Methodenartikel

Zika Virus specifieke diagnostische Epitope ontdekking

DOI:

10.3791/56784

⸱

12 december 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences and Craniofacial Development, New York University College of Dentistry, 2Rheonix, Inc., 3Department of Medicine, New York University Langone School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we een techniek om te ontdekken Zika virus specifieke diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray. Dit protocol kan readly worden aangepast voor andere opkomende infectieziekten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

High-density peptide microarrays toestaan screening van meer dan zesduizend peptiden op een uniforme standaard microscopie dia. Deze methode kan worden toegepast voor drugontdekking therapeutische target identificatie en ontwikkeling van diagnostiek. Hier presenteren we een protocol om te ontdekken van specifieke Zika virus (ZIKV) diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray. Een menselijke serummonster gevalideerd voor ZIKV infectie was geïncubeerd met een hoge dichtheid peptide microarray die hele ZIKV eiwit vertaald in 3,423 unieke 15 lineaire aminozuurresidu (aa) 's met een overlapping van 14-aa residuen bevatten afgedrukt in tweevoud. Kleuring met verschillende secundaire antilichamen binnen dezelfde array, we gedetecteerd peptiden die zich aan immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG) antilichamen in het serum aanwezig binden. Deze peptiden werden geselecteerd voor verdere validatie experimenten. In dit protocol beschrijven we de strategie gevolgd om te ontwerpen, verwerken en analyseren van een high-density peptide microarray.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zika virus (ZIKV) diagnose op basis van klinische symptomen is uitdagend omdat het deelt vectoren, geografische spreiding en symptomen met Dengue en Chikungunya virus infectie1. Gezien het risico voor ongewenste zwangerschap resultaten bij vrouwen geïnfecteerd met ZIKV tijdens de zwangerschap, is het belangrijk om te onderscheiden tussen de 3 virussen. Hoewel de huidige moleculaire diagnostische tests specifiek zijn, zijn ze alleen nuttig in bloed of speeksel in de relatief korte periode van acute infectie2,3. Serologische tests zijn essentieel voor de diagnose buiten deze beginperiode van infectie4.

De ontwikkeling van een specifieke serologische test ZIKV is een uitdaging om twee redenen: ten eerste de Zika-antigenen die het menselijke immuunsysteem reageert op niet op dit moment bekend zijn; en tweede, geconserveerde flavivirussen aminozuur sequenties veroorzaken antilichaam Kruisallergie. Ons doel was om te ontdekken unieke ZIKV specifieke peptiden in diagnostiek worden gebruikt. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om scherm peptide bibliotheken die betrekking hebben op hele eiwitten met inbegrip van phage, bacteriële, en gist oppervlak weer5,6,7,8,9, 10. Onze strategie was het gebruik van een hoge dichtheid peptide microarray waarmee snelle en goedkope high-throughput serologische screenings11,12 en nadien de geïdentificeerde peptiden kunnen worden gebruikt ter verbetering van de huidige serologische tests voor de opsporing van ZIKV infectie.

Dit protocol maakt de ontdekking van Zika virus specifieke diagnostische peptiden met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray (Figuur 1). De high-density peptide microarray werd geproduceerd met behulp van de peptide laser printing technologie. De gehele ZIKV eiwit reeks bestaande uit 3,423 aminozuurresidu's op basis van de Frans Polynesische stam (GenBank: KJ776791.2), werd gedrukt op een standaard glasplaatje in blokken van 15 lineaire residuen met een overlapping van 14 aminozuurresidu's in tweevoud voor een totaal 6,846 peptide vlekken. Naast de gehele Zika eiwit sequentie peptides, de microarray maakt gebruik van Influenza hemagglutinine (HA) peptiden voor interne controle.

Een Zika gevalideerd positieve serummonster verkregen Wadsworth Center (Albany, NY), werd gebruikt voor het identificeren van specifieke immunoglobuline M (IgM) en immunoglobuline G (IgG) reactieve peptiden. Na incubatie met het monster 's nachts, was de microarray gekleurd met een secundaire fluorescerende geconjugeerd antilichaam (Anti-menselijke IgM of anti-menselijke IgG) en geanalyseerd op een microarray scanner. Kwantificering van plek intensiteiten en peptide aantekening werd uitgevoerd met een specifieke software geboden door hetzelfde bedrijf dat de microarray vervaardigd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze gegevens zijn een onderdeel van een lopend onderzoek studie, uitgevoerd aan de New York University College voor tandheelkunde en goedgekeurd door de institutionele Review Board van de New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Klinische monsters gebruikt in deze studie werden de geïdentificeerde monsters eerder gebruikt voor diagnose en met toestemming van de Wadsworth Center van New York State Department van gezondheid, Albany, NY.

1. het installeren de ZIKV High-density Peptide Microarray Slide in een specifieke incubatie-lade

  1. Omgaan met het glasplaatje door de randen met poederloze handschoenen. De afmetingen van de dia glas zijn 75.4 mm door 25.0 mm en 1 mm dik. Plaats de dia in het incubatie-lade met het microarray oppervlak naar boven.
  2. Plaats de glanzende zijde van het zegel beneden zijn gericht op het bedrukte oppervlak van microarray. Om een goede positie, overlappen de schroefgaten van het zegel en de grondplaat.
  3. Plaats het bovenste gedeelte van de lade naar het zegel te maken een microarray kamer.
  4. Het beveiligen van de dia in de lade door aanscherping even de duimschroeven achter elkaar met de hand in een afwisselend patroon vanaf de linkerbovenhoek gevolgd door rechtsonder. Plaats het deksel van de incubatie-lade.

2. achtergrond interactie detectie: Kleuring de Microarray met secundaire antilichamen

Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (standaard en blokkerende buffers, verdunde secundaire antilichamen) in de hoek van de kamer van microarray.

  1. Incubeer de microarray met een standaard buffer (1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 0,05% Tween 20, pH 7.4, gefilterd met een 0,45 µm filter) (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
  2. Verwijder de standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray. Vul lege dia houders met lege dia's om te voorkomen dat het breken van de dia van microarray.
  3. Blokkeren de microarray met de buffer met blokkerend (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) gedurende 60 minuten op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
  4. Verwijder de buffer met blokkerend door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
  5. Incubeer de microarray met secundair antilichaam, Anti-menselijke IgM fluorescerende geconjugeerd, verdunde 1:5000 (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) in de kleuring buffer (10% blokkeerbuffer in standaard buffer) gedurende 30 min. bij RT in het donker op een roteerschudapparaat op 140 rpm.
  6. Het secundaire antilichaam verwijderen door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
  7. Wassen van de microarray 3 x, 1 min per wasbeurt met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
  8. Dompel de dia 2 x in een vers bereide dompelen buffer (1 mM Tris, pH 7.4), (totaal volume van 200 mL).
  9. Droog de microarray zorgvuldig, voor ongeveer 1 min., door het zuigen overtollige vocht zeer zorgvuldig vanaf de top naar de onderkant van de dia zonder het aanraken van de dia-oppervlak. Het analyseren van de dia in een microarray scanner lezer.

3. blootstelling van de Microarray voor het hosten van Serum

Let op: Deze stap onder laboratoriumomstandigheden veiligheid, Biosafety Level 2 (BSL-2) vanwege de potentiële besmettelijke aard van de serum-exemplaren uitvoeren. Werken binnen een klasse II biologische veiligheidskast (BSC).

  1. Inactivering van serummonster bij 56 ° C gedurende 30 minuten en centrifuge op 16.000 rcf gedurende 5 minuten bij 4 ° C13.
    Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (kleuring, standaard buffer en verdund serum) in de hoek van de kamer van microarray.
  2. Verdun serummonster in kleuring buffer beginnen bij een verdunning 1:1,000 (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray). Houd het bij 4 ° C tot gebruik.
  3. Incubeer de microarray met de kleuring buffer (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray) gedurende 15 minuten op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
  4. Verwijder de kleuring buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
  5. Incubeer de microarray met de verdunde serummonster 's nachts bij 4 ° C op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
  6. Verwijder het verdunde serummonster door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
  7. Wassen van de microarray 3 x, 1 min per wasbeurt met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 μL/microarray op RT op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.

4. vlekken met secundaire antilichamen en gelabelde controle antilichamen

Opmerking: Gebruik een pipet om het storten van de oplossingen (standaard buffers, verdunde middelbare en label antilichamen) in de hoek van de kamer van microarray.

  1. Verdun het secundaire antilichaam in de kleuring buffer.
    Opmerking: Gebruik anti-menselijke IgM fluorescerende geconjugeerd antilichaam of anti-menselijke IgG fluorescerende geconjugeerd antilichaam bij een verdunning 1:5,000 (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) in kleuring buffer.
  2. Mix besturingselement label antilichaam (monoklonaal anti-HA fluorescerende geconjugeerd) bij een verdunning 1:1,000 (totale hoeveelheid 2 000 µL/microarray) in buffer met secundair antilichaam eerder verdund in buffer kleuring vlekken.
  3. Incubeer met de microarray gedurende 30 min. op RT in het donker op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut.
  4. Verwijder de mix van verdunde middelbare en label antilichamen door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.
  5. 3 x met standaard buffer (totale hoeveelheid 2.000 µL/microarray) wassen. Elke wasbeurt is voor 1 min op een roteerschudapparaat bij 140 omwentelingen per minuut. Na elke wasbeurt, verwijdert u het standaard buffer door zuigen met een pipet uit de hoek van de kamer van microarray.

5. Microarray scannen

  1. Dompel de dia 2 x in vers bereide dompelen buffer (1 mM Tris, pH 7.4) (totaal volume van 200 mL).
  2. Droog de microarray zorgvuldig, ongeveer 1 min., door zuigen zeer zorgvuldig vanaf de top naar de onderkant van de dia zonder het aanraken van de dia-oppervlak.
  3. Scan de microarray volgens de instructies van de scanner. Plaats de dia op de scanner met het bedrukte oppervlak naar boven.
  4. Maak een nieuw project en selecteer het scangebied. Scanner parameters als instellen: resolutie: 21 µm, intensiteit voor zowel 700 en 800 nm kanalen: 7.0, scannen kwaliteit: medium en Offset: 0.8.
  5. Verwerven en sla de scan onbewerkte afbeelding als een 16-bits grayscale TIFF bestandsformaat.

6. Microarray analyse met behulp van een specifieke Software

  1. Open de onbewerkte afbeelding (TIFF-afbeelding). Open het bestand van de grid array.
  2. Het raster van de array naar de scannen afbeelding uitlijnen met de pijltjestoetsen muis of het toetsenbord van de computer.
  3. Selecteer "Kwantificeren selectie" in de specifieke software, waardoor een uitlezing-bestand waarin de signaalsterkte voor elke vlek, de waarde van de achtergrond en de corresponderende opeenvolging van peptide.
    Opmerking: Dit uitvoerbestand kan ook worden geïmporteerd naar een spreadsheetprogramma voor aanvullende analyse en grafieken.

7. Microarray opslag

  1. Bewaar de microarray verzegeld in het donker bij 4 ° C onder zuurstof vrij stikstof of argon gas.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten verkregen met behulp van het protocol beschreven zijn afgebeeld in Figuur 2 en Figuur 3. Geen achtergrond interacties werden geconstateerd wanneer vooraf kleuring de microarray met secundaire anti-mens IgM (gegevens niet worden weergegeven). Kleuring met een anti-mens IgM resulteerde conjugaat in verschillende gebieden boven de achtergrond groene fluorescentie intensiteiten, met vermelding van de b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwierpen een protocol met behulp van een diskette met hoge dichtheid peptide microarray met de gehele Zika virus eiwit sequentie (Frans-Polynesische stam). De microarray werd geproduceerd door afdrukken 3,423 verschillende overlappende lineaire peptiden. Elke peptide was 15 aminozuren en gevarieerd door slechts één residu van zijn naaste buur in de reeks (d.w.z., 14 residu overlapping). Hoewel kortere overlappingen kunnen worden afgedrukt, is epitoop toewijzing nauwkeuriger met langere overlappingen. Elke p...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huidige wordt ondersteund door een SBIR (Small Business Innovation Research) administratieve toeslag subsidie van NIDCRR44 DE024456. U01 DE017855 NIDCR HIV-subsidie die ontstaan uit NIDCR verlenen voor de ontwikkeling van een bevestigende diagnose van de point-of-care voor HIV. Wij erkennen dankbaar Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) voor haar technische bijstand en vriendelijke ondersteuning. Wij danken ook NYU Langone Medical Center voor het LI-COR Odyssey Imaging systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Custom peptide microarray: onze microarray bevat de volledige Zika-virus-eiwitsequentie
PEPperCHIP incubatielade 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
PEPperCHIP-kleuringskit (680 nm) (anti-HA, DyLight-labeling)PEPperPRINTPPC.037.002
PepSLide AnalyzerPEPperPRINTPSA.004.00114 dagen gratis licentie voor Windows
Rockland Blocking bufferRocklandMB-070
anti-human IgM (mu keten) DyLight 800Rockland609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
Orbitale shaker-apparaatIKAMTS 2/4 digitale microtiter shaker
Adobe IllustratorAdobe
DeltagraphRedrocks

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6(2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748(2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330(2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , 2nd ed, (2013).
  15. Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Peptide microarraydiagnostische peptidenIgM detectieIgG detectiearray met hoge dichtheidserumanalyseantilichaambindingmicroarray scanning

Gerelateerde artikelen