Het volgende protocol is gericht op de oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom (STS). Dit model kan ons helpen om beter inzicht in de moleculaire achtergrond en farmacologisch profiel van deze zeldzame maligniteiten en kon vertegenwoordigen een startpunt voor verder onderzoek ter verbetering van het beheer van de St.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Weke delen sarcomen (STS) vertegenwoordigen een breed scala aan heterogene maligniteiten met een moeilijke diagnose, classificatie en beheer. Tot op heden zijn meer dan 50 histologische subtypes van deze zeldzame solide tumoren geïdentificeerd. Dus, wegens hun buitengewone verscheidenheid en lage incidentie, ons begrip van de biologie van deze tumoren is nog steeds beperkt. Patiënt afkomstige culturen vertegenwoordigen het ideale platform om te studeren St pathofysiologie en farmacologie. Dus ontwikkelden we een menselijke preklinische model van St vanaf tumor specimens geoogst van patiënten chirurgische resectie ondergaan. St celculturen patiënt afkomstige waren de chirurgische specimens verkregen door collagenase spijsvertering en geïsoleerd door filtratie. Cellen werden geteld, zaadjes, en vertrok naar 14 dagen in standaard enkelgelaagde culturen en vervolgens verwerkt door downstream-analyse. Voordat u moleculaire of farmaceutische analyses uitvoert, de oprichting van St primaire culturen werd bevestigd door de evaluatie van cytomorphologic functies en, voorzover beschikbaar, immunohistochemische markeringen. Deze methode is een nuttig instrument 1) te bestuderen de natuurlijke geschiedenis van deze slecht onderzocht maligniteiten en 2) de effecten van verschillende drugs testen in een poging om meer te leren over hun mechanismen van actie.
Inleiding
Weke delen sarcomen (STS) omvat een spectrum van heterogene laesies van mesenchymale oorsprong boekhouding voor 1% van alle stevige tumors1,2, en de nieuwe classificatie van de World Health Organization erkent de aanwezigheid van meer dan 50 verschillende subtypen3. Daaronder zijn de meest voorkomende histotypes adipocyte Sarcoom of liposarcoom en leiomyosarcoma, 15% en 11% van alle volwassen St, respectievelijk4,5. Hoewel St in verschillende delen van het lichaam ontwikkelen kunnen, zijn de extremiteiten en het retroperitoneum de meest voorkomende sites, die zich in de 60% en 20% van de gevallen, respectievelijk6.
De hoeksteen van therapie voor gelokaliseerde ziekte is breed chirurgische resectie, terwijl de voordelen van adjuvante en neoadjuvante chemotherapie nog steeds onduidelijk zijn en alleen in bepaalde gevallen7 overwogen zijn. In de gemetastaseerde setting, chemotherapie is de standaard van zorg maar beperkte resultaten8toont. Een beter begrip van de moleculaire biologie van St zou bijdragen tot het verbeteren van de huidige differentiële diagnose, optimaliseren van de beschikbare behandelingen en identificeren van nieuwe streefcijfers voor therapie.
In dit verband is onderzoek naar kanker uitgevoerd voor vele jaren met vereeuwigd cel lijnen9. Deze experimentele modellen zijn normaal gekweekt in standaard enkelgelaagde ondersteunt of immunodeficiëntie knaagdieren om in vivo xenograft modellen10ingeplant. Vereeuwigd cellijnen vertegenwoordigen een beheersbaar en easy-to-winkel materiaal waarmee een voldoende aantal onderzoek experimenten kan worden uitgevoerd. Ze zijn in feite de minst dure en meest gebruikte hulpmiddel in preklinische studies11.
Echter cellijn-gebaseerd kanker modellen hebben ook enkele beperkingen, bijvoorbeeld langdurig cultuur in een enkelgelaagde systeem samen met een toenemend aantal passages induceert fenotypische en genetische drift, maken cellen minder waarschijnlijk te recapituleren belangrijke tumor functies. Bovendien celculturen lijn niet reproduceren de cel-naar-cel interactie en signalering Overspraak van het molecuul dat het biologisch gedrag van tumoren wordt nagebootst en karakteriseren van de communicatie van de tumor. Deze vraagstukken vormen de basis van het verschil tussen de resultaten van de preklinische en klinische12.
Gezien het bovenstaande is de belangstelling in de patiënt-afgeleide primaire culturen13toegenomen. Inderdaad, de besnijdenis van kwaadaardige en normaal weefsel vermindert het risico van verlies van kanker cel fenotype en heterogeniteit, waardoor grondstof die meer representatief is voor de communicatie van de tumor. Bovendien, het gebruik van verse tumor specimens geoogst van patiënten die een chirurgische resectie stelt ons in staat te onderzoeken enkele tumoren en vergelijken van de verschillende letsels van hetzelfde deel van een patiënt lichaam14. Om bovenstaande redenen bieden weefsel afkomstige celculturen een waardevol materiaal om te bestuderen van de tumor pathofysiologie en farmacologie15,16,17, vooral in St in welke cellijnen verkrijgbare Sarcoom beperkte18bent. We geoptimaliseerd dus een methode om vast te stellen een patiënt afkomstige St primaire celculturen vanaf Operatief verwijderde tumor weefsel13,19,20. Onze werkwijze bestaat uit disaggregating van de tumor specimen in kleine weefsel fragmenten gevolgd door overnight enzymatische weefsel dissociatie te verkrijgen van de schorsing van een enkele cel. De volgende dag, de enzymatische spijsvertering wordt tegengehouden door het toevoegen van verse cultuurmedia en de verkregen schorsing wordt gefilterd om weefsel fragmenten, cel-aggregaten, en overtollige matrix materiaal of puin te verwijderen. Ten slotte, een fractie van geïsoleerde tumorcellen is cytospinned in glas dia's, vaste en opgeslagen voor downstream analyse gericht op het bevestigen van de oprichting van St primaire cultuur door cytomorphological, immunohistochemische en moleculaire cytogenetische evaluatie (b.v. vis analyse van versterking van de MDM2 vormt de standaard differentiële diagnose voor een goed gedifferentieerde liposarcoom en de dedifferentiated liposarcoom) 4. de resterende cellen worden overgeënt in een standaard enkelgelaagde cultuur voor gen expressie profilering en farmacologische studies. Al de experimenten zijn uitgevoerd met behulp van lage primaire culturen om te voorkomen dat de selectie van specifieke kanker subklonen passage en geanalyseerd door een ervaren Sarcoom patholoog. Dus hebben we een volledig mens St ex-vivo model13,19,20. Deze uiterst veelzijdige, gebruiksvriendelijke handvat model kon vertegenwoordigen een nuttig hulpmiddel voor verschillende soorten preklinisch onderzoek, bijvoorbeeld identificeren van nieuwe moleculaire merkers voor diagnose en prognose of krijgen een dieper begrip van de activiteit en de mechanismen van werking van standaard en nieuwe geneesmiddelen die gebruikt worden bij het beheer van de St.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
St cellen zijn geïsoleerd uit een tumor massa operatief weggesneden uit patiënten met St. Het protocol is goedgekeurd door de lokale ethische Commissie en wordt uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor goede klinische praktijken en de verklaring van Helsinki. Alle patiënten gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de studie. De chirurgische specimens worden geanalyseerd door een ervaren Sarcoom patholoog en verwerkt binnen 3 uur na de operatie.
1. tumor Specimen Collection en verwerking:
- Het verzamelen van monsters van de tumor met de hulp van een patholoog Sarcoom in een 100 mL steriele urine container met 50 mL DMEM lage glucose voedingsbodem verzegeld met een paraffine-film.
- Het opslaan van de monsters bij 4 ° C voor een maximum van 3 h na resectie van de tumor.
- Voer alle volgende stappen onder de motorkap van een steriele weefselkweek.
- Steriliseren van de kap met 70% ethanol en steriele handschoenen dragen.
- Steriliseren staal inox pincet met 70% ethanol (gebruik een steriel gaas).
- Verwijder de folie van de paraffine uit de urine-container en gooi deze weg.
- Wassen op de buitenkant van de container van de urine met 70% ethanol.
- Open een vierkante petrischaal.
- Open de container van de urine en breng de specimens van de tumor in de vierkante petrischaal met behulp van de gesteriliseerde staal inox pincet.
- De specimens van de tumor met PBS tweemaal wassen.
- Open een steriele chirurgische scalpel.
- Fijn versnipperen de tumor specimens in 1-2 mm3 stuks.
- Een kwart van het totale monster in een tube 2-mL verzamelen.
- Voeg vervolgens 1 mL van trizol reagens (gekocht) aan de buis en onmiddellijk bevriezen bij-80 ° C (het monster zal worden gebruikt in de downstream-analyse voor de beoordeling van St gen expressie).
- Het verzamelen van de rest van het materiaal voor fijn gesnipperde tumor in een tube van 15 mL.
- Voeg 4 mL collagenase typ ik oplossing (collagenase type ik wordt opgelost in PBS, met een concentratie van 4 µg/mL).
- Verdun de collagenase typ ik oplossing met 4 mL DMEM hoge voedingsbodems (eindconcentratie van collagenase type ik is 2 µg/mL).
- Sluit de tube van 15 mL en verzegelen met paraffine film.
- Zet de buis 15 mL in een rollende shaker in een incubator bij 37 ° C in roeren voorwaarden voor 15 min te activeren van de spijsvertering.
- Bewaar de buis in de glooiende shaker onder roeren voorwaarden bij kamertemperatuur 's nachts na 15 min.
- De volgende dag zet de buis 15 mL onder de steriele motorkap.
- Zachtjes de celsuspensie wordt gefiltreerd door een 100 µm steriele filter gekoppeld aan de bovenkant van een tube van 50 mL.
- Was het filter met DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine.
- Negeren van de 100 µm steriele filter, sluit de tube 50 mL en centrifuge op 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant door het omkeren van de buis.
- Resuspendeer de cellen met 1-2 mL DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine.
Opmerking: Het volume is afhankelijk van de hoeveelheid tumor monster verwerkt. - De cellen met een kamer Neubauer tellen.
- Verdun de monster 1:2 in trypan blauw en cellen tellen met 10 µL van de verdunning.
- Ten minste tweemaal tellen en berekent het gemiddelde van de wordt gerepliceerd naar het totale gemiddelde aantal cellen verzamelde kennen.
- De cellen van de plaat in een standaard enkelgelaagde cultuur bij een dichtheid van 80.000 cellen/cm2.
Opmerking: Altijd besturingselementen opnemen in experimenten. Voer ten minste 3 technische replicatieonderzoeken voor elke voorwaarde. Voer ten minste 2 biologische replicatieonderzoeken. Voor preklinische farmacologie, genuitdrukking en eiwit expressie analyses, moeten proeven worden verricht met een laag aantal passages van de cultuur binnen 30-45 dagen cel zaaien om te voorkomen dat de kanker cel fenotypen verloren gaat. - Cytologische monstervoorbereiding.
- Verzamelen van 100.000 cellen in 200 µL van DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine.
- Pipetteer de oplossing (200 µL pipet) in een wegwerp trechter voorzien van een filter en gemonteerd met een glasplaatje.
- Open de cytocentrifuge en plaats van de monsters.
- De cytocentrifuge bij 18.6 x g gedurende 20 min lopen.
- Gooi de trechter uitgerust met het filter.
- De dia's in aceton gedurende 10 minuten gevolgd door chloroform voor 5 min opgelost.
- Opslaan van de dia's bij-20 ° C.
Opmerking: Ontdooien en hydrateren van de monsters vóór kleuring en voeren de kleuring na instructies van de fabrikant. Ten minste 3 technische replicatieonderzoeken voor te bereiden.
2. St celculturen:
- Wijzigen media eenmaal per week (DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine).
- Gooi het kweekmedium met behulp van een precisiepipet 200-1000 µL.
- Het toevoegen van nieuwe verse medium met behulp van een precisiepipet 200-1000 µL.
- Cel passage:
- Ontkoppel cellen wanneer de samenvloeiing ligt rond de 90 procent:
Opmerking: St cel cultuur versterking moet eenmaal per week op basis van de cultuuromstandigheden worden uitgevoerd. - Negeren van medium, wassen met PBS en voeg 2-3 mL trypsine 1 x in PBS
Opmerking: Het volume van de trypsine gebruikt, is afhankelijk van de hoeveelheid gekweekte cellen verkregen. - Incubeer de cellen gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C.
- Vrijstaand cellen van de plaat met behulp van een precisiepipet 200-1000 µL verzamelen.
- Pipetteer van de vrijstaande cellen in een buis 15 mL en voeg 4 mL van DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine om te stoppen met de enzymatische reactie.
- Centrifugeer bij 225 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel door toevoeging van 1 mL van DMEM hoge voedingsbodems aangevuld met foetale runderserum 10%, 1% glutamine en 1% penicilline/streptomycine.
- Het zaad van de cellen in een maatkolf met een eindvolume volgens de instructies van de fabrikant of een nieuwe plaat van de cultuur.
Opmerking: Splits cellen meer dan 1:3 niet.
- Ontkoppel cellen wanneer de samenvloeiing ligt rond de 90 procent:
3. stroomafwaarts Analyses:
Opmerking: Een scala aan verschillende experimenten kan worden uitgevoerd met behulp van dit model (zie hieronder). Het is daarom cruciaal om tijdens de ontwerpfase van de studie die analyses worden uitgevoerd zodat een voldoende aantal monsters en replicaten kan worden voorbereid.
- Proliferatie assays zoals MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (en)
- Apoptotic assays zoals terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick einde labeling (TUNEL) assay
- Analyse van Immunohistochemical
- Gen expressie analyse
- Westelijke vlekkenanalyse
- Analyse ELISA
- Fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse
- In vivo xenograft model
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We ontwierpen een eenvoudige methode voor het verkrijgen van de oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom en rapporteren hier een voorbeeld van resultaten op één specifieke St histotype13. Het protocol werd gebruikt voor de totstandbrenging van primaire culturen van verschillende St histotypes met inbegrip van goed gedifferentieerde liposarcoom, dedifferentiated liposarcoom myxoid liposarcoom, pleomorfe liposarcoom, myxofibrosarco...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Goed gedefinieerde preklinische modellen zijn nodig om het ophelderen van de moleculaire achtergrond van tumoren, voorspellen van slechte prognose en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen voor kankerpatiënten. Dit is vooral belangrijk voor zeldzame tumoren zoals St waarvan hoge heterogeniteit in termen van morfologie, agressief gedrag van de potentiële en klinische daagt ons begrip van de biologie van de St en patiëntenbeheer21. Bovendien beperkt het aantal commerciële Sarcoom cellijnen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Dankbetuigingen
De auteurs bedank Gráinne Tierney voor redactionele ondersteuning.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetaal bovien serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% waterige oplossing, EM-kwaliteit | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicilline streptomycine | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagens | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsine | EuroClone | ECB3052D |
Referenties
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294(2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662(2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313(2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309(2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313(2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
