Inzicht in de invloed van milieuorganochloorbestrijdingsmiddelen (OCPs) op de mitochondriale functie bij hepatocyten is belangrijk bij het verkennen van het mechanisme van OCPs die stofwisselingsstoornissen veroorzaken. Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie voor een beter begrip van de oorzaak van metabole aandoeningen veroorzaakt door milieuorganochloor pesticiden (OCPs) in hepatocyten. HepG2-cellen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan β-hexachloormohexaan (β-HCH) bij een equivalente dosis interne blootstelling in de algemene populatie. Ultrastructuur in hepatocyten werd onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) om de schade van mitochondriën aan te tonen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentieintensiteit, adenosine 5'-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP) in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. De mitochondriën fluorescentie intensiteit na gekleurd door mitochondriale groene fluorescerende sonde werd waargenomen met een fluorescentie microscopie. De luciferin-luciferase reactie werd gebruikt om atp niveaus te bepalen. De MMP werd gedetecteerd door de kationische kleurstof JC-1 en geanalyseerd onder stroom cytometrie. OCR werd gemeten met een extracellulaire flux analyzer. Samengevat, deze protocollen werden gebruikt bij het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten met mitochondriën schade te onderzoeken.
Inleiding
De effecten van organochloorbestrijdingsmiddelen (OCP's) op de gezondheid, zoals reproductieve interferentie, immunologische toxiciteit, metabolische veranderingen zijn eerder onderzocht1,2,3. De methoden om cellulaire metabolisme te detecteren en erachter te komen mitochondriale disfunctie hebben wetenschappers in staat gesteld om de rol van mitochondriale functie te begrijpen (d.w.z., mitochondriale STAT3-niveaus, lactaat, pyruvaat, lactaat-naar-pyruvaatverhouding, co-enzym Q10, mitochondriaal protonlek, bio-energetiek, biogenese en dynamica) op gebieden z....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten en de experimentprotocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften en goedgekeurd door de lokale Ethische Commissie van de Nanjing Medical University.
1. Mitochondriale ultrastructuur door TEM
- Het verzamelen van HepG2 cellen
- Seed HepG2 cellen in 100 mm gerechten. Bewaar bij 37 °C en 5% CO2.
- Verteren cellen met 0,25% EDTA in 1,5 mLEP buis.
- Centrifuge op 1000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg.
- Verzamel 4-6 x 105 HepG2 cellen.
- Voeg 1 mL gluta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De mitochondriën cristae van HepG2 cellen blootgesteld aan β-HCH werden aanzienlijk beschadigd. Verspreide mitochondriën waren licht tot duidelijk uitgebreid, onregelmatig gevormd, en mitochondriale nok verdwenen met relatief abnormale mitochondriale architectuur (Figuur 1).
De gemiddelde mitochondriale groene fluorescentieintensiteit, die de mitochondriën vertegenwoordigt, daalde in HepG2-cellen di.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Cruciaal voor het succes van het detectieprotocol is het gebruik van een verscheidenheid aan experimentele methoden die zijn behandeld de studie van fenotype tot mechanisme. In deze studie werden HepG2-cellen gekweekt in DMEM met penicilline en streptomycine en 10% foetaal runderserum. Wanneer cellen 40-50% samenvloeiing bereikten, werden β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) toegevoegd en voor 24 uur geïncubeerd. We gebruikten eerst TEM die de ultrastructurele veranderingen in hepatocyte toonde veroorzaakt door de representatieve OC.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81573174, 81570574); het Uitstaande Jeugdfonds van de provincie Jiangsu (SBK2014010296); het onderzoeksproject van het Chinese ministerie van Onderwijs (213015A); de Priority Academic Program Development van Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), het vlaggenschip van de belangrijkste ontwikkeling van jiangsu instellingen voor hoger onderwijs; en het Open Project Program van het State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology (KF2015-01).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Transmissie-elektronenmicroscoop | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | Hoge contrast, hoge resolutie beeldvorming, Observatie en beeldvorming met lage dosis, Observatie bij lage temperatuur, Uitstekende analytische prestaties, Automatisering voor gemak en prestaties |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is een mitochondriale groen fluorescerende sonde die kan worden gebruikt voor mitochondriële specifieke fluorescente kleuring van levende cellen. |
| Laser scanning confocale microscoop | Zeiss | 700B | Het ontwerp is compact, stabiel, de lichtbaan is de kortste, hoge lichtprecisie, creatieve technologie en geavanceerde scantechnologie samen om een perfect 3-dimensionaal monsterbeeld te produceren. |
| Verbeterde ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | De verbeterde ATP Assay Kit kan worden gebruikt om ATP (adenosine 5'-trifosfaat) niveaus in gangbare oplossingen, cellen of weefsels te detecteren. Cellen en weefselmonsters kunnen worden verdeeld om de monstervoorbereiding te voltooien, detectiegevoeligheid tot 0,1 nmol / L, chemiluminescentie kan gedurende 30 minuten worden onderhouden. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Een luminometer is een chemiluminescentie detector, het testmonster zelf kan licht zijn, geen stimulatie nodig. Een luminometer is het instrument dat chemiluminescentie detecteert. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is een van de meest gebruikte methoden voor het detecteren van eiwitconcentraties. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader kan worden gebruikt om eiwitconcentratie te detecteren. |
Referenties
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79(2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
