Methodenartikel

Kwantitatieve meting van de γ-Secretase-gemedieerde amyloïde Precursor proteïne en Notch decollete in cel-gebaseerde Luciferase verslaggever Assay platformen

6.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56795

⸱

25 januari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We hebben met succes twee substraat-specifieke γ-secretase tests gegenereerd. Zowel cel-gebaseerde testen hier gepresenteerd zijn ontworpen om het kwantificeren van de enzymatische activiteiten γ-secretase via de uitgang van firefly luciferase verslaggevers.

Samenvatting

We hebben een paar van cel-gebaseerde reporter gene assays voor het kwantitatief meten van γ-secretase splitsing van verschillende substraten ontwikkeld. Dit manuscript worden procedures beschreven die kunnen worden gebruikt om te controleren γ-secretase-gemedieerde splitsing van APP-C99 of Inkeping, met behulp van een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever systeem. Deze testen werden opgericht door stabiel transfecting mede HEK293 cellen met het Gal4-gedreven luciferase verslaggever gen en ofwel het C-terminal Gal4/VP16-gelabeld fragment van APP (APP-C99; CG-cellen), of de Gal4/VP16-gelabeld Notch-ΔE (NΔE; NG cellen). Met behulp van deze verslaggever assays parallel, we hebben aangetoond dat een ErbB2-remmer, CL-387,785, bij voorkeur γ-secretase splitsing van APP-C99 in CG cellen, maar niet NΔE in NG cellen kunt onderdrukken. De differentiële reacties tentoongesteld door de CG en NG cellen, wanneer behandeld met CL-387,785, vertegenwoordigen een voorkeur kenmerkend voor γ-secretase modulatoren, en deze antwoorden staan in schril contrast tot de pan-remming van de γ-secretase geïnduceerd door DAPT. Ons onderzoek levert direct bewijs dat γ-secretase activiteiten naar verschillende ondergronden kunnen worden onderscheiden in een cellulaire context. Deze nieuwe testen kunnen dus nuttige hulpmiddelen in drugontdekking voor verbeterde AD therapieën.

Inleiding

Oligomere vormen van amyloid-β (Aβ) worden verondersteld te zijn de primaire oorzaak van neurodegeneratie in de hersenen van patiënten die lijden aan de ziekte van Alzheimer (AD)1. Aβ peptides worden geproduceerd door de stapsgewijze splitsing van amyloïde precursor eiwit (APP), eerst door β-secretase, en vervolgens door γ-secretase2. In het afgelopen decennium, hebben therapeutische benaderingen naar behandeling van advertentie gericht op de preventie van Aβ productie3. De meerderheid van de studies hebben gericht op ofwel de vergroting van α-secretase activiteit, die kan beletsel γ-secretase splitsing van APP en daardoor verminderen de productie van Aβ of de remming van β-en/of γ-secretase activiteiten4. Helaas, niet-selectieve inhibitie van β - of γ-secretases resultaten in onvermijdelijk bijwerkingen zijn die als gevolg van interferentie met de werking van andere fysiologische substraten voor β - en γ-secretase5,6. Ten aanzien van de γ-secretase-remmers, hebben recente studies gerapporteerd de ontdekking van een aantal chemische en genetische modulatoren die Aβ productie regelen kan filtreerpapier te verwaarlozen effecten op de essentiële γ-secretase-gemedieerde verwerking van Inkeping7 ,8,9,10,11,12, echter succesvol therapeutics zijn nog niet ontwikkeld. Dus zijn verdere systematische schermen gerechtvaardigd om te ontdekken van nieuwe genetische en chemische parameters die selectief γ-secretase-gemedieerde APP verwerking moduleren kunnen.

Γ-Secretase is bekend dat het klieven van meer dan 90 verschillende membraan-verankerd eiwitten. Onder deze substraten is Notch, waarvan de activiteit is van cruciaal belang voor de cel lot vastberadenheid en differentiatie tijdens ontwikkeling13. Selectief modulerende γ-secretase-gekatalyseerde APP verwerking in de afwezigheid van invloed zijn op de inkeping verwerking essentieel voor minimaliseren Notch-gerelateerde bijwerkingen van γ-secretase-remmers, en deze selectiviteit wordt beschouwd als een primaire factor die zal dicteren van de biologische werkzaamheid van potentiële γ-secretase modulatoren voor de chronische behandeling van AD. Er zijn een aantal arylsulfonamide derivaten, zoals GSI-953 (begacestat) en BMS-708163 (avagacestat), die zijn gevonden om te exposeren krachtige en selectieve remming van de γ-secretase14,15. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de differentiële remming van de γ-secretase splitsing van APP en Notch kan worden waargenomen met behulp van een kwantitatieve ELISA gebaseerde bepaling in combinatie met in vivo validatie met behulp van de zebravis16. Bovendien zijn assay cel-gebaseerde paradigma's vastgesteld om aan te pakken van de potentiële substraat selectiviteit van γ-secretase naar APP en Notch17,18. Met behulp van protocollen vergelijkbaar met die beschreven hierin, we hebben onlangs ontdekt een nieuwe klasse van (D)-leucinamides die krachtig γ-secretase splitsing van APP met inkeping-sparend selectiviteit19 moduleren. Samen, biedt deze collectie van studies een bewijs-van-concept ter ondersteuning van het idee dat het substraat selectiviteit en beschikbaarheid van γ-secretase onderworpen aan chemische modulatie en experimentele verificatie worden kan. Echter, deze assay platformen vaak rekenen op relatief lage-doorvoer uitlezingen en arbeidsintensieve benaderingen die mogelijk niet voldoen aan industriële normen voor de drug discovery-programma's.

We hebben recentelijk gegenereerde cel-gebaseerde luciferase reporter gene assays die kwantitatief bepalend kunnen zijn voor de katalytische activiteit van γ-secretase naar twee verschillende substraten, de 99-amino acid C-terminal fragment van APP (APP-C99) en de extracellulaire domein-verwijderd Notch peptide (NΔE). Zowel de NΔE als de APP-C99 hebben wijd gebruikt als directe substraten voor γ-secretase in verschillende testen. Voor het genereren van homogene en consistente luciferase reporter gene assays voor de splitsing van de γ-secretase van APP-C99 of NΔE, we genereerden een HEK afkomstige stabiele cellijn (CG) die constitutively een Gal4 promotor gestuurde firefly luciferase verslaggever (uitdrukt Gal4-Luc) en Gal4/VP16-gelabeld APP-C99 fusieproteïne (C99-GV). Bovendien, we genereerden een ander HEK afkomstige stabiele cellijn (NG) die constitutively Gal4-Luc en Gal4/VP16-gelabeld NΔE (NΔE-GV uitdrukt). Met behulp van deze roman substraat-specifieke γ-secretase-tests, bieden we nu een methode om te kwantificeren en te onderscheiden van de katalytische activiteit van γ-secretase naar verschillende substraten (APP-C99 in CG cellen) of NΔE in NG cellen. Bovendien waren de substraat-specifieke γ-secretase-tests ontworpen om dat bevorderlijk is voor hoge-content screening platformen. Deze tests nieuw gegenereerde γ-secretase zou de weg vrij voor de ontdekking van nieuwe γ-secretase modulatoren, die zouden kunnen cognitieve functie verbeteren door het onderdrukken van Aβ productie zonder aanleiding kunnen geven tot ongewenste remming van de inkeping voor de behandeling van de volgende generatie van advertentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. meting van de Luciferase verslaggever signalen, die met de splitsing van de γ-Secretase van APP-C99 of NΔE corresponderen

Opmerking: Raadpleeg de eerdere publicaties voor meer gedetailleerde beschrijvingen van de generatie van CG en NG cellen20,21.

  1. Zaad NG of CG cellen (20, 000 cellen/well) op 96-Wells microplates op een eindvolume van 200 μl per putje in groeimedium dat is samengesteld uit Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM), vermeerderd met 10% foetale runderserum (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiotica (b.v. zeocin), en 200 μg/mL hygromycin B.
    1. Cellen tellen met een hemocytometer.
    2. De microplates overbrengen in een bevochtigde CO2 incubator en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
  2. Verwijder 100 μl van groeimedium uit elk putje.
  3. Voeg 100 μl per putje van groei medium met 2 μg/mL tetracycline met ofwel 0,2% dimethylsulfoxide (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) of andere gerelateerde ErbB1/ErbB2-remmers.
  4. Incubeer behandelde CG of NG cellen in microplates bij 37 ° C gedurende 24 uur.
  5. 150 μl per putje groeimedium uit de microplates verwijderen.
  6. Voeg 50 μl per putje luciferase assay reagens toe (Zie Tabel van materialen).
  7. De microplates overbrengen in een luminescentie microplate lezer.
    1. Het handhaven van de microplates bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met zachte agitatie.
  8. Bepalen van de Firefly luciferase (FL)-uitgestoten luminescentie met behulp van een vooraf gedefinieerde programma in de luminescentie microplate lezer zijn opgeslagen.
    1. Open de software van de controle van het instrument (Zie Tabel van materialen voor instrument details).
    2. Selecteer in het menu 'Tool', 'Luminometry'.
      1. Kies 'Geen filter' voor emissie Filter, teek 'normaal' voor emissie diafragma, voer '1' voor tellen keer onder de instellingen 'Parameters' en klik op 'OK' om de luminescentie lezing instellen.
    3. Onder het tabblad 'Instrument beheer' en blader door de lijst met actieve protocollen en selecteer het vooraf opgeslagen protocol voor het lezen van luminescentie.
    4. Onder het tabblad 'Live weergave' definiëren de omvang van de pull-down lijst en selecteer 'Logaritme' of 'Lineaire' voor het Type.
    5. Schakel onder het tabblad 'Temperatuur' 'Off' voor plaat Verwarming.
    6. Klik op de knop 'Start' voor het uitvoeren van de luminescentie lezen.
    7. Desgewenst resultaten exporteren in een werkbladindeling te zetten m.b.v. de 'Verkenner' ingebed in de besturingssoftware.

2. kwantificering van γ-Secretase activiteit

  1. Definieer een luminescentie signaal dat wordt uitgezonden door CG of NG cellen behandeld met 0,1% DMSO in groeimedium met 1 μg/mL tetracycline alleen als 100% relatieve γ-secretase activiteit.
    1. Schatting achtergrond luminescentie van CG of NG cellen door het behandelen van cellen met groeimedium dat niet de tetracycline omvat.
  2. Normaliseren luciferase signalen van CG of NG cellen die worden gekweekt met groeimedium dat 1 μg/mL tetracycline en beide 1 μM CL-387,785 of 1 μM van DAPT met het luciferase signaal uitgezonden door CG DMSO-behandeld of NG cellen (100% relatieve γ-secretase activiteit, als gedefinieerd in punt 2.1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Remming van ErbB2 door CL-387,785 kan de verwerking van APP-C99 door differentieel bevorderen Γ -secretase zonder Notch decollete
Om vast te stellen een cel-gebaseerde test die kwantitatief het Proteolytische splijten van een bijzonder γ-secretase substraat kan meten, we genereerden de HEK293 afkomstige CG cellijn door stabiele CO transfectie van een tetracycline-afleidbare C-terminaal Gal4/VP16-gelabeld APP-C99 en een Gal4 promotor ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De veelbelovende resultaten van een fase 1b trial van aducanumab immunotherapie voor AD de kritische rol van Aβ hebben verankerd in de pathogenese van AD22 en suggereren dat anti-Aβ benaderingen nog steeds een levensvatbare strategie voor de ontwikkeling van anti-van de AD geneesmiddelen. We beschrijven hier, cel-gebaseerde testen voor het kwantificeren van de γ-secretase-gekatalyseerde proteolyse van APP-C99 en NΔE met behulp van firefly luciferase verslaggever systemen. APP-C99 en NΔE zijn de tw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de faciliteit van de kern van het Instituut voor cellulaire en Organismic biologie, Academia Sinica, voor technische ondersteuning. Deze studie werd ondersteund door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan (meest 103-2320-B-001-016-MY3 aan Y.-F. L.), het programma voor translationeel innovatie van biofarmaceutische ontwikkeling-technologie ter ondersteuning van Platform as in Scheme (NP7 aan Y.-F.L.), en de Academia Sinica (aan Y.-F.L.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
VictorLight luminescentie plaatlezerPerkinElmer2030-0010
Klasse II, Type 2 Biologische VeiligheidscabinetThermo Scientific1300 Series A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher12100046belangrijkste component van groeimedium
Foetaal bovien serum (FBS)Thermo Fisher16000044
BlasticidinThermo FisherA1113903
ZeocinThermo FisherR25005
Hygromycin BGibco10687010
HemocytomerSigma-AldrichBR717805 Aldrich
96-wells microplaatNunc156545
TetracyclineSigmaT7660
Dimethyl sulfaat (DMSO)SigmaD2650
Steady-Glo luciferase assay reagensPromegaE2510
Bevochtigde CO2 incubatorRevcoUltima II
T-REx293 cellijnInvitrogenR71007
Wallac 1420 software versie 3.0PerkinElmerinstrument controle software van de luminescentie plaatlezer

Referenties

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gamma secretase assayMeting van APP splitsingNotch splitsingsanalyseLuciferase reportersysteemHEK293 celkweekCL 387 785 behandelingDAPT inhibitiestudieSubstraatselectiviteitsanalyseOnderzoek naar de ziekte van AlzheimerPlatform voor geneesmiddelenontwikkeling

Gerelateerde artikelen