Ftaalzuur Ester-Binding DNA Aptamer selectie, karakterisering en toepassing aan een elektrochemische Aptasensor

Summary

Een protocol voor de in vitro selectie en karakterisering van groepsspecifieke ftaalzuur ester-binding DNA aptamers wordt gepresenteerd. De toepassing van de geselecteerde aptamer in een elektrochemische aptasensor is ook inbegrepen.

Abstract

Ftaalzuur esters (PAEs) areone van de grote groepen van persistente organische verontreinigende stoffen. De groepsspecifieke detectie van PAEs is zeer gewenst als gevolg van de snel groeiende van congeneren. DNA aptamers zijn steeds meer toegepast als erkenning elementen op biosensor platformen, maar selecteren aptamers richting zeer hydrofobe klein molecuul doelen, zoals PAEs, is zelden gerapporteerd. Dit werk beschrijft een kraal gebaseerde methode ontworpen om te selecteren groepsspecifieke DNA aptamers aan PAEs. De aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH₂) zoals het anker doel werd gesynthetiseerd en geïmmobiliseerd op de epoxy-geactiveerde agarose parels, waardoor de weergave van de ftaal ester-groep aan het oppervlak van de immobilisatie-matrix, en Daarom is de selectie van de groepsspecifieke bindmiddelen. Wij vastbesloten de dissociatieconstanten van de aptamer kandidaten door kwantitatieve polymerisatie kettingreactie van magnetische scheiding wordt gekoppeld. De relatieve affiniteiten en de selectiviteit van de aptamers aan andere PAEs werden bepaald door de concurrerende testen, waar de aptamer kandidaten waren vooraf begrensd aan de DBP-NH₂ aangesloten magnetische kralen en vrijgegeven aan het supernatans dat na incubatie met de geteste PAEs of andere potentieel storende stoffen. De concurrerende assay werd toegepast omdat het verstrekt een vergelijking van de facile affiniteit tussen PAEs die had geen functionele groepen voor oppervlakte immobilisatie. Tot slot, wij aangetoond van de fabricage van een elektrochemische aptasensor en gebruikt voor ultrasensitive en selectieve detectie van bis(2-ethylhexyl) ftalaat. Dit protocol biedt inzichten voor de ontdekking van de aptamer van andere hydrofobe kleine moleculen.

Introduction

Samen met de snelle economische ontwikkeling is versnelling van de industrialisatie en de bouw van het stedelijk, milieuvervuiling ernstiger dan ooit. Typische milieuverontreinigende stoffen zijn zware metaal ionen, toxinen, antibiotica, bestrijdingsmiddelen, hormoonontregelaars en persistente organische verontreinigende stoffen (POP's). Naast metaalionen en toxines, andere verontreinigende stoffen zijn kleine moleculen dat heel vaak bestaan uit een verscheidenheid van congeneren. De meest giftige POP's bijvoorbeeld polychloorbifenylen (PCB's), polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), bifenyl polybroomdifenylethers (PBDE's), polychloordibenzo-p-dioxines (PC....

Protocol

1. bibliotheek en Primer Design en synthese

1. De eerste bibliotheek en inleidingen ontwerpen.
   Bibliotheek (groep₀): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
   Toekomen primer (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
   Phosphorylated omgekeerde primer (PO₄- RP): 5'-PO₄- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
2. Synthetiseren zwembad₀, FP en PO₄- RP met behulp van standaard phosphoramidite chemie^18,19,20, en te zuiveren van alle de ANI's door standaard krachtige vloeibare chromatografie (HPLC)

Results

We ontworpen en gesynthetiseerd de aminogroep matiemaatschappij dibutylftalaat (DBP-NH₂) als het anker doel (figuur 1F). We uitgevoerd dan de DNA aptamer selectie van PAEs DBP-NH₂ gebruikt als anker doel en na de klassieke doel immobilisatie gebaseerde methode (Figuur 2). In elke ronde, werd een pilot PCR uitgevoerd met behulp van de gedenatureerde pagina voor het optimaliseren van het nummer van de cyclus v.......

Discussion

Een uitstekende voordeel van aptamers is dat ze worden geïdentificeerd door middel van de methode in vitro SELEX, hoewel antilichamen worden gegenereerd via in vivo immunoreactions. Daarom, aptamers kunnen worden geselecteerd met de gewenste doelgroep specificiteit uit hoofde van goed ontworpen proefomstandigheden, overwegende dat antilichamen beperkt tot de fysiologische omstandigheden zijn.

Ter vergemakkelijking van de scheiding van afhankelijke sequenties van gratis sequen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV-2550	Shimadzu,Japan		protocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200	BIO-RAD		section 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 Touch	BIO-RAD		section 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostat	Bio-Logic Science, Claix, France		section 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6B	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	10220020	argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beads	Invitrogen, USA	420420	magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start Version	Takara,Dalian,China	R028A	polymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing Membrane	Bemis, USA	PM-996	section 3.6.5
Lambda Exonuclease	Invitrogen, USA	EN0561	section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE Precipitation Carrier	Takara,Dalian,China	9094	section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B511135	section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Invitrogen, USA	1811838	nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II	Takara,Dalian,China	RR820A	polymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	CAS: 1132-61-2	section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Invitrogen, USA	CAS: 25952-53-8	section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	6066-82-6	section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)	Sigma-Aldrich	CAS: 1633-78-9	section 7.7
Gold electrode	Shanghai Chenhua	CHI101	section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	CAS: 51805-45-9	section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol)	Sigma-Aldrich	CAS: 651042-82-9	section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP)	National Institute of Metrology, China	CAS: 117-81-7	section 7.11
Tween 20	Sigma-Aldrich	CAS: 9005-64-5	polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100	Sigma-Aldrich	CAS: 9002-93-1	non-ionic surface active agent
PBS	Sigma-Aldrich	P5368	10 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4