Experimenteel protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in Hepatocyten Blootgesteld aan Organochloor pesticiden

Summary

Inzicht in de invloed van milieuorganochloorbestrijdingsmiddelen (OCPs) op de mitochondriale functie bij hepatocyten is belangrijk bij het verkennen van het mechanisme van OCPs die stofwisselingsstoornissen veroorzaken. Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie.

Abstract

Dit document presenteert gedetailleerde methoden voor het opsporen van levermitaire functie voor een beter begrip van de oorzaak van metabole aandoeningen veroorzaakt door milieuorganochloor pesticiden (OCPs) in hepatocyten. HepG2-cellen werden gedurende 24 uur blootgesteld aan β-hexachloormohexaan (β-HCH) bij een equivalente dosis interne blootstelling in de algemene populatie. Ultrastructuur in hepatocyten werd onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) om de schade van mitochondriën aan te tonen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentieintensiteit, adenosine 5'-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP) in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. De mitochondriën fluorescentie intensiteit na gekleurd door mitochondriale groene fluorescerende sonde werd waargenomen met een fluorescentie microscopie. De luciferin-luciferase reactie werd gebruikt om atp niveaus te bepalen. De MMP werd gedetecteerd door de kationische kleurstof JC-1 en geanalyseerd onder stroom cytometrie. OCR werd gemeten met een extracellulaire flux analyzer. Samengevat, deze protocollen werden gebruikt bij het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten met mitochondriën schade te onderzoeken.

Introduction

De effecten van organochloorbestrijdingsmiddelen (OCP's) op de gezondheid, zoals reproductieve interferentie, immunologische toxiciteit, metabolische veranderingen zijn eerder onderzocht^1,2,3. De methoden om cellulaire metabolisme te detecteren en erachter te komen mitochondriale disfunctie hebben wetenschappers in staat gesteld om de rol van mitochondriale functie te begrijpen (d.w.z., mitochondriale STAT3-niveaus, lactaat, pyruvaat, lactaat-naar-pyruvaatverhouding, co-enzym Q10, mitochondriaal protonlek, bio-energetiek, biogenese en dynamica) op gebieden zoals veroudering, obesitas, diabetes, cardiovasculaire functie, kanker en veiligheidstoxiciteit^4,,5,,6,7. In dit artikel beschrijven we de methoden voor het beoordelen van mitochondriale disfunctie veroorzaakt door OCPs.

We stelden HepG2-cellen bloot aan β-hexachloormohexaan (β-HCH), een representatieve OCP's, voor 24 uur bij een dosis die gelijk is aan interne blootstelling van de mens. Ten eerste werd TEM toegepast om de ultrastructuur van hepatocyten te observeren, zoals kernen, mitochondriën en endoplasmatisch reticulum⁸. Vergeleken met gewone microscopen maakt TEM het mogelijk om de 2D en 3D ultrastructuur van cellen en celcomponenten (cellijnen of weefsel), de morfologie, chemische samenstelling en functie van natuurlijke of kunstmatige materialen die een centrale rol spelen in de moderne wetenschap en technologie te verkennen. Mitochondriale functie werd verder geëvalueerd door mitochondriale fluorescentie intensiteit, adenosine 5'-triphosfat (ATP) niveaus, zuurstofverbruik (OCR) en mitochondriaal membraan potentieel (MMP)in HepG2 cellen geïncubeerd met β-HCH. Mito-tracker groen is een mitochondriën groene fluorescerende sonde die kan worden gebruikt voor levende cel mitochondriaal-specifieke fluorescerende vlekken. De mitochondriën in hepatocyten werden gekleurd door mito-tracker groene oplossing en mitochondriale fluorescentie intensiteit, aantal en patroon werden waargenomen met een confocale microscopie⁹. Mitochondriale groene fluorescerende sonde kan worden gebruikt om levende cellen te bevlekken. Vergeleken met rhodamine 123 of JC-1 is mitochondriaal groene fluorescerende sonde niet afhankelijk van mitochondriaal membraanpotentieel voor mitochondriale vlekken. ATP-niveaus werden bepaald door een luciferase-luciferin kit en genormaliseerd door eiwitconcentratie. ATP-testkit kan worden gebruikt om ATP-niveaus te detecteren in gemeenschappelijke oplossingen, cellen of weefsels. Deze kit is gebaseerd op firefly luciferase gekatalyseerd door fluoresceïne om fluorescentie te genereren, wanneer ATP nodig is om energie te leveren. Wanneer de vuurvlieg luciferase en fluoresceïne buitensporig zijn, is de generatie van fluorescentie evenredig met de concentratie van ATP. Daarnaast is deze kit speciaal ontworpen om de chemiluminescentie van ATP te optimaliseren. ATP, als de belangrijkste energiemoleculen, speelt een belangrijke rol in de verschillende fysiologische of pathologische processen van cellen. Veranderingen in ATP-niveaus kunnen defecten in de celfunctie weerspiegelen, met name de productie van mitochondriale energie. Meestal onder apoptose, necrose of in een giftige toestand, cellulaire ATP niveaus verminderd ¹⁰. MMP's test kit met JC-1 is een kit die JC-1 gebruikt als een fluorescerende sonde om cellen, weefsels of gezuiverde MMP's snel en gevoelig te detecteren. Het kan worden gebruikt voor vroegtijdige opsporing van apoptose. De kationische kleurstof JC-1 is een fluorescerende sonde die wordt gebruikt om de MMP die kan worden geanalyseerd onder stroom cytometrie aangegeven door veranderingen van groene en rode fluorescentie verhouding te detecteren. Wanneer het MMP hoog is, wordt JC-1 samengevoegd in de matrix van de mitochondriën tot een polymeer (J-aggregaten), dat rode fluorescentie produceert. Wanneer het MMP laag is, kan JC-1 zich niet ophopen en vormt monomeer die groene fluorescentie^{produceert 11}. Dus de verhouding van rode en groene fluorescentie kan het niveau van MMP weerspiegelen. De OCR van cellen is een cruciale indicator van de normale cellulaire functie¹². Het wordt beschouwd als een parameter voor onderzoek mitochondriale functie. Cell mito stress test kit biedt een stabiele methode voor het analyseren van de belangrijkste parameters van mitochondriale functie. De kit biedt kwaliteitscontrole en voorspellende reagentia, evenals een standaardmethode voor het uitvoeren van cel mitochondriale stresstest. Het kan worden gebruikt om alle celtypen te detecteren, inclusief primaire cellen, cellijnen, zwevende cellen, en ook voor eilandjes, aaltjes, gisten en geïsoleerde mitochondriën.

OCR-meting kan waardevol inzicht geven in de fysiologische status of veranderingen van cellen. Het werd bepaald met een extracellulaire flux analyzer om ademhaling baseline, proton lek, maximale luchtwegen, ATP omzet en reserve capaciteit te detecteren. Kortom, na basismetingen van OCR werd OCR gedetecteerd nadat het achtereenvolgens had toegevoegd aan oligomycine (ATP Coupler), FCCP (mitochondriale oxidatieve fosforylatie uncoupler) en antimycine A/rotenone (een remmer van zuurstofverbruik)per put.

In een poging om de ontwikkeling van meer specifiek protocol voor het opsporen van mitochondriale functie in hepatocyten in vitro te vergemakkelijken, presenteren we hier experimenten door TEM, confocale microscopie, luminometer, stroomcytometrie en extracellulaire flux analyzer met toekomstige toepassing bij het bestuderen van mitochondriën schade gerelateerde nadelige resultaten.

Protocol

Alle experimenten en de experimentprotocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met relevante richtlijnen en voorschriften en goedgekeurd door de lokale Ethische Commissie van de Nanjing Medical University.

1. Mitochondriale ultrastructuur door TEM

1. Het verzamelen van HepG2 cellen
   1. Seed HepG2 cellen in 100 mm gerechten. Bewaar bij 37 °C en 5% CO₂.
   2. Verteren cellen met 0,25% EDTA in 1,5 mLEP buis.
   3. Centrifuge op 1000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi de supernatant weg.
   4. Verzamel 4-6 x 10⁵ HepG2 cellen.
2. Voeg 1 mL glutaraldehyde (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water) toe met pipetten en incubeer bij 4°C gedurende 2 uur.
3. Voeg toe en was in 4 veranderingen van 1 mL fosfaatbuffer (met Na₂HPO_4,KH₂PO₄, NaCl en KCl, pH 7.4), 15 min per stuk. Zuig fosfaatbuffer met pipetten eruit.
4. Voeg 200 μm van 1% osmium (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water) en incubbate bij 4 °C gedurende 2 uur toe aan zwart monster.
   Let op: Osmium is zeer giftige en vluchtige stof. Het moet zorgvuldig worden bediend in de medicijnkast.
5. Voeg toe en was in 2 veranderingen van 1 mL fosfaatbuffer, 5 min per stuk. Zuig fosfaatbuffer eruit.
6. Vlek in 2% uranylacetaatoplossing (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water en azijnzuur) in 1,5 mL EP buis gedurende 2 uur.
7. Dehydraat en onderdompel door 50% aceton, 70% aceton, 90% aceton (Oplosmiddel: dubbel gedestilleerd water), 2 veranderingen van absolute aceton, 15 min per stuk.
8. Penetreer in 2 druppels aceton (100%)/inbeddingsmiddel (1:1) voor 1,5 uur bij RT. Epon812 inbedding agent, het recept is als volgt: A: Epon812, 62 mL en DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL en MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, in de winter), A:B=1:9 (v:v, in de zomer). Inbedding in het inbedden van mallen (Zachte plastic plaat met geruit rooster).
9. Incubate achtereenvolgens bij 37 °C voor 12 uur, 45 °C voor 12 uur en vervolgens 60 °C voor 48 uur.
10. Bereid ultradunne secties (het grootste gebied mag niet meer dan 0,5 mm × 0,3 mm) voor door ultradunne secties machine en TEM (2 μm en 500 nm).

2. Mitochondriale fluorescentieintensiteitsdetectie

1. Zaad 2x 10⁴ HepG2 cellen in 6-well platen. Voeg β-HCH toe voor 24 uur.
2. Voeg watervrije DMSO toe om een uiteindelijke concentratie van 1 mM mitochondriale groene fluorescerende sonde te formuleren.
3. Voeg 1 mL mitochondriale groene fluorescerende sondeoplossing (uiteindelijke concentratie: 200 nM) toe aan elke put van 6-putplaten, incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten.
4. Verwijder de mitochondriale groene fluorescerende sondeoplossing en voeg vers bereid celkweekmedium (DMEM) toe bij 37 °C voorafgaand aan de beeldvorming.
5. Observeer mitochondriale groene fluorescentie door een fluorescentiemicroscoop (10x). De maximale excitatiegolflengte bij detectie is 490 nm en de maximale emissiegolflengte is 516 nm.

3. Test van de cellulaire ATP-niveaus

1. Seed HepG2 cellen in 6-well platen. Voeg β-HCH toe voor 24 uur.
2. Voeg 200 μL lysebuffers van de luciferase-luciferin ATP-testkit toe aan elke put van 6-putplaten. Centrifuge bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verzamel de supernatant met pipetten in nieuwe buizen.
3. Verdun het ATP-detectiereagens met de ATP-verdunning bij een verhouding van 1: 5, als ATP-detectiebuffer.
4. Standaardcurvebepaling voorbereiden: verdun de ATP-standaardoplossing van 0,5 mM tot 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM door ATP lysis-buffers.
5. Voeg 100 μL ATP-detectiebuffer toe in een 96-putplaat gedurende 5 minuten bij RT en voeg 100 μL supernatant van de cel toe, detecteren door een luminometer (chemiluminescentiedetector). Bereken atp-concentratie (nmol/L) hoewel de standaardcurve.
6. Detecteer de eiwitconcentratie door een BCA Protein Assay Kit met multimode reader.
   1. Bereid de standaardcurvebepaling voor: verdun de 5 mg/mL eiwitstandaardoplossing tot 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 en 0,5 mg/mL met dubbel gedestilleerd water.
   2. Voeg 1 μL supernatant van de cel in een 96-put plaat en voeg 19 μL van dubbel gedestilleerd water.
   3. Voeg 200 μL BCA-detectieoplossingen toe voor elke put. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Detecteer de OD-waarde (optische dichtheid) door een multimodelezer met 562 nm. Bereken de eiwitconcentratie (mg/mL) hoewel de standaardcurve.
7. Corrigeer het ATP-gehalte per mg eiwitconcentratie (eenheid: ATP-concentratie/eiwitconcentratie, nmol/mg).

4. Mitochondriale membraan potentieel (MMP) beoordeling door JC-1

1. Verzamel HepG2 cellen gezaaid in 6-well platen. Verteren cellen met 0,25% EDTA in 1,5 mL EP buis, centrifuge op 1000 x g gedurende 3 min, gooi de supernatant en cellen te verzamelen.
2. Voeg 50 μL JC-1 (200X) toe aan 8 mL gedestilleerd water aan vortex en meng. Voeg 2 mL VAN JC-1 (5X) kleuring verven buffer als JC-1 detectie oplossing.
3. Incubeercellen met een mengsel van 0,5 mL celkweekmedium en 0,5 mL JC-1 detectieoplossing voor 20 min bij 37 °C.
4. Centrifuge bij 600 x g gedurende 3 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg.
5. Spoel in 2 veranderingen van 1 mL van JC-1 (1X) verven buffer, centrifuge op 600 x g gedurende 3 min bij 4 °C. En gooi de supernatant weg.
6. Stel cellen op in 0,5 mL van JC-1 (1X) verven buffer, analyseren via stroom cytometrie om groene en rode fluorescentie te detecteren. Wanneer het JC-1-polymeer wordt gedetecteerd, stelt u het excitatielicht in op 490 nm en het emissielicht op 530 nm. Wanneer het JC-1-polymeer wordt gedetecteerd, stelt u het excitatielicht in op 525 nm en het emissielicht op 590 nm.

5. Metingen van het zuurstofverbruik (OCR)

1. Seed HepG2 cellen in celcultuur microplaten van 96-goed bij een dichtheid van 4500 cellen/100 μL per put. Zorg ervoor dat cellen bedekt met elke put na 24 uur.
2. Voeg volgens eerdere literatuur¹³het juiste volume van de bereide reagentia toe aan de juiste injectiepoort . Poort A: 25 μL 1 μM oligomycine (ATP Coupler); Poort B: 25 μL 0,75 μM FCCP (Electronic Throttle Control, ETC Accelerator); Poort C: 25 μL 0,5 van μM antimycine A/rotenone (mitochondriale remmer A en mitochondriale remmer B).
3. Bewaar de cartridge in een 37 °C incubator zonder CO₂ tot het gebruiksklaar is.
4. Maak een middelgrote verandering van de celplaat door het verwijderen van het lopende medium van elke put en toe te voegen aan de nieuwe DMEM. Het uiteindelijke volume voor elke put is 180 μL.
5. Bewaar de celplaat in een couveuse van 37 °C zonder CO₂ gedurende 1 uur voor de test.
6. Neem OCR automatisch op via software.
   1. Open de OCR-software.
   2. Kies Cell Mito Stress Test Kit in de vervolgkeuzelijst Apps.
   3. Klik op de knop App starten.
   4. Klik op de knop Stresstest uitvoeren. Het scherm Celstresstestinstelling wordt weergegeven.
   5. Voert de volgende stappen uit:
      1. Voer het aantal cellen per put in de box Cell seeding # in.
      2. Voer de gemiddelde OCR in het vak Gemiddelde basale OCR in.
      3. Voer de uiteindelijke werkconcentratie voor elk reagens in en injecteer de reagentia.
         OPMERKING: De gemiddelde basale OCR-waarde voor de cel moet zijn gedetecteerd voordat de optimalisatietest wordt uitgevoerd bij het optimaliseren voor celzaaiconcentratie.
      4. Klik op de knop Volgende. Het scherm groepsinfo wordt weergegeven.
      5. Wijs een groep toe aan de niet-toegewezen putten door een kleur te kiezen en een naam te geven en vervolgens op de juiste putten te klikken.
         OPMERKING: De verschillende groepen worden gedefinieerd als verschillende behandelingen voorafgaand aan het uitvoeren van de Cell Mito Stress Test. Alle putten van microplaten krijgen dezelfde reagens injecties wanneer de stresstest wordt uitgevoerd.
      6. Klik op de knop Volgende. Het scherm StressTest Injection Layout wordt weergegeven.
      7. Klik op Start. De Stress Test wordt nu uitgevoerd op de Analyzer. Wanneer de run voorbij is, volg de punt s in de software, verwijder en gooi de cartridge en de celplaat.

Results

De mitochondriën cristae van HepG2 cellen blootgesteld aan β-HCH werden aanzienlijk beschadigd. Verspreide mitochondriën waren licht tot duidelijk uitgebreid, onregelmatig gevormd, en mitochondriale nok verdwenen met relatief abnormale mitochondriale architectuur (Figuur 1).

De gemiddelde mitochondriale groene fluorescentieintensiteit, die de mitochondriën vertegenwoordigt, daalde in HepG2-cellen di...

Discussion

Cruciaal voor het succes van het detectieprotocol is het gebruik van een verscheidenheid aan experimentele methoden die zijn behandeld de studie van fenotype tot mechanisme. In deze studie werden HepG2-cellen gekweekt in DMEM met penicilline en streptomycine en 10% foetaal runderserum. Wanneer cellen 40-50% samenvloeiing bereikten, werden β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) toegevoegd en voor 24 uur geïncubeerd. We gebruikten eerst TEM die de ultrastructurele veranderingen in hepatocyte toonde veroorzaakt door de representatieve OC...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmissie-elektronenmicroscoop	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Hoge contrast, hoge resolutie beeldvorming, Observatie en beeldvorming met lage dosis, Observatie bij lage temperatuur, Uitstekende analytische prestaties, Automatisering voor gemak en prestaties
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green is een mitochondriale groen fluorescerende sonde die kan worden gebruikt voor mitochondriële specifieke fluorescente kleuring van levende cellen.
Laser scanning confocale microscoop	Zeiss	700B	Het ontwerp is compact, stabiel, de lichtbaan is de kortste, hoge lichtprecisie, creatieve technologie en geavanceerde scantechnologie samen om een perfect 3-dimensionaal monsterbeeld te produceren.
Verbeterde ATP Assay Kit	Beyotime	S0027	De verbeterde ATP Assay Kit kan worden gebruikt om ATP (adenosine 5'-trifosfaat) niveaus in gangbare oplossingen, cellen of weefsels te detecteren. Cellen en weefselmonsters kunnen worden verdeeld om de monstervoorbereiding te voltooien, detectiegevoeligheid tot 0,1 nmol / L, chemiluminescentie kan gedurende 30 minuten worden onderhouden.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Een luminometer is een chemiluminescentie detector, het testmonster zelf kan licht zijn, geen stimulatie nodig. Een luminometer is het instrument dat chemiluminescentie detecteert.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	BCA Protein Assay Kit is een van de meest gebruikte methoden voor het detecteren van eiwitconcentraties.
Multimode reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode reader kan worden gebruikt om eiwitconcentratie te detecteren.