Een verbeterde methode voor de verzameling van de cerebrospinale vloeistof van narcose muizen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een verbeterde techniek voor de overvloedige hoeveelheid cerebrospinale vloeistof (CSF) met geen besmetting uit bloed. Met grotere sample collectie en zuiverheid, kunnen meer analyses worden uitgevoerd met behulp van CSF om ons begrip van ziekten die de hersenen en het ruggenmerg beïnvloeden.

Samenvatting

De cerebrospinale vloeistof (CSF) is een waardevolle lichaamsvloeistof p.a. in onderzoek neurowetenschap. Het is een van de vloeistoffen in de dichtstbijzijnde contact met het centrale zenuwstelsel en zo kan worden gebruikt voor het analyseren van de zieke staat van de hersenen of ruggenmerg zonder direct toegang tot deze weefsels. Echter bij muizen is het moeilijk te verkrijgen van de cisterna magna als gevolg van de nabijheid van bloedvaten, besmetten die vaak monsters. Het gebied voor CSF collectie in muizen is ook moeilijk te ontleden en vaak alleen kleine steekproeven worden verkregen (maximaal 5-7 µL of minder). Dit protocol beschrijft in detail een techniek die verbetert op de huidige methoden van collectie Minimaliseer verontreiniging van bloed te voorzien in de overvloedige collectie van CB (gemiddeld die 10-15 µL kan worden geïnd). Deze techniek kan worden gebruikt met andere methoden van de dissectie voor weefsel collectie van muizen, zoals het geen voor alle weefsels tijdens de CSF extractie gevolgen heeft. Dus, de hersenen en het ruggenmerg ondervinden geen problemen met deze techniek en intact blijven. Met grotere CSF sample collectie en zuiverheid, meer analyses kunnen worden gebruikt met dit onderzoek van de neurowetenschappen vloeistof verder steun en ziekten van de hersenen en het ruggenmerg beter te begrijpen.

Inleiding

Het CB is een waardevolle lichaamsvloeistof p.a. in onderzoek neurowetenschap. Het CB bestaat voornamelijk uit bloedplasma, met enkele cellen (geen rode bloedcellen en slechts een paar witte bloedcellen) en is bijna op eiwit-vrij. Het is een van de vloeistoffen in nauw contact met het centrale zenuwstelsel (CNS) en het vele elektrolyten uit vanuit de hersenen en het ruggenmerg aan de perifere systeem kan doorgeven. Bij de mens, CSF monsters kan worden verzameld om te helpen bij de diagnose van de ziekte of voor onderzoeksdoeleinden in klinische proeven, als een spinal tap (of de Lumbaalpunctie) is een kleine, invasieve procedure: de CSF vloeistof kan wijzigingen in het VNV zonder voor directe toegang tot deze weefsels. Dus, in de afgelopen jaren, voor onderzoeksdoeleinden in de kliniek, CSF monsters zijn verkregen van patiënten van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer en andere dementie^1,2,3. Er zijn vele biomerker-tests die zijn ontwikkeld met behulp van CSF monsters te kunnen helpen bij de diagnose van de ziekten in de kliniek^2,3. Er is echter veel discussie over de betrouwbaarheid van deze tests te produceren consistente, gevoelige resultaten specifiek diagnose ziekte^4,5. Dus, is er een grote behoefte aan de ontwikkeling van betere tests en doelstellingen, die kunnen worden gevonden in het CB, steun bij het opstellen van een standaard techniek aan het diagnosticeren van neurodegeneratieve ziekten met grotere gevoeligheid en specificiteit. Vanwege het potentiële belang van menselijke CSF monsters in ziekte is de collectie van CB van knaagdieren in onderzoek neurowetenschap ook van belang.

Muizen zijn belangrijke dieren in biologische en medisch onderzoek en zorgen voor het testen van potentiële therapeutische stoffen en proof-of-concept studies voor menselijke klinische proeven. Bij muizen is het echter moeilijk te verkrijgen van CSF monsters als gevolg van de nabijheid van de hersenen in een klein dier, zoals de gebruikelijke methode van CSF collectie in muizen is te verkrijgen via de cisterna magna, een opening tussen het cerebellum en de dorsale oppervlak van het verlengde merg. Dit veroorzaakt problemen in het verzamelen van CSF monsters zoals dit gebied moeilijk is te ontleden om en in de directe nabijheid van bloedvaten, waardoor het risico van besmetting van bloedcellen. Als gevolg van deze moeilijkheden, de meeste onderzoekers kunnen uitsluitend worden verkregen door een kleine hoeveelheid van CB p.a. (meestal vermeld als 5-7 µL) en de besmetting van CSF monsters door bloedcellen is een primaire zorg voor analyses^{6,7,8 , 9}. bloed besmetting kan obscure resultaten en niet echt overeen met de staat van het centraal zenuwstelsel. Bovendien beperkt monster kan invloed hebben op onderzoek zoals het gebruikelijke bedrag verzameld van muizen voldoende voor slechts één meting (in tweevoud of drievoud is) met behulp van de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). Dus, CSF monsters meestal uit meerdere muizen zijn samengevoegd om genoeg monster meerdere tests uitvoeren. Ontwikkeling van een protocol voor de overvloedige, onbesmette collectie van CB van muizen is zeer gewenst en bij het verbeteren van de neurowetenschappen onderzoek met behulp van knaagdieren gunstig zal zijn.

In dit protocol, een techniek voor het overvloedige (gemiddeld 10-15 µL) collectie van CB van narcose muizen wordt in detail beschreven en verbetert op een op dit moment bekende methode van CSF-collectie om te minimaliseren van verontreiniging van bloed¹⁰. Een robuust protocol voor CSF collectie zal helpen in de ontwikkeling van CSF gebaseerde biomerker tests, die kan worden gebruikt om steun in de diagnose van de ziekte, evenals het verbeteren van onderzoek in de mechanismen die ten grondslag liggen aan ziekten van de CNS.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd overeenkomstig het beleid van de vereniging voor Neurowetenschappen (USA) en ethische commissies van de Fudan Universiteit (Shanghai, China). Deze procedure is voor een niet-survival-chirurgie.

1. installatie van CB collectie apparatuur

1. Trek de glazen capillaire (binnendiameter 0,75 mm, buitendiameter 1,0 mm) met een trekker van de micropipet (zoals in Liu et al. ¹⁰; scherp capillair is afgebeeld in Figuur 1).
2. Plaats een aangescherpte glazen capillaire in de capillaire houder stevig gemonteerd op een micromanipulator (figuur 1A).
3. Breken van de tip van het aangescherpte capillair met een rechte Tang onder een Microscoop ontleden, zodat de binnendiameter van de gebroken tip gaat over 10-20 µm (Figuur 1 c).
4. Een dunne buis en een spuit koppelen aan het andere uiteinde van de capillaire houder en sluit de dunne buis en de spuit met een drie-weg klep.
5. Verschuiving van de drie-weg klep om te openen en duik de spuit te blazen lucht uit de spuit via de buis aan het glas capillaire te verdrijven van eventuele verontreinigingen en creëren positieve druk in het capillair.
6. Herhaal dit een paar keer door DIS sluiten en opnieuw aansluiten van de injectiespuit op de drie-weg klep, en opstelling van de spuit van ~ 100-200 µL voordat de laatste opnieuw verbinding van de spuit met de drie-weg klep (figuur 1B).
7. De micromanipulator met de glazen capillaire verplaatsen naar de kant om schade te voorkomen tijdens de dissectie van de muis.

Figuur 1. Microscoop, micromanipulator en capillaire setup. (A) Microscoop en micromanipulator met capillaire aangesloten setup, alsmede een nauwere beeld van (B) de aangesloten spuit en drie-weg ventiel te openen (zie hier) of sluit de leidingen, en (C) een ongebroken (rechts) en gebroken (links) capillaire tip klaar voor CSF-collectie. Zodra gebroken, de tip van het capillair moeten een inwendige diameter van 0,75 mm, buitendiameter van 1,0 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. muis dissectie

1. Anesthetize de muis.
   Opmerking: voor dit protocol, C57BL/6 en amyloid precursor eiwit/presenilin 1 (APP/PS1) transgene muizen (model van de muis van de ziekte van Alzheimer) werden gebruikt en verdoofd met 4% Chloraalhydraat (in dH₂0) bij 10 µL/g van muis gewicht via intraperitoneaal injectie.
2. Wanneer volledig verdoofd, ervoor zorgen dat de muis voldoende is verdoofd. De reactie van de terugtrekking tot teen snuifje, door iets uit te breiden van de achterste ledematen en knijpen van de tenen en kijken voor een terugtrekking reactie, is uitgevoerd om te verzekeren van voldoende verdoving. Controleren door te knijpen alle vier ledematen; Als er geen reactie is de muis goed verdoofd. Snijden en knippen van de haren op de achterkant van het hoofd van de muis boven de ogen, tussen de oren aan de onderkant van de nek met behulp van ontleden schaar (figuur 2A). Als alternatief, tondeuse of ontharende room kan worden gebruikt om te helpen bij de verwijdering van het haar.
3. Het hoofd van de muis met een muis adapter veilig (achterkant van het hoofd naar boven met de neus wees neer op ~ 45 °, figuur 2A). Oor balken tussen de oren en de ogen van de muis los en draai. Zorg ervoor dat het hoofd niet verplaatsen en strak in de adapter is beveiligd door zachtjes duwen naar beneden aan het hoofd van de muis.
4. Gecontroleerd of er terugtrekking antwoord teen snuifje alvorens chirurgische incisies en op gezette tijden daarna te verzekeren van chirurgische vliegtuig van de verdoving. Visueel Opmerking eventuele wijzigingen in de ademhaling tijdens de procedure om aan te geven van de veranderingen in de vliegtuigen van de verdoving. Een schone, niet-aseptische, techniek kan worden gebruikt voor deze korte niet-survival-chirurgie. Met behulp van schaar en pincet gebogen, doorsnijden de huid en de eerste laag van spier totdat de onderkant van de schedel met slechts een dun laagje van de spier wordt blootgesteld.
   Opmerking: Via de huid van de muis dwars door de achterkant van de nek en dan snijd de huid in het midden van de schedel tussen de oren en de ogen van de muis. Huid en weefsel kunnen dan worden getrokken uit elkaar en uit het gebied over de cisterna magna.
5. Terwijl bekijken door het ontleden Microscoop, ontleden zorgvuldig weg de laatste dunne lagen van spier over de basis van de schedel met pincet en verplaatsen van deze lagen van de spier aan de zijkant en uit het gebied van belang. Als er is bloeden, wattenstaafjes gebruiken verwijderen te helpen stoppen met het bloeden.
6. Zodra de dura over de cisterna magna is blootgesteld (driehoekige vorm met meestal 1-2 grote bloedvaten loopt door het gebied; beide zijden of tussen de bloedvaten is optimaal voor de capillaire inbrengen en CSF collectie, figuur 2B), gebruik maken van een NAT wattenstaafje aan veeg het membraan schoon en droog het gebied met een droge wattenstaafje.

Figuur 2. Muis en dissectie setup met representatieve beelden van capillaire plaatsingskosten voor CSF collectie. Installatie van muis klaar voor CSF extractie met (A) geschoren hoofd geklemd in plaats voor dissectie en (B) gedetailleerde foto (10 x weergave) van een ontleed muis dura die betrekking hebben op de cisterna magna (onderbroken pijl toont een bloedvat loopt door het gebied en gevulde pijl geeft gebied optimaal voor capillaire invoegpositie). Gedetailleerde beelden (10 x weergave) van (C) geslepen tip van glazen capillaire uitgelijnd tegen dura van cisterna magna, (D) het punt waarop het capillair puncties bijna de dura, met enige weerstand van dura en (E) de capillaire tip getikt via de dura voor het verzamelen van CSF. CSF moet een heldere vloeistof verzameld in de glazen capillaire (gestippelde pijl). Alle schaal staven op de rechterbenedenhoek van elke afbeelding Microscoop geven 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. CB collectie van narcose muis

1. De glazen viscometerbuizen aan de achterkant van het hoofd van de muis uitlijnen zodat het scherp punt is net achter het membraan op een ~ 30-45 ° hoek (figuur 2C).
2. Duik de spuit eens of een paar keer en het opstellen van de spuit ~ 100-200 µL (zodat zeker dat er geen verontreinigingen en er is negatieve druk in de glazen capillaire).
3. Met behulp van de micromanipulator, het verplaatsen van het capillair tip dichter bij het membraan tot weerstand kan worden gezien, maar niet prikken het (figuur 2D).
4. Zodra weerstand wordt gezien tussen het uiteinde van het capillair en de membraan, zachtjes het capillair via het membraan te onttrekken door het kloppen op de micromanipulator-besturingselementen. Gebruik de Microscoop te zien het scherp punt van de capillaire punctie in de cisterna magna. CSF moet automatisch worden getrokken in het capillair zodra de opening heeft zijn doorboord (figuur 2E).
5. Laat het capillair langzaam verzamelen CSF. Als het CB heeft gestopt tekening uit, trekken de injectiespuit omhoog een weinig langzaam (~ 50 µL) maken meer negatieve druk in het capillair uitpakken uit het CB.
   Opmerking: U kunt ook de capillaire kan worden voorzichtig en langzaam getrokken uit de hersenen met de fijne micromanipulator besturingselementen toe CSF te stromen in het capillair opnieuw. Een totaalbedrag van ~ 10-15 µL van CB (~ 3-4 cm in het capillair) duurt ~ 10-30 min, en af en toe 20 µL of meer kunnen worden verzameld. Hoewel niet strikt noodzakelijk is, is het aanbevolen om het gebruik van een warmte-pad tijdens CSF-collectie. CSF collectie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur (~ 23 ° C).
6. Zodra het bedrag van gewenste CB wordt verzameld, sluit u de slang door een verschuiving van de drie-weg klep te sluiten (als u wilt stoppen met tekenen uit het CB).
7. Neem de spuit aangesloten op de buis, en opent en sluit de slang (als u wilt maken genivelleerde druk in de capillaire buis en het gebied buiten het capillair). Sluit de spuit met de drie-weg klep, maar niet de spuit storten.
8. Verwijder voorzichtig de glazen viscometerbuizen uit de muis met behulp van de micromanipulator.
9. Plaats de collectie buis (1,5 mL slangen met 1 µL van 20 x proteaseinhibitor) onder het scherp punt van de glazen capillaire.
10. Open de buis en zachtjes duik de spuit: het CB moet vloeien uit het capillair en in de buis van de collectie.
11. Na het verzamelen, snel centrifugeren (pulse spin voor 5 s met maximale snelheid met behulp van een mini centrifuge) het CB om te mengen van het monster met de proteaseinhibitor aan de onderkant van de buis van de collectie.
    Opmerking: CSF monsters kunnen worden aliquoted en vervolgens opgeslagen voor verdere analyse bij-80 ° C. De rest van de muis kan worden ontleed voor andere weefsels, zoals de hersenen en het ruggenmerg. De muis in dit stadium nog in leven is en dus bloed kan ook worden verzameld, indien nodig.

Resultaten

Met behulp van de procedure die hier beschreven (Figuur 1 en Figuur 2), moet het CB onmiddellijk verzameld in het capillair duidelijk (figuur 2E), niet roze of rood. Als er een roze tot rode tint aan de vloeistof in het capillair verzameld, dan was er verontreiniging met bloed.

Een voorbeeld van de toepassing van het CSF-monster verzameld m...

Discussie

Dit protocol beschrijft in detail een techniek die verbetert op huidige methoden¹⁰ van CSF collectie Minimaliseer verontreiniging van bloed te voorzien in de overvloedige collectie van CB (gemiddeld ~ 10-15 µL kan worden verkregen) van muizen. Bij het afbreken van de capillaire tip, de tip van het capillair mag niet te klein (als toen het CB worden uitgepakt heel langzaam) of te groot (zal niet fijn genoeg om te verzamelen van het CB en het weefsel kan worden ingediend in het capillair). Zorg moet...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chloral hydrate (gebruikt als anestheticum)	Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.	30037517	CAS-nummer 302-17-0.
Dissectie schaar	66 vision technology	54002
Gebogen dissectietang	66 vision technology	53072
Rechte dissectietang	66 vision technology	53070
Muisadapter (met oorpennen)	Gemaakt in huis.	N/A	Vergelijkbare apparatuur verkrijgbaar bij World Precision Instruments.
Dissectiemicroscoop	Meiji Labax	Model 15381
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Magneetbasis voor micromanipulator	Kanetec	MB-K
Glazen capillairen	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipet aanzuiger	Sutter Instruments	Model P-1000
Spuiten (1ml)	Tansoole	02024692	Voor 1ml.
Microbuisjes (1,5ml)	Axygen	MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-vrij	Calbiochem	539134
Human Aβ42 ELISA kit	Invitrogen	KHB3441
Pijpleidingen (teflon buis)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Verkregen uit een micro-injectiekit en bevestigd aan de capillairhouder en spuit.
Mini centrifuge	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Wattenstaafjes	Verkrijgbaar bij elke huishoudwinkel/apotheek.	N/A