In dit verslag zijn de voordelen van organotypic culturen en gedissocieerde primaire culturen van muis-afgeleide dorsal root ganglia gemarkeerd om te onderzoeken van een breed scala van mechanismen die zijn gekoppeld aan neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, neuroinflammation, en reactie op virale infectie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol beschrijft een ex vivo -model van de muis afkomstige dorsal root ganglia (DRG) explant en in vitro DRG afkomstige co cultuur van gedissocieerde sensorische zenuwcellen en gliacellen satelliet. Dit zijn handige en veelzijdige modellen te onderzoeken van een verscheidenheid van biologische reacties fysiologische en pathologische omstandigheden van het perifere zenuwstelsel (PNS) variërend van neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, gekoppeld neuroinflammation en virale infectie. Het gebruik van de DRG explant is wetenschappelijk voordelig in vergelijking met simplistische afzonderlijke cellen modellen om meerdere redenen. Bijvoorbeeld, als een organotypic cultuur kunt de DRG explant ex vivo overdracht van een gehele neuronale netwerk, met inbegrip van de extracellulaire communicatie die een belangrijke rol in alle functies voor de neuronale en gliale. Verder, DRG explantaten kunnen ook worden gehandhaafd ex vivo voor enkele dagen en de kweekomstandigheden kunnen worden verstoord als gewenst. Bovendien, kan de geoogste DRG in een in vitro co cultuur van primaire sensorische zenuwcellen en gliacellen satelliet te onderzoeken neuronale-gliale interactie, neuritogenesis, axonale kegel interactie met de extracellulaire verder worden losgekoppeld communicatie, en meer in het algemeen, de diverse aspecten die zijn gekoppeld aan de neuronale metabolisme. Dus biedt het systeem van de DRG-explant een grote mate van flexibiliteit te bestuderen van een breed scala aan gebeurtenissen met betrekking tot de biologische, fysiologische en pathologische omstandigheden op een kosteneffectieve manier.
Inleiding
In dit manuscript rapporteren we een methode voor het verkrijgen van een organotypic ex vivo model van een muis afgeleid DRG modelsysteem als een bewaarde weefsel-achtige communicatie te onderzoeken van een breed scala aan biologische reacties op PNS beledigingen variërend van neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, inflammatoire merkers, virale infectie. Daarnaast ontwikkelden we verder een protocol wilt maken van een primaire co cultuur van DRG-afgeleide één sensorische neuronen en satelliet cellen.
De DRG zijn grijs-zaak-eenheden van de satelliet langs de dorsale wervelkolom wortels van spinale zenuwen buiten het centrale z....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met inbegrip van het gebruik van de dieren zijn goedgekeurd door de institutionele beoordeling bestuur goedgekeurde protocollen (IACUC-Midwesten University).
1. oogsten DRG van muis embryo 's
-
De volwassen muizen door verstikking methode (CO2) gevolgd door onthoofding euthanaseren. Onmiddellijk overgaan tot het operatief verwijderen van de wervelkolom.
- De wervelkolom bloot door het kappen van de huidlaag dorsally met fijne schaar. Het isoleren van de wervelkolom door te snijden door middel van de ribben aan weerszijden van de kolom en het heiligbeen scheiden van de wervelkolom ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Meerdere aspecten van Neuroplasticiteit en neuron-omgeving interactie kunnen worden onderzocht met behulp van de Deutsche Reichsbahn en een gedissocieerde eencellige cultuur model. We begonnen de studies door het isoleren van een DRG explant en DRG-afgeleide gedissocieerde cellen zo schematisch weergegeven in Figuur 1. Zowel weefsel en afzonderlijke cellen modellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid van moleculaire technieken zoals immunofluorescentie, westelijke v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De ex vivo DRG model is uiterst nuttig om te onderzoeken van een breed scala aan evenementen zoals neuron-glia interactie en het effect van de communicatie op beide neuronale en gliale metabolisme37. Verder, de DRG-model kan worden gebruikt als een rendabele tool inspelen op relevante vragen betreffende pathogeen mechanisme en bijbehorende markeringen door het ontwikkelen van ex vivo systemen voor chronische en latente acute fase van infectie of in een bepaalde ziekte. Bovendien,.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te openbaarmaking.
Dankbetuigingen
We bedanken de Imaging core-faciliteit in het Midwesten Universiteit (MWU) en de groep studenten [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo en Casey Sigerson] voor hun bijdragen in celkweek en imaging werk. Dit onderzoekswerk werd gesteund door de de MWU Intramural subsidiefinanciering M.F. en onderzoek start-up fondsen aan V.T.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous eiwitmengsel |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Onderdeel van SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement voor neuronale cultuur |
| PSN antibiotica | Gibco | 15640-055 | *Onderdeel van SFM media Antibiotische mix |
| L-glutamaat | Sigma-Aldrich | G7513 | *Onderdeel van SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminine gecoate dekglasjes | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG substraat | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubuline | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 verdunning |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 verdunning |
| Hoechst kleurstof | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM eindconcentratie |
| Anti-heparine sulfaat | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antilichaam | Virostat | 196 | 1:10 verdunning |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Onderdeel van SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Onderdeel van SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Onderdeel van SFM media |
| KIT (Insulin-transferrine-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Onderdeel van SFM media |
| Vitamine-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Onderdeel van SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Onderdeel van SFM media |
| 488 (geit anti-muis) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (geit anti-konijn) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normaal Geit serum | Vector | S-1000 | |
| Formaline Oplossing | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescentie berging |
| Diamond White Glass Dekglasjes | Globe Scientific | 1380-20 |
Referenties
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546(2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the ea....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
