coomassie briljant blauw kleuring
      1. Bereiden Coomassie kleurstofoplossing door het oplossen van briljante Coomassie blue G250 0,3 g ammoniumsulfaat 25 g en fosforzuur 25 mL in ddH2O en tot een totaal volume van 200 mL. Voorafgaand aan het gebruik, het toevoegen van methanol 50 mL.
      2. Voeg 250 mL Coomassie kleurstofoplossing aan de gel en zachtjes schudden bij kamertemperatuur tot duidelijke eiwit vlekken verschijnen (~ 2-4 h). Gooi de vloeistof.
      3. Voeg 250 mL ddH2O en schud langzaam voor 5 min, vervolgens tweemaal meer. Gooi de vloeistof.
      4. Voeg 250 mL destaining-oplossing (20% (v/v) ethanol) en schud langzaam totdat de achtergrondkleur bijna kleurloos geworden, en gooi de vloeistof.
      5. Vervangen door de verse destaining oplossing wanneer de oude een wordt donker, en gooi de vloeistof.
      6. Voeg 250 mL ddH2O en schud gedurende 5 min. negeren de vloeistof langzaam.
      7. Voeg 250 mL van oplossing (8,8% glycerol) op te slaan en te bewaren bij 4 ° C.
  4. Tweedimensionale gel elektroforese beeldanalyse
    1. De gekleurde gels digitaliseren met een flatbed-scanner.
    2. Inbreng van de afbeelding in de 2D gel systeem voor de analyse van de afbeelding.
    3. Detecteren en kwantificeren van elke vlek met behulp van een software van de analyse van het beeld 2D gel volgens protocol van de fabrikant.
    4. Overeenkomen met de plekjes tussen verschillende gels.

3. identificatie van 2DE gescheiden eiwitten met MS

  1. Voorbereiding van al peptide mengsel
    Opmerking: Gesiliconiseerd of lage-retentie tubes en Pipetteer tips moeten worden gebruikt om te voorkomen dat enig verlies van eiwitten of peptiden.
    1. Zilver-gel destaining
      1. Accijnzen de gel vlekken in een 1,5 mL gesiliconiseerd tube, en wassen in 500 µL ddH2O 6 keer.
      2. Zet de gewassen gel in een nieuwe 1,5 mL gesiliconiseerd buis, en het in vele kleine stukjes gehakt (0.5-1 mm3).
      3. Destain van de stukken van de gel in 20 µL van de destaining oplossing die mixen van een deel van 30 mM kalium Hexacyanoferraat en een deel van 100 mM natrium thiosulfate (1:1) vóór gebruik te laten de bruinachtige kleur verdwijnen (meestal 1-2 min). Gooi de vloeistof.
      4. De stukken van de gel met 20 µL van ddH2O 5 - 6 keer wassen om te laten de gele kleur verdwijnen. Gooi de vloeistof na elke stap.
      5. 20 µL van 200 mM Ammoniumbicarbonaat toevoegen aan de gel-stukken, en verblijf voor 20 min. Wash gel stukken met ddH2O (20 µL, 1 keer). Gooi de vloeistof.
      6. De gel-stukken met 30 µL acetonitril ten minste tweemaal uitdrogen zodat de stukken van de gel een ondoorzichtig wit en vacuüm-centrifuge droge gedurende 30 minuten draaien.
    2. Coomassie briljant blauw gel destaining
      1. Gel vlekken in een tube van 1,5 mL gesiliconiseerd gesneden en wassen met 500 µL ddH2O ten minste 3 keer.
      2. Zet de gewassen gel in een nieuwe 1.5-mL gesiliconiseerd buis, en het in verschillende stukken gehakt (0.5-1 mm3) met een pipet tip.
      3. Destain van de gel in de 50-100 µL destaining oplossing (1:1 v/v mix 200 mM NH4HCO3 met acetonitril) afhankelijk van het volume van de gel, Incubeer bij 37 ° C in een waterbad. Herhaal en toevoegen van verse destaining oplossing totdat de kleur verdwijnt (~ 1 h). Gooi de vloeistof na elke stap.
      4. Wassen van de stukken van de gel een keer met 20 µL van ddH2O.
      5. Uitdrogen van de gel stukken in 100 µL acetonitril (ten minste tweemaal) om te laten de stukken van de gel een ondoorzichtig wit zet.
      6. Vacuüm droog voor 30 min.
    3. In-gel trypsine vertering van de eiwitten in de gedroogde gel-stukken
      1. 20 µg (833 pmol) ontbinden gelyofiliseerd trypsine poeder in 100 µL van 50 mM azijnzuur.
      2. Verdun 20 µL van trypsine oplossing (200 ng/µL) tot 16 ng/µL met 230 µL van 50 mM Ammoniumbicarbonaat.
      3. Voeg 20-30 µL (0.32-0.48 µg) van de oplossing van verdunde trypsine aan elke buis met gedroogde gel stuks. Incubeer gedurende 18-20 h in een 37 ° C in waterbad. Laat de oplossing staan bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
      4. Centrifugeer de oplossing voorzichtig gedurende 10 s. Sonicate in een waterbad voor 5-6 min bij 30 ° C en vervolgens Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 2 minuten.
      5. Het verzamelen van de bovendrijvende substantie die al peptide mengsel in een 0,5 mL gesiliconiseerd buis.
    4. Zuivering van al peptide mengsel met C18 microkolom.
      1. Wassen elke C18-kolom met acetonitril (10 µL, 5 keer), en dan met 50% acetonitril (10 µL, 5 keer).
      2. Equilibreer met 0,1% trifluor azijnzuur (TFA) (10 µL, 5 keer).
      3. Pipetteer het monster op en neer door de bereid C18-kolom voor 15 keer.
      4. Wassen van het monster 2 x met 10 µL 0,1% TFA.
        Opmerking: De gezuiverde al peptiden blijven behouden in de C18-kolom.
      5. Toevoegen van een volume (6 µL) van de oplossing (85% v/v acetonitrile/0.1% v/v mierenzuur) in een schoon 0,5 mL gesiliconiseerd buis, Pipetteer van deze oplossing voorzichtig en langzaam op en neer via peptide-C18 kralen voor 10 x te wassen van de obligatie peptiden in de oplossing, drogen , en winkel (−20 ° C) voor MS-analyse.
  2. MS-analyse
    1. MALDI-MS PMF analyse
      1. Voeg 4 µL van 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA te ontbinden van het gezuiverde al peptide-mengsel. Belasting 2 µL ontbonden al peptide mengsel op een MALDI-bord en onmiddellijk toevoegen 2 µL van а-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) oplossing waarin 10 g/L in 500 mL/L acetonitril 1 mL/L TFA, vervolgens drogen.
      2. Laad de MALDI-plaat met al peptide mengsel in een massaspectrometer MALDI-MS.
        Opmerking: De instrument-parameters worden ingesteld als reflector modus met 20 kV spanning, positieve polariteit en 160 ns vertraging extractie tijd versnellen. Elke MS-spectrum is verkregen met 200 laser-foto's met een bereik van 1.000 tot 4000 m/z na externe kalibratie met de standaard peptide massa.
      3. Een MS spectrum-processing software gebruiken voor het verwerken van elke MS-spectrum, met inbegrip van de correctie van de basislijn, ruisverwijdering (5%) en deisotoping van de piek.
      4. Corrigeer de massa lijst uit elke MS spectrum met de verwijdering van contaminerende massa's van trypsine, matrix, keratines en andere onbekende verontreinigingen in de parallel op blanco-gel experimenten.
      5. Input de gecorrigeerde massa lijst in een PMF gebaseerde eiwit zoeken software te identificeren van eiwitten in het Swiss-Prot eiwit-database met de volgende zoekparameters, met inbegrip van PMF zoektype, menselijke, trypsine met 1 maximale gemist decollete, vaste carbamidomethyl cysteïne, variabele methionine oxidatie, exacte, peptide massa tolerantie 50 ppm, peptide gratis staat (1 +), en signaal aan lawaai (S/N) 5.0.
      6. Eiwitten met statistisch significant eiwit scores, identificeren en waar eiwit score =-10 × log(p), waar p is de kans dat de waargenomen match een willekeurige gebeurtenis is.
    2. MALDI-MS/MS analyse
      1. Voeg 4 µL van 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA te ontbinden van het gezuiverde al peptide-mengsel. Elke gezuiverde al peptide mengsel (0,5 µL) was gespot op een 384-well MALDI-plaat, onmiddellijk gespot 0.5 µL van verzadigde CHCA matrix in 50% acetonitrile/0.1% TFA op de bovenkant van het monster van peptide en daarna gedroogd in de lucht.
      2. Laat de MALDI-TOF-TOF MS/MS automatisch worden beheerd met behulp van 100 laser schoten te verwerven van een MS1 spectrum, en accumuleren 6 herhaald MS1 spectra in een synthetische MS1 spectrum.
      3. 4 de voorloper van de meeste-intens ionen uit elke synthetische MS1 spectrum voor MS/MS analyse instellen Gebruik 100 laser schoten voor elke voorloper ion te verwerven van een MS/MS spectrum, en accumuleren 4 herhaald MS/MS-spectra in een synthetische MS/MS spectrum.
      4. De synthetische MS/MS-gegevens gebruiken om te zoeken naar eiwitten door middel van een op basis van MS/MS eiwit software zoeken met parameters waaronder MS/MS Ion zoeken, Swiss-Prot menselijke database, trypsine met een maximum van 1 gemiste decollete, vaste carbamidomethyl (C), variabele Oxidatie (M), exacte massa waarde, peptide massa tolerantie ± 100 ppm, en fragment massa tolerantie ± 0,7 Da.
      5. Identificeren van een eiwit met een statistisch significante kans op basis van Mowse score, en ionen score = -10 x Log(P), waar p de kans is dat de waargenomen match een willekeurige gebeurtenis is.
    3. LC-ESI-MS/MS analyse
      1. Voeg 6 µL van 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v mierenzuur te ontbinden van het gezuiverde al peptide-mengsel.
      2. Gebruik een krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) systeem online in combinatie met een electrospray ionisatie (ESI)-MS/MS massa spectrometer met een MS/MS verworven data management software voor het beheren van de hele operatie.
      3. Gebruik de C18 val kolom (300 µm i.d. × 5 mm lengte), en omgekeerde-phase C18 kolom (75 µm i.d. x 15 cm lengte) met een verloop van de scheiding op 98% oplosmiddel een (0,1% mierenzuur) en 2% oplosmiddel B (0,1% mierenzuur in 100% acetonitril) gedurende 2 minuten , 2% tot 40% oplosmiddel B voor 45 min, 40% tot 95% oplosmiddel B voor 5 min en 95% oplosmiddel B voor 10 min (een totaal van 65 min op 300 nL/min).
      4. Positief-ion modus en gegevens-afhankelijke automatische onderzoek naar MS en MS/MS-spectra te verwerven, en stel de botsing-geïnduceerde dissociatie (CID) voor ion fragmentatie instellen
      5. Elke scan MS instellen op een massale bereik van 350-1800 m/z met een resolutie van 100.000 op m/z 400. De scan voor de 7 meest-intens ionen in de MS-scan uitvoeren
      6. Op basis van gebruik MS/MS eiwit zoeken software ik te zoeken in de database voor de identificatie van eiwitten.
        1. Selecteer de database die menselijke eiwitten.
        2. Selecteer trypsine met één gemiste breukzijde toegestaan.
        3. Instellen van peptide tolerantie (±10 ppm), fragment ion tolerantie (±0.8 Da), peptide lading (2 + 3 + en 4 +), vaste carbamidomethylation in cysteïne, en variabele oxidatie aan methionine.
        4. Valse ontdekking tarieven (FDR) < 1%, en alleen peptiden met rang 1 worden geaccepteerd.
        5. Identificeren van eiwit met PSM≥1 (PSMs: het totale aantal geïdentificeerde peptide reeksen (PSMs) voor de eiwit, met inbegrip van die welke redundant) en ten minste twee unieke peptiden per eiwit.
      7. Ook, op basis van MS/MS eiwit zoeken software II te gebruiken om te zoeken in de database voor de identificatie van eiwitten.
        1. De ruwe MS-bestand converteren naar een .mgf-bestand.
        2. De menselijke eiwit database (uniprothuman_20161031.fasta waarin 70940 sequenties en 23897047 residuen) geselecteerd.
        3. Selecteer de spijsvertering van de trypsine met een maximum van 2 gemiste breuklijnen.
        4. Set vaste carbamidomethyl (C), variabele deamidated (NQ) en oxidatie (M), voorloper van ion massa tolerantie 10 ppm, dochter ion massa tolerantie 0,8 Da en exacte piek.
        5. Identificeren eiwitten met een drempel van de betekenis van 0,05 en ten minste 2 unieke peptiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

1. 2DE-MALDI MS PMF: met de experimentele procedure hierboven beschreven, een totaal van 150 µg eiwitten werden gehaald uit FSH-uitgedrukt NFPA weefsels (vrouw, 50 jaar oud, ACTH (-), GH (-), PRL (-), LH (-), FSH (+), en TSH (-)) en bekleed met een 18 cm IPG strip (pH 3-10 NL) en een grootformaat SDS-pagina gel, dan gevisualiseerd met zilveren kleuring. We verkregen een reproduceerbare en goede 2DE gel patroon van NFPA weefsel Proteoom (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

2de, met inbegrip van de 2DE-MS PMF en 2DE-MS/MS, MS-methoden wordt gekoppeld is met succes gebruikt in onze lange termijn programma - het gebruik van proteomics menselijke NFPA proteomic variaties en moleculaire netwerk variaties voor de opheldering van het moleculaire mechanismen te bestuderen en ontdekking van effectieve biomarkers voor NFPAs. 2de gebaseerde vergelijkende proteomics met goede reproduceerbaarheid speelt een belangrijke rol bij de identificatie van de NFPA proteomic variaties9

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen conflict van belang is.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de nationale stichting van de natuurwetenschappen van China (Grant No. 81572278 en 81272798 naar XZ), de subsidies van China "863" Plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 tot XZ), de Xiangya ziekenhuis fondsen voor Talent inleiding (tot XZ) en de Hunan Provinciale Natural Science Foundation van China (Grant No. 14JJ7008 aan XZ). De auteurs erkennen ook de wetenschappelijke bijdrage van Dr. Dominic M. Desiderio in de Universiteit van Tennessee Health Science Center. X.Z. voortdurend ontwikkeld en 2DE-MS-methoden gebruikt voor het analyseren van de hypofyse adenoom Proteoom vanaf 2001, bedacht het concept voor het huidige manuscript schreef en herziene versie van het manuscript, de relevante werkzaamheden gecoördineerd en was verantwoordelijk voor de financiële steun en bijbehorende werk. Y.L. nam deel aan de herziening van het manuscript. Y.H deelgenomen aan collectie verwijzingen naar, en herziening van het manuscript. Alle auteurs goedgekeurd het laatste manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ettan IPGphor 3 GE Healthcareiso-elektrisch focussysteem.
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II SystemAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAHet verticale elektroforesesysteem
Ettan IPGphor strip holderAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel casterAmersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USAMultigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS ABI, Foster City,CAMALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOFAutoflex III, BrukerMALDI-MS/MS massaspectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETDThermo Scientific, Waltham, MA, USAESI-MS/MS massaspectrometer
EASY-nano LC system Proxeon Biosystems, Odense, DenmarkHogeprestatievloeistofchromatografiesysteem
PepMap C18 trap column 300 μm i.d. × 5 mm lengte; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column75 μm i.d., 15 cm lengte; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipeKimvipe Onoplosbaar papieren handdoek
WatterGemaakt door PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenisatorBrinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuestBio-Rad,  Hercules, CA2D gelbeeldanalysesoftware
SEQUEST Thermo Proteome Discoverer 1.3 (versienummer 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) softwareMS spectrumverwerkingssoftware
Mascot softwarePMF-gebaseerde eiwitzoeksoftware  
Mascot softwareMS/MS-gebaseerde eiwitzoeksoftware
Proteome Discoverer software v.1.3 betaThermo Scientific
Xcalibur software v.2.1MS/MS data-acquired management software 
Uniprot versie 201410.1_HUMAN.fastaMenselijk eiwitdatabestand
SEQUEST (versienummer 1.3.0.339) MS/MS-gebaseerde eiwitzoeksoftware I
MASCOT (versie 2.3.02) MS/MS-gebaseerde eiwitzoeksoftware II
C18 ZipTip microcolumnMillipore
PeptideMass Standard kit Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
2-D Quant KitGE Healthcare80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDEAMRESCO0172
ACRYLAMIDEAMRESCO0341
DTTSigma-AldrichD0632
ThioureaSigma-AldrichT8656
UreaVETECV900119
SDSAMRESCO0227
CHAPSAMRESCO0465
TEMEDAMRESCOM146
Ammonium PersulfateAMRESCOM133
TrypsinPromega, Madison, WI, USAV5111
IPG buffer pH 3-10, NLGE Healthcare17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cmGE Healthcare17-1235-01

Referenties

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
  28. Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Proteoom van hypofyseadenoomeiwitmonsterbereidingisoelectrische focusseringSDS PAGE geleiwitvisualisatiein gel trypsineverteringpeptide massavingerafdruktandemmassaspectrometrie
Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.