Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Summary

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Abstract

Cel migratie is een verplicht onderdeel voor wondgenezing. Creëren van kunstmatige wonden op onderzoek diermodellen resulteert vaak in dure en ingewikkelde experimentele procedures, terwijl potentieel ontbreekt in precisie. In vitro cultuur van epitheliale cellijnen biedt een geschikt platform voor het onderzoeken van het trekgedrag van de cel in de wondgenezing en het effect van de behandelingen op deze cellen. De Fysiologie van epitheliale cellen is vaak bestudeerd in niet-heuvels voorwaarden; Deze benadering kan echter niet lijken op natuurlijke wond genezing voorwaarden. Verstoren van de epitheel integriteit door mechanische middelen genereert een realistisch model, maar de toepassing van moleculaire technieken kan belemmeren. Bijgevolg gebaseerd microscopie technieken zijn optimaal voor de studie van epitheliale cel migratie in vitro. Hier detail wij twee specifieke methoden, de kunstmatige wond kras assay en de voorste assay van kunstmatige migratie, die van kwantitatieve en kwalitatieve gegevens, respectievelijk op de trekkende prestaties van epitheliale cellen verkrijgen kan.

Introduction

Cel migratie is vereist voor wondgenezing, want het is verantwoordelijk voor de definitieve sluiting van de epitheliale kloof en herstel van de verstoorde oppervlakte¹. Uitvoeren van kunstmatige wonden in diermodellen zorgt voor de replicatie van dit complexe proces in in de buurt van fysiologische omstandigheden². Deze benadering leidt echter vaak dure en ingewikkelde experimentele procedures, die mogelijk gebrek aan precisie voor de studie van de verschillende processen, het ingewikkelde karakter van de wondgenezing proces.

In vitro cultuur van epitheliale cellijnen biedt een nuttig....

Protocol

1. kunstmatige wond kras Assay voor kwantitatief onderzoek

1. Cel enkelgelaagde voorbereiding
   1. Werken onder steriele condities, zaad en groeien van Mv1Lu of HaCaT epitheliale cellen in cultuur kolven via serum-aangevuld. Vernieuwen medium eenmaal elke 24-48 h. Nadat cellen 80% samenvloeiing bereiken, loskoppelen met behulp van een geschikte methode, d.w.z., trypsinebehandeling⁹cellen.
      Opmerking: Mv1Lu HaCaT epitheliale cellijnen worden gekweekt met behulp van EMEM en DEMEM kweekmedium, respectievelijk, aangevuld met 2 mM L-Glutamine en geïncubeerd bij 37 ° C met een gecontroleerde atmosfeer van 5....

Results

Kunstmatige wond kras Assay voor kwantitatieve Studies: epidermale groeifactor (EGF) bevordering van migratie beoordelen:

EFG is een bekende inductor van epitheliale cellen proliferatie en migratie, en dus een positieve controle voor het kwantificeren van de bevordering van de migratie. Mv1Lu en HaCaT cel monolayers werden gebruikt in de wond kras testen en voorbehandeling beelden werden verkregen. Na inoculatie met 10 ng/mL EGF, c.......

Discussion

Op de huid of slijmvlies verstoring, is barrièrefunctie hersteld door de acties van talrijke celtypen, met inbegrip van fibroblasten of epitheliale en immuun cellen. Gezamenlijk, deze cellen ondergaan een complex proces waarbij apoptosis, proliferatie, differentiatie en bovenal fibroblast en epitheliale cel migratie, die het ultieme mechanisme verantwoordelijk voor herstel van de verstoorde weefsel is en de sluiting van de oppervlakkige epitheliale kloof^1,12 aldu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Optional 10 % FBS supplement
L-Glutamine	Lonza	BE17-605E	Use at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	Dilute as appropriate
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	Dilute to 1x
24-well culture plates	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6-well culture plates	SARSTEDT	83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	Used 10 ng/mL
Round cover glass	MENZEL-GLÄSER	MENZCB00120RA020	SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743	Martor (through VWR)	MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tips	VWR	732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tips	VWR	732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscope	Motic Spain	Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscope	ZEISS Microimaging, Germany	LSM 510 META
10 cm Culture dish	BD FALCON	353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488	Invitrogen	A11008	Used 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)	Invitrogen	A12381	Used 1:100
Bovine Serum Albumin	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
Skim milk	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, USA	Release 1.50i
Zen LSM 510 image processing software	ZEISS Microimaging, Germany	Release 5.0 SP 1.1