Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56799

⸱

2 januari 2018

 ,  ,  , 
1Laboratorio de Oncología Molecular y TGF-β, IMIB-Arrixaca, 2Departamento de Enfermería, Facultad Enfermería, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Samenvatting

Cel migratie is een verplicht onderdeel voor wondgenezing. Creëren van kunstmatige wonden op onderzoek diermodellen resulteert vaak in dure en ingewikkelde experimentele procedures, terwijl potentieel ontbreekt in precisie. In vitro cultuur van epitheliale cellijnen biedt een geschikt platform voor het onderzoeken van het trekgedrag van de cel in de wondgenezing en het effect van de behandelingen op deze cellen. De Fysiologie van epitheliale cellen is vaak bestudeerd in niet-heuvels voorwaarden; Deze benadering kan echter niet lijken op natuurlijke wond genezing voorwaarden. Verstoren van de epitheel integriteit door mechanische middelen genereert een realistisch model, maar de toepassing van moleculaire technieken kan belemmeren. Bijgevolg gebaseerd microscopie technieken zijn optimaal voor de studie van epitheliale cel migratie in vitro. Hier detail wij twee specifieke methoden, de kunstmatige wond kras assay en de voorste assay van kunstmatige migratie, die van kwantitatieve en kwalitatieve gegevens, respectievelijk op de trekkende prestaties van epitheliale cellen verkrijgen kan.

Inleiding

Cel migratie is vereist voor wondgenezing, want het is verantwoordelijk voor de definitieve sluiting van de epitheliale kloof en herstel van de verstoorde oppervlakte1. Uitvoeren van kunstmatige wonden in diermodellen zorgt voor de replicatie van dit complexe proces in in de buurt van fysiologische omstandigheden2. Deze benadering leidt echter vaak dure en ingewikkelde experimentele procedures, die mogelijk gebrek aan precisie voor de studie van de verschillende processen, het ingewikkelde karakter van de wondgenezing proces.

In vitro cultuur van epitheliale cellijnen biedt een nuttig alternatief voor dierlijke modellen voor het onderzoeken van de rol die deze cellen bij wondgenezing en de effecten van behandeling op cel trekgedrag spelen. De Fysiologie van epitheliale cellen wordt vaak bestudeerd door moleculaire technieken met behulp van niet-heuvels culturen3,4,5,6; echter, de verstoring van de integriteit van het epitheel wordt gewoonlijk bereikt door fijne mechanische insnijdingen. In de cultuur van de cel impliceert dit dat te verwaarlozen aantal cellen kan worden blootgesteld aan de wond kloof, en zij een te kleine steekproef voor moleculaire biologietechnieken vertegenwoordigen. Echter, deze letsels kunnen worden bestudeerd op de microscopische schaal, profiteren van de aangeboren trekkende eigenschappen van sommige epitheliale cellijnen, zoals de Mink Lung epitheliale cel (Mv1Lu) of de spontaan vereeuwigd menselijke Keratinocyt (HaCaT) lijnen.

We beschreven hier een methode voor microscopie die geschikt is voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de migratie van epitheliale cellen in het kader van de wond genezing van3,4,7,8. Bovendien presenteren we extra methoden die zijn nuttig om te studeren kwalitatief moleculaire en morfologische veranderingen op epitheliale monolayers tijdens de migratie. Over het geheel genomen is deze methoden bieden een kader om te studeren zowel de dynamiek en de morfologische veranderingen die betrokken zijn bij de epitheliale cellen gedrag en reactie op de behandelingen tijdens de wondgenezing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. kunstmatige wond kras Assay voor kwantitatief onderzoek

  1. Cel enkelgelaagde voorbereiding
    1. Werken onder steriele condities, zaad en groeien van Mv1Lu of HaCaT epitheliale cellen in cultuur kolven via serum-aangevuld. Vernieuwen medium eenmaal elke 24-48 h. Nadat cellen 80% samenvloeiing bereiken, loskoppelen met behulp van een geschikte methode, d.w.z., trypsinebehandeling9cellen.
      Opmerking: Mv1Lu HaCaT epitheliale cellijnen worden gekweekt met behulp van EMEM en DEMEM kweekmedium, respectievelijk, aangevuld met 2 mM L-Glutamine en geïncubeerd bij 37 ° C met een gecontroleerde atmosfeer van 5% CO2. Elke cel regel moet grondig worden bepaald om na te gaan van concentratie van de cel en timing vereist volledige confluentie bereiken. Typisch voor Mv1Lu of HaCaT cellen, 2-4 x 104 of 4-6 x 104 cellen/well, respectievelijk, zijn overgeënt in een maatkolf van 175 cm2 cultuur, en 80% samenvloeiing levert maximaal 35 x 106 Mv1Lu of 1 x 107 HaCaT cellen.
    2. In een 12-well of 24-well cultuur-plaat, zaad in elk putje 2 mL van cellen. Vernieuwen medium zodra elke 24-48 h. Controleer cel nummers zijn hoog genoeg om het bereiken van de samenvloeiing van de 100% na 2 of 3 dagen.
    3. Nadat de cellen samenvloeiing bereiken, verwijdert u het medium serum-aangevuld en wassen tweemaal met verse serumvrij medium. Houd cellen in serumvrij medium voor 24u alvorens het krassen.
      Opmerking: Mv1Lu of HaCaT cellen hebben geen speciale substraat eisen; echter voor cellijnen vatbaar voor spontaan losmaken in serumvrij voorwaarden, moet pre coating van de cultuur plaat oppervlakte met behulp van een poly-L-lysine oplossing worden beschouwd10.
  2. Enkelgelaagde krabben
    1. Werken in een steriele omgeving, krassen op de cultuur enkelgelaagde door stevig te slepen het smalle einde van een 20 µL of 200 µL steriele micropipet tip, afhankelijk van de gewenste breedte van kras. Houd de tip loodrecht op het oppervlak van de cultuur te maximaliseren van de homogeniteit van de kloof.
      1. Plaats de platen van de cultuur op een donker oppervlak duidelijk volgen de cel enkelgelaagde. Indien nodig, de twee loodrecht krassen (kruisvormig) op elk putje te bestuderen tot 4 migratie gebieden uitvoeren.
    2. Wassen vrijstaande cellen door cultuurmedium en zachtjes toe te voegen verse serumvrij medium voorzichtig te verwijderen. Herhaal dit twee keer, of totdat de meest niet-vastgemaakte cellen zijn verwijderd.
  3. Experimentele procedure en gegevensverzameling
    1. Neem maximaal 4 voorbehandeling referentie afbeeldingen gecentreerd op de kras kloof van elk goed met een omgekeerde fase contrast Microscoop met een CCD-camera. Selecteer interesse gebieden door het uitlijnen van de rand van Microscoop veld op het aangrenzende snijpunt van krassen.
      Opmerking: Doorgaans afbeeldingen zijn verworven met behulp van een 10 x vergroting en een 1280 x 1024 pixelgrootte van de afbeelding. Interesse gebieden zoals eerder beschreven helpt voor gemakkelijk lokalisatie en validatie van maximaal 4 metingen per putje te selecteren.
    2. Zodra alle afbeeldingen zijn opgedaan, wijzen behandeling putten; het medium in de putjes met verse medium waarin geselecteerde behandelingen uit te wisselen.
      Opmerking: Als alternatief voor chemische stoffen of verbindingen die niet kweekmedium homogeniteit storen, behandelingen kunnen worden geënt rechtstreeks in het kweekmedium.
    3. Incubeer de gekraste plaat (37 ° C met een gecontroleerde atmosfeer met 5% CO2) tot de voorwaarden onder observatie reach 90% kras kloof sluiting. Vermijd volledige sluiting.
      Opmerking: Totale kloof sluiting huwelijksleven nabehandeling fotoverzameling als referentiegebieden niet waarneembaar zijn en de referentieperiode voor kloof sluiten kan niet worden vastgesteld. In het geval van Mv1Lu of HaCaT cellen, zijn 16-19 h vereist voor het bereiken van de samenvloeiing van de 90%.
    4. Cel migratie te stoppen door de vaststelling van de cellen; Vervang het experimentele kweekmedium zachtjes met 1 mL 4% formaline in PBS. Incubeer gedurende 15 minuten op RT.
    5. Wassen van de cellen om te verwijderen van de overtollige formaline; zachtjes vervangen de oplossing in de putjes met verse PBS. Minstens twee maal herhalen.
      Opmerking: In dit stadium, na verzegeling, platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor onbepaalde tijd.
    6. Neem nabehandeling referentie beelden van elk putje van de oorspronkelijke referentiegebieden captured na het krassen. Gebruik de dezelfde apparatuur (omgekeerde optische fase contrast Microscoop met een CCD-camera) en de overeenkomende beeldinstellingen (vergroting en digitale resolutie/dichtheid).
      Opmerking: Voor cellen die individueel migreren en de leemte onafhankelijk van de vorming van een coherent front (b.v., MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen), het tijdsverloop afbeeldingen kunnen toestaan dat de berekening van de individuele cel migratie snelheden.
  4. Beeldanalyse en kwantificering van migratie
    1. Met behulp van beeld processing software (bijvoorbeeldImageJ), kras kloof grenzen definiëren en bepalen van het oppervlak van de kloof voor maximaal vier metingen in voorbehandeling beelden. Opnemen van de gegevens als "voorbehandeling kloof oppervlak" (als). Herhaal dezelfde procedure voor nabehandeling foto's. Opnemen van de gegevens als "nabehandeling kloof oppervlak" (POSTGAP).
      1. Open het opgenomen beeld met behulp van ImageJ. Stel in het menu "beeld" afbeeldingstype op 8 bit. In het "proces"-menu, ga naar "filters" submenu en toepassing "variance" filteren.
      2. Voer in het menu "beeld" "aanpassen" submenu en ingestelde drempel naar zwart-wit (B & W), Controleer of "Donkere achtergrond" niet is geselecteerd. In het "proces"-menu, ga naar "binaire" submenu en selecteer "Vul gaten".
      3. In het menu "analyseren", selecteer "set metingen" en Activeer "ruimte". Vervolgens tekent u de meetbare ruimte na de migratie rand contour dus het afbakenen van de kloof.
      4. In het menu "analyseren", selecteer "analyseren deeltjes" en "totale oppervlakte" waarden voor de oppervlakte van het getekende gebied opnemen.
    2. Voeren als en POSTGAP totale oppervlakte waarden in een werkblad te kwantificeren van absolute migratie voor elke set van afzonderlijke monsters als het verschil van kloof oppervlak metingen: als − POSTGAP [willekeurige eenheden]. Bovendien, normaliseren absolute migratiegegevens van elke voorwaarde aan controlemonsters: (proeven / CONTROL) * 100 [%].
      Opmerking: Voor cellen die individueel migreren en de leemte onafhankelijk van de vorming van een coherent front (b.v., MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen), de absolute migratie kan worden berekend door het tellen van cellen die een centrale invasie in strip het besturingselement of de behandelde monsters.
    3. Plot kwantificering uitgangen (Zie Figuur 1). Statistische analyse uitvoeren indien nodig.
Overwegen van de Student t-test bij het vergelijken van twee voorwaarden of variantie-analyse test voor groter aantal voorwaarden.

2. kunstmatige migratie Front Assay voor topografische onderzoeken

  1. Cel enkelgelaagde voorbereiding
    1. Werken onder steriele omstandigheden plaats één laag van gesteriliseerde ronde coverslips in lege cultuur platen tot de plaat het oppervlak volledig bedekt is.
      Opmerking: Maximaal 12 en 33 coverslips passen op 5 cm en 10 cm diameter platen, respectievelijk.
    2. Op de plaat van de cultuur, zaad voorzichtig een voldoende volume van cellen bij een concentratie waarmee 100% samenvloeiing na 2 of 3 dagen. Zorg ervoor dat geen dekglaasje aan overlapt naburige coverslips en verhinderen dat coverslips zweven door zachte druk met een steriel micropipet tip toe te passen. Vernieuw het medium elke 24-48 h.
      Opmerking: Elke cel regel moet grondig vehiculumcontrolegroep worden om na te gaan van concentratie van de cel en timing vereist volledige confluentie bereiken. Typisch voor Mv1Lu of HaCaT cellen, zijn 2-3 x 106 of 2.5-4 x 106 cellen/10 cm-diameter plaat, respectievelijk, overgeënt. Voor kleinere platen, moet cel nummers worden teruggeschroefd.
    3. Nadat de cellen samenvloeiing bereiken, verwijdert u het medium serum-aangevuld en vervangen door verse serumvrij medium. Houd de cellen in serumvrij medium voor 24 uur voordat de kunstmatige wond wordt uitgevoerd.
      Opmerking: Mv1Lu of HaCaT cellen hebben geen speciale substraat eisen; echter voor cellijnen vatbaar voor spontaan losmaken in serumvrij voorwaarden, moet pre coating van het oppervlak van de cultuur met behulp van een poly-L-lysine oplossing worden beschouwd10.
  2. Enkelgelaagde verwonden
    1. Zachtjes een dekglaasje aan naar een schone 10 cm plaat met verse serumvrij medium met steriel pincet, verplaatsen. Te voorkomen beschadiging van de enkelgelaagde door het dekglaasje aan op de periferie met een pincet. Vermijd overmatige druk die zou kunnen leiden een dekglaasje aan breuk tot.
    2. Het maken van kunstmatige wonden door een gesteriliseerde scheermesje in een dwarse lijn over het midden van het coverslips te slepen. 3-4 mm heen-en-weer, sleep om de centrale enkelgelaagde strip volledig te verwijderen. Zorg ervoor dat geen cel puin blijft verbonden aan de gewonde randen.
      Opmerking: op een diameter van 12 mm ronde dekglaasje aan, de incisie wordt gemaakt op het midden van het dekglaasje aan. Zorg ervoor om te vertrekken een streak van cellen tegenover het hoofdfront groot genoeg is (ten minste 2 mm breed) om te voorkomen dat het kantelen van het dekglaasje aan in de volgende stappen.
    3. Gewonde coverslips Pipetteer met behulp van cellen naar boven, naar een schone 6-well plaat met ten minste 2 mL verse serumvrij medium. Maximaal 4 gewonde coverslips/goed passen.
    4. Voorzichtig wassen twee keer met verse serumvrij middellange tot vrijstaande cellen verwijderen.
  3. Experimentele procedure en bemonstering
    1. Zachtjes het medium in de putjes met verse medium waarin geselecteerde behandelingen uit te wisselen.
      Opmerking: Als alternatief voor chemische stoffen of verbindingen die niet kweekmedium homogeniteit storen, behandelingen kunnen worden geënt rechtstreeks in het kweekmedium. Behoedzaam om te voorkomen dat elke potentiële mobiele-detachement.
    2. Houd de plaat binnen een cel incubator (37 ° C, 5% CO2) voor de gewenste experimentele timing.
    3. Cel migratie te stoppen door de vaststelling van de cellen; Vervang het experimentele kweekmedium zachtjes met 1 mL 4% formaline in PBS. Incubeer gedurende 15 minuten op RT.
      Opmerking: Voor tijd cursus experimenten, de monsters uit de cultuur-plaat verwijderen en corrigeren in een afzonderlijke plaat om te voorkomen dat formaline dampen op het gebied van de andere, lopende experimentele omstandigheden.
    4. Wassen van de cellen om te verwijderen van de overtollige formaline; zachtjes vervangen de oplossing in de putjes met verse PBS. Minstens twee maal herhalen.
      Opmerking: In dit stadium, na verzegeling, platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor onbepaalde tijd.
  4. Immunofluorescentie (IF) en topologische analyse
    1. Uitvoeren als kleuring en beeldvorming op individuele coverslips als elders beschreven3,4,11.
      1. Permeabilize voor 10 min door coverslips in een oplossing van de Triton X-100 0,3% in PBS onder te dompelen.
      2. Blok voor 30 min met behulp van de volgende blokkerende oplossing: 0,3% bovien serumalbumine; De foetale runderserum 10%; 5% afgeroomde melk; 0,3% Triton X-100 oplossing in PBS.
        Opmerking: Het blokkeren van oplossing zonder melk kan worden voorbereid en opgeslagen bij-20 ° C.
      3. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een vochtige kamer, met primair antilichaam verdund in melkvrije blokkerende oplossing. Plaats de coverslips ondersteboven in de 15 µL antilichaam oplossing om goede verdeling.
        Opmerking: De werkverdunning antilichaam is variabel en hangt af van het antilichaam in gebruik. Bijvoorbeeld, vereist het antilichaam van de anti-c-Jun konijn een verdunning van 1/100.
      4. Spoel driemaal door dompelen de coverslips in een in 0,1% Triton X-100 oplossing in PBS.
      5. Incubeer de coverslips in secundair antilichaam verdund in melkvrije blokkeerbuffer gedurende 30 minuten.
        Opmerking: De werkverdunning antilichaam is variabel en hangt af van het antilichaam in gebruik. Bijvoorbeeld, vereist de geit-anti-konijn (488) een verdunning van 1/400 voor een optimale resolutie. Andere labeling reagentia zoals phalloidin en Hoechst 33258 kunnen worden toegevoegd aan de incubatie-buffer in dit stadium.
      6. Spoel driemaal door dompelen de coverslips in 0,1% Triton X-100 oplossing in PBS.
      7. Monteer de coverslips upside-down in een 10 µL montage media drop (bvVectashield) geplaatst op een microscoopglaasje. Laat de dia's in het donker bij kamertemperatuur 's nachts voor de montage middellange verharding. Daarna, voor onbepaalde tijd bewaren bij 4 ° C in het donker.
    2. Het verkrijgen van epifluorescence of confocale microscopie beelden van structurele veranderingen die zich voordoen bij het migreren van de voorste rand.
      Opmerking: Topologische onderzoek kunnen worden verricht door de foto's van de migreren voorzijde naar de innerlijke Enkelgelaagde tegels. Semi-kwantitatieve studies zijn mogelijk door analyse van de software gebaseerd op lokale fluorescentie intensiteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Kunstmatige wond kras Assay voor kwantitatieve Studies: epidermale groeifactor (EGF) bevordering van migratie beoordelen:

EFG is een bekende inductor van epitheliale cellen proliferatie en migratie, en dus een positieve controle voor het kwantificeren van de bevordering van de migratie. Mv1Lu en HaCaT cel monolayers werden gebruikt in de wond kras testen en voorbehandeling beelden werden verkregen. Na inoculatie met 10 ng/mL EGF, c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Op de huid of slijmvlies verstoring, is barrièrefunctie hersteld door de acties van talrijke celtypen, met inbegrip van fibroblasten of epitheliale en immuun cellen. Gezamenlijk, deze cellen ondergaan een complex proces waarbij apoptosis, proliferatie, differentiatie en bovenal fibroblast en epitheliale cel migratie, die het ultieme mechanisme verantwoordelijk voor herstel van de verstoorde weefsel is en de sluiting van de oppervlakkige epitheliale kloof1,12 aldu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen conflict van belang is.

Dankbetuigingen

Wij willen geven dankzij de oudere leden van de lab die helpen te verbeteren en verfijnen van deze technieken om de feitelijke toestand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada en Dr. Antonia Alcaraz-García. We zijn dank verschuldigd aan het ziekenhuis klinisch Universitario Virgen de la Arrixaca voor zijn krachtige steun van de ontwikkeling van deze technieken. Ook het Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal ik + D + ik en Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (Grant nr.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". Wij danken ook Universidad de Murcia en IMIB-Arrixaca FFIS voor administratieve ondersteuning en bijstand. Tot slot willen we een speciale dank aan Dr. Isabel Martínez-Argudo en de Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus autonoom de la Fábrica de Armas, Universidad Castilla la Mancha, Toledo voor hun vriendelijke ondersteuning in gewillig cederende geven de Biogeneeskunde en biotechnologie laboratorium mogelijk te maken het gefilmde deel van dit document.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FrankrijkL0102-500Optioneel 10% FBS-supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)LonzaBE12 -662FOptioneel 10% FBS-supplement
L-GlutamineLonzaBE17-605EGebruik op 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USADE17603A
Trypsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT4049Verdun passend
Poly-L-LysineSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)Gibco by Life Technologies14200-067Verdun tot 1x
24-well culture platesBD FALCON//SARSTED734-0020
6-well culture platesSARSTEDT83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAE9644Gebruikt 10 ng/mL
Rond coverglasMENZEL-GLÄSERMENZCB00120RA020KORTE DIEPTE VAN HET VEL
Versterkte scheermesje nr. 743Martor (door VWR)MARO743.50
200 µl steriele aerosolpipettipsVWR732-0541
20 µl steriele aerosolpipettipsVWR732-0528
Digitaal camera gekoppeld fasecontrastmicroscoopMotic SpainMoticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocale microscoopZEISS Microimaging, DuitslandLSM 510 META
10 cm CultuurschaalBD FALCON353003
Konijn polyklonaal anti c-Jun antilichaamSanta Cruz Biotechnologysc-1694Gebruikt 1:100
Anti-konijn IgG (polyklonaal geit ) AF 488InvitrogenA11008Gebruikt 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA14530Gebruikt 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (rood)InvitrogenA12381Gebruikt 1:100
Bovine Serum AlbumineSanta Cruz BiotechnologySC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT9284
Skim melkBD DIFCO232100
ImageJNational Institutes of Health, USARelease 1.50i
Zen LSM 510 beeldverwerkingssoftwareZEISS Microimaging, DuitslandRelease 5.0 SP 1.1

Referenties

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
  3. Alcaraz, A., et al. Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds. PLoS One. 10 (8), e0135324(2015).
  4. Ruiz-Canada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
  5. Schmierer, B., Hill, C. S. TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).
  6. Hu, Y. L., et al. FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells. Sci Rep. 4, 6024(2014).
  7. Martinez-Mora, C., et al. Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun. PloS one. 7 (7), e42271(2012).
  8. Bernabe-Garcia, A., et al. Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation. PLoS One. 12 (2), e0172574(2017).
  9. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 17, 36(2010).
  10. Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior. PLoS One. 9 (11), e112122(2014).
  11. Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus. Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).
  12. Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).
  13. Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it? Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).
  14. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  15. Insausti, C. L., et al. Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds. Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).
  16. Wu, F., et al. Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells. Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).
  17. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  18. Marshall, J. Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).
  19. Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
  20. Szybalski, W., Iyer, V. N. Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics. Fed Proc. 23, 946-957 (1964).
  21. Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).
  22. Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption. Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).
  23. Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).
  24. Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Wondgenezingsassaykunstmatige wondkrasmigratiefrontassayfasecontrastmicroscopiefluorescentiemicroscopiebeeldbewerkingssoftwarevariantiefilteringdrempelwaardeaanpassinggaten vullen
Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.