Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden

Summary

Inzicht in de invloed van milieuorganochloorbestrijdingsmiddelen (OCPs) op de mitochondriale functie bij hepatocyten is belangrijk bij het verkennen van het mechanisme van OCPs die stofwisselingsstoornissen veroorzaken. Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie.

Abstract

Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie voor een beter begrip van de oorzaak van metabole aandoeningen veroorzaakt door milieuorganochloor pesticiden (OCPs) in hepatocyten. HepG2-cellen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan β-hexachloormohexaan (β-HCH) bij een equivalente dosis interne blootstelling in de algemene populatie. Ultrastructuur in hepatocyten werd onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) om de schade van mitochondriën aan te tonen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentieintensiteit, adenosine 5'-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP) in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. De mitochondriën fluorescentie intensiteit na gekleurd door mitochondriale groene fluorescerende sonde werd waargenomen met een fluorescentie microscopie. De luciferin-luciferase reactie werd gebruikt om atp niveaus te bepalen. De MMP werd gedetecteerd door de kationische kleurstof JC-1 en geanalyseerd onder stroom cytometrie. OCR werd gemeten met een extracellulaire flux analyzer. Samengevat, deze protocollen werden gebruikt bij het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten met mitochondriën schade te onderzoeken.

Introduction

De effecten van organochloorbestrijdingsmiddelen (OCP's) op de gezondheid, zoals reproductieve interferentie, immunologische toxiciteit, metabolische veranderingen zijn eerder onderzocht^1,2,3. De methoden om cellulaire metabolisme te detecteren en erachter te komen mitochondriale disfunctie hebben wetenschappers in staat gesteld om de rol van mitochondriale functie te begrijpen (d.w.z., mitochondriale STAT3-niveaus, lactaat, pyruvaat, lactaat-naar-pyruvaatverhouding, co-enzym Q10, mitochondriaal protonlek, bio-energetiek, biogenese en dynamica) op gebieden z....

Protocol

Alle experimenten en de experimentprotocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften en goedgekeurd door de lokale Ethische Commissie van de Nanjing Medical University.

1. Mitochondriale ultrastructuur door TEM

1. Het verzamelen van HepG2 cellen
   1. Seed HepG2 cellen in 100 mm gerechten. Bewaar bij 37 °C en 5% CO₂.
   2. Verteren cellen met 0,25% EDTA in 1,5 mLEP buis.
   3. Centrifuge op 1000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg.
   4. Verzamel 4-6 x 10⁵ HepG2 cellen.
2. Voeg 1 mL gluta....

Results

De mitochondriën cristae van HepG2 cellen blootgesteld aan β-HCH werden aanzienlijk beschadigd. Verspreide mitochondriën waren licht tot duidelijk uitgebreid, onregelmatig gevormd, en mitochondriale nok verdwenen met relatief abnormale mitochondriale architectuur (Figuur 1).

De gemiddelde mitochondriale groene fluorescentieintensiteit, die de mitochondriën vertegenwoordigt, daalde in HepG2-cellen di.......

Discussion

Cruciaal voor het succes van het detectieprotocol is het gebruik van een verscheidenheid aan experimentele methoden die zijn behandeld de studie van fenotype tot mechanisme. In deze studie werden HepG2-cellen gekweekt in DMEM met penicilline en streptomycine en 10% foetaal runderserum. Wanneer cellen 40-50% samenvloeiing bereikten, werden β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) toegevoegd en voor 24 uur geïncubeerd. We gebruikten eerst TEM die de ultrastructurele veranderingen in hepatocyte toonde veroorzaakt door de representatieve OC.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	700B	The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027	Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode reader be used to detect protein consentration.