Method Article

Creëren van een structureel realistische eindige elementen geometrische Model van een Cardiomyocyte te bestuderen van de rol van cellulaire architectuur in Cardiomyocyte systeembiologie

DOI:

10.3791/56817

⸱

April 18th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om te maken een ruimtelijk gedetailleerde eindige elementen-model van de intracellulaire architectuur van cardiomyocytes van elektronenmicroscopie en confocale microscopie afbeeldingen. De kracht van dit ruimtelijk gedetailleerd model wordt aangetoond door middel van case-studies in calcium signalering en Bioenergetica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de komst van driedimensionale (3D) imaging-technologieën zoals Elektronentomografie, seriële-blok-face scanning elektronen microscopie en confocale microscopie, de wetenschappelijke gemeenschap tot ongekende toegang tot grote gegevenssets sub micrometer resolutie die kenmerkend zijn voor de architecturale remodelleren die begeleidt wijzigingen in functie van de cardiomyocyte in gezondheid en ziekte. Echter, deze datasets zijn onderbezet voor het onderzoeken van de rol van cellulaire het platform remodelleren in cardiomyocyte functie. Het doel van dit protocol is te schetsen hoe maak je een nauwkeurige eindige elementen-model van een cardiomyocyte met behulp van hoge resolutie elektronenmicroscopie en confocale microscopie beelden. Een gedetailleerd en nauwkeurig model van cellulaire het platform heeft aanzienlijke mogelijkheden om te bieden van nieuwe inzichten in cardiomyocyte biologie, meer dan alleen experimenten kunnen garner. De kracht van deze methode ligt in zijn vermogen om te fuseren computationeel informatie van twee ongelijksoortige beeldvormende modaliteiten van cardiomyocyte ultrastructuur te ontwikkelen van een uniforme en gedetailleerd model van de cardiomyocyte. Dit protocol schetst stappen Elektronentomografie en confocale microscopie beelden van volwassen mannelijke (naam voor een specifiek hondenras albino rat) Wistar rat cardiomyocytes te ontwikkelen van een model van de half-Sarcomeer eindige elementen van de cardiomyocyte te integreren. De procedure genereert een 3D eindige elementen-model dat een nauwkeurige, high-resolution voorstelling bevat (over de volgorde van ~ 35 nm) van de verdeling van de mitochondriën, de myofibrils en de ryanodine receptor clusters die de nodige calcium voor cardiomyocyte vrijgeven samentrekking van het sarcoplasmic reticulaire netwerk (SR) in de myofibril en cytosolische compartiment. Het model gegenereerde hier als een illustratie niet details van de transverse-zaadvormende architectuur of het sarcoplasmic reticulaire netwerk opgenomen en daarom een minimale model van de cardiomyocyte is. Niettemin, het model al kan worden toegepast in simulatie gebaseerde onderzoek naar de rol van de celstructuur in calcium, signalering en mitochondriaal Bioenergetica, die wordt geïllustreerd en besproken met behulp van de twee case-studies die zijn ingediend na de gedetailleerde protocol.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Excitatie-contractie koppeling (ECC) in het hart verwijst naar de belangrijke en ingewikkelde koppeling tussen elektrische excitatie van de cardiomyocyte membraan en de latere mechanische contractie van de cel tijdens elke hartslag. Wiskundige modellen hebben een belangrijke rol bij de ontwikkeling van een kwantitatief begrip van de onderling met elkaar verbonden biochemische processen die regelen de actiepotentiaal1, cytosolische calcium signalering2, Bioenergetica3, en de daaropvolgende contractiele strijdkrachtgeneratie. Dergelijke modellen hebben ook met succes voorspelde veranderingen in de hartslag wanneer één of meerdere van deze biochemische processen ondergaan veranderingen4,5. De zeer georganiseerde ultrastructuur van de cardiomyocyte is steeds meer erkend om te spelen een cruciale rol in de normale contractiele functie van de cel en het hele hart. Inderdaad, de morfologie en de organisatie van onderdelen van cardiale ultrastructuur wordt gewijzigd in parallel aan biochemische veranderingen in ziekten zoals hypertrofie6, hartfalen7en diabetische cardiomyopathie8. Of deze structurele veranderingen zijn kleine, adaptieve of pathologische reacties aan de veranderende biochemische voorwaarden is nog grotendeels onbekend9. De intrinsiek nauwe koppeling tussen vorm en functie in de biologie betekent dat de experimentele studies alleen meer inzicht dan correlaties tussen structurele remodelleren en cardiomyocyte functie niet kunnen bieden. Een nieuwe generatie van wiskundige modellen die de structurele samenstelling van de sub cellulaire componenten samen met de goed bestudeerde biochemische processen, kunt opnemen zijn nodig om een uitgebreide, kwantitatief begrip van de relatie tussen structuur, biochemie en contractiele kracht in cardiomyocytes. Dit protocol wordt beschreven methoden die kunnen worden gebruikt voor het genereren van structureel nauwkeurige eindige elementen modellen van cardiomyocytes, die kunnen worden gebruikt voor dergelijke onderzoeken.

Het laatste decennium heeft gezien aanzienlijke vooruitgang in 3D elektronenmicroscopie10, confocal11en super resolutie microscopie12 die ongekende, high-resolution inzicht verwerven in de vergadering van de nano-schaal en micro-schaal van de sub cellulaire componenten van de cardiomyocyte. Onlangs, deze datasets werden gebruikt voor het genereren van rekenmodellen cardiomyocyte ultrastructuur13,14,15,16. Deze modellen gebruiken een gevestigde engineering simulatie methode, genaamd de eindige elementen methode17, maken van eindige elementen computationele mazen over welke biochemische processen en cardiomyocyte contracties kunnen worden gesimuleerd. Deze modellen zijn echter beperkt door de resolutie en de gedetailleerdheid die een microscopie methode in de dataset van een afbeelding bieden kan. Bijvoorbeeld, elektronenmicroscopie nanometer niveau detail van celstructuur kunt genereren, maar het is moeilijk vast te stellen specifieke proteïnen binnen het beeld dat zou nodig zijn om een model te maken. Aan de andere kant, super resolutie optische microscopie biedt contrastrijke beelden met hoge resoluties over de volgorde van 50 nm van slechts een select aantal moleculaire componenten van de cel. Alleen door de integratie van aanvullende informatie van deze beeldvormende modaliteiten kan een realistisch verkennen de gevoeligheid van de functie aan veranderingen in de structuur. Oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie is nog steeds niet een routineprocedure en het zou nog steeds lijden de beperking dat slechts een beperkt aantal onderdelen kon worden gekleurd in de immunofluorescentie weergave en gecorreleerd met de weergave van elektronenmicroscopie.

Dit protocol biedt een nieuwe benadering van18 die gebruikmaakt van statistische methoden19 te analyseren en rekenkundig fuse de lichte microscopie van informatie over de ruimtelijke spreiding van ion-kanalen met elektronenmicroscopie informatie over andere cardiale ultrastructuur de componenten, zoals myofibrils- en mitochondriën. Dit levert een eindige elementen-model dat kan worden gebruikt met biofysische modellen van biochemische processen te bestuderen van de rol van cardiomyocyte sub cellulaire organisatie op de biochemische processen die cardiomyocyte contractie regelen. Bijvoorbeeld, dit protocol kan worden gebruikt om modellen van gezonde en streptozotocin-geïnduceerde diabetische cardiale myocytes te bestuderen van het effect van structurele remodelleren op cardiale cel functie die wordt waargenomen bij diabetische dier8modellen. Een bijkomend voordeel van de statistische aard van de onderhavige methode wordt ook geïllustreerd in het protocol: genereert de methode kan meerdere exemplaren van eindige elementen geometrieën die nauw na te de experimenteel waargenomen variaties in de celstructuur bootsen.

Als een overzicht, het protocol stappen omvatten: (i) voorbereiding cardiac weefsel voor elektronenmicroscopie voor het genereren van 3D-beelden met voldoende resolutie en contrast; (ii) de wederopbouw en segmentatie van 3D afbeeldingsstapels van elektronenmicroscopie gegevens met behulp van een 3D-elektronenmicroscopie wederopbouw- en beeldanalyse software genaamd IMOD20; (iii) het gebruikmaken van iso2mesh21 voor het genereren van een maaswijdte van eindige elementen met behulp van de gesegmenteerde gegevens als invoer; (iv) het gebruikmaken van de nieuwe algoritme en codes toewijzen van de verdeling van de ionenkanalen op de Maas van eindige elementen.

Het uitgangspunt van de aanpak van elke stap wordt beschreven in het protocol, en representatieve resultaten vindt u in de bijbehorende cijfers. Een overzicht geeft een overzicht geven van hoe de gegenereerde ruimtelijk gedetailleerde modellen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de ruimtelijke dynamiek van calcium tijdens ECC, evenals de mitochondriale Bioenergetica. Sommige van de huidige beperkingen van het protocol worden besproken, evenals nieuwe ontwikkelingen die gaande zijn te overwinnen en verder een kwantitatief begrip van de rol van de celstructuur te cardiale systeembiologie. Hoe deze methoden kunnen worden gegeneraliseerd om te maken van eindige elementen modellen van andere celtypes wordt ook behandeld.

Gebruikers van dit protocol kunnen stap 1 en het deel van de wederopbouw van stap 2 overslaan als zij over een reeds bestaande elektronenmicroscopie afbeeldingsstapel beschikken. Gebruikers die willen verwerven hun gegevens in samenwerking met meer ervaren electron microscopists desgewenst te bespreken en de fixatie en kleuring procedures in stap 1 met de deskundige te bepalen van een optimale protocol voor de verwerving te vergelijken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Universiteit van Auckland dier ethisch comité en de Universiteit van Californië-San Diego institutionele dierenverzorgers en gebruik Comité, waar het weefsel protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld.

1. experimentele voorbereiding

  1. Het bereiden van stamoplossingen van 0,15 M en 0.3 M natrium cacodylate buffers met een pH van 7,4 volgens tabel 1.
  2. Bereiden Glutaaraldehyde fixeer (2% paraformaldehyde (PFA) + 2,5% Glutaaraldehyde + 0,2% looizuur in 0,15 M natrium cacodylate buffer met een pH van 7,4) met behulp van onderdelen vermeld in tabel 1.
    1. Los 2 g PFA poeder 20 ml gedistilleerd water van 60 ° C op een kookplaat met constant roeren.
    2. Voeg 1 M NaOH oplossing totdat de oplossing duidelijk is.
    3. Wacht totdat de temperatuur van de oplossing lager dan 40 ° C is, dan Voeg 10 mL Glutaaraldehyde en 20 mL 0,3 M natrium cacodylate.
    4. Voeg 0.2 g looizuur en los het op in de oplossing.
    5. Voeg 50 mL 0,15 M natrium cacodylate.
    6. Bewaar drie of vier 20 mL Scintillatie flesjes van fixeerspray in koelkast bij 4 ° C of op ijs als gebruikt op dezelfde dag.
  3. Tyrode de oplossing met 20 mM 2,3-butaandion monoxime (BDM), bereid volgens het recept in tabel 1.
  4. Construeer een Langendorff apparaat in een zuurkast.
    1. Klem twee 100 mL kunststof spuit buizen aan twee verschillende retort tribunes, ongeveer 70 cm hoog vanaf de basis van de stand.
    2. Sluit de kunststof spuit-buizen en een buis van de connector 3 mm-inner-diameter buizen en een drie-weg-afsluiter te gebruiken zoals in Figuur 1.
    3. Een 3 mm buitendiameter canule naar de onderkant van de buizen, waar het hart zal worden gekoppeld voor fixatie van de perfusie connector passen.
  5. Vul de injectiespuit buizen met Tyrode de oplossing en kleefpoeders oplossingen bij 37 ° C.
    1. Verwijderen van luchtbellen in de buis door het passeren van de oplossingen van de spuit via hen.

2. het verwerven van elektronenmicroscopie gegevens van Cardiomyocyte ultrastructuur

  1. Het dier voorbereiden van excisie en chemische fixatie van het hart.
    Opmerking: Dit protocol detailleert de stappen voor het verwerken van volwassen mannelijke (naam voor een specifiek hondenras albino rat) Wistar rat cardiale weefsel. Het protocol kan wijzigingen vereisen wanneer het cardiale weefsel is afkomstig van andere diersoorten.
    1. Anesthetize het dier door de behandeling van de rat (200-250 g door lichaamsgewicht) met 0,5 mL 250 U/mL heparine via intraperitoneale injectie. Wacht 10 minuten, dan behandelen de rat met intraperitoneale injectie van pentobarbital (210 mg/kg lichaamsgewicht).
    2. Bevestig een juiste mate van verdoving door de teen snuifje reflex testen.
    3. Het dier door cervicale dislocatie euthanaseren.
    4. Oogst het hart met behulp van de dissectie procedures vergelijkbaar met de eerder gepubliceerde JoVE artikelen22,23, plaats dan het in een ijskoude zoutoplossing.
    5. Isoleren van de oplopende aorta en cannulate. Zorg ervoor dat het uiteinde van de canule net boven de semi-lunar klep zit, waar de kransslagaderen vertakken. Bind een draad strak rond de oplopende aorta.
    6. Sluit de canule aan de zwaartekracht-gedreven Langendorff apparaat bediend, ~ 70 cm boven de basis van het stelsel (Figuur 1).
    7. Draai de afsluiter op het Langendorff systeem om het perfuse van het hart met de Tyrode oplossing, met inbegrip van 20 mM BDM (een myosin inhibitor) voor 2-3 min.
    8. Draai de afsluiter om te beginnen met perfusie met fixeer van 2% paraformaldehyde, Glutaaraldehyde 2,5% en 0,2% looizuur in 0,15 M natrium cacodylate bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Als dat lukt, zal het hart zet bleke brown en worden stijf en rubberachtig.
    9. Met behulp van een scheermesje, ontleden weefsel "blocks" van de linker ventriculaire (laterale) gratis muur en verkrijgen van weefsel blokkeert ongeveer 1 mm3 in grootte.
    10. Winkel de monsters in vooraf gekoelde 20 mL Scintillatie flesjes van de dezelfde fixeerspray op ijs voor 2 h. op te slaan zoveel monsters mogelijk in de flesjes en ervoor zorgen dat de monsters worden ondergedompeld in de oplossing.
      Let op: Het is belangrijk dat de monsters koud tot na de uitdroging van de 100% stap hieronder.
  2. Verdere fixatie en kleuring van monsters voor elektronenmicroscopie.
    1. 100 mL 0,15 M natrium cacodylate buffer in een bekerglas van glas en afkoelen in de ijskast.
    2. Bereiden gelijke hoeveelheid 4% osmium tetroxide en 0,3 M natrium cacodylate, gevolgd door de toevoeging van 0,08 gram kaliumferrocyanide om een heavy metal vlek oplossing met 2% kaliumferrocyanide in 2% osmium tetroxide en 0,15 M natrium-cacodylate te maken. Koel de oplossing op het ijs.
    3. Pipetteer de fixeerspray uit en genoeg koud 0,15 M natrium cacodylate buffer te dompelen monsters in de flesjes te vervangen. Plaats de flesjes op ijs gedurende 5 minuten.
    4. Herhaal stap 2.2.3 viermaal meer met 0,15 M natrium cacodylate te verwijderen van de overtollige fixeerspray.
      Let op: Gebruik geen glas pipetten omdat tiny scherven in de steekproef krijgen kunnen en diamant messen tijdens het weefsel blok afdelen kunnen ruïneren. Het is belangrijk vooraf alle oplossingen op ijs afkoelen voordat u deze toevoegt aan het monster. Het is ook belangrijk dat het monster gedekt door oplossing aller tijden blijft (zeer korte periodes van gedeeltelijke dekking blijvend niet meer dan een paar seconden kunnen worden kort toegestaan tijdens oplossing uitwisselingen). Wanneer wassen of vervangen van oplossingen, de nieuwe oplossing snel toevoegen na het verwijderen van de vorige oplossing. Houd de Scintillatie flesjes op ijs tussen de wasbeurten. Merk op dat deze stap wordt geen tijd gevoelig, het weefsel blokken iets langer, indien nodig kunnen worden gewassen.
    5. Natrium cacodylate buffer vervangen door ijskoude heavy metal vlek oplossing en sla het op ijs 's nachts. Zorgen dat de ferrocyanide goed wordt gemengd door schudden van de flacon met de hand; de oplossing moet zwart zijn.
      Let op: Werk in de zuurkast bij het uitvoeren van deze stap omdat osmium giftig is.
    6. Verdun 4% waterige uranyl acetaat (UA)-stockoplossing (tabel 1) tot 2% met behulp van gelijke hoeveelheid voorraad UA oplossing en dubbel gedestilleerd water en het afkoelen in de ijskast.
    7. Heavy metal vlek vervangen door ijs-gekoelde 0,15 M natrium cacodylate buffer, en laat het monster Incubeer gedurende 5 min op ijs.
    8. Herhaal stap 2.2.7 meer viermaal op ijs te spoelen uit alle overtollige heavy metal vlek oplossing.
    9. Spoel de monsters vier keer, met een 2-min wachten-periode tussen in gezuiverd water (tweemaal gedestilleerd is voldoende).
    10. Vervangen van gezuiverd water met ijskoude 2% UA en laat het monster Incubeer gedurende 60-120 min op ijs.
    11. Vijf 20 mL Scintillatie flesjes van ethanol (genoeg te dompelen monsters) afkoelen op ijs, dat zal worden gebruikt in de stap van uitdroging. De zes flesjes hebben toenemende percentages van ethanol in gedistilleerd water: 20%, 50%, 70%, 90% en 100%.
    12. Giet pure aceton in een ander flesje van 20 mL Scintillatie en cool op ijs samen met de ethanol flesjes.
    13. Spoel monsters in gezuiverd water viermaal met 2 min wachttijden op ijs te wassen van overtollige UA.
  3. Uitdrogen van monsters in ethanol.
    1. In koude ethanol serie uitdrogen door achtereenvolgens vervanging van de oplossing binnen de flacon monster als volgt op het ijs: 20% ethanol gedurende 10 minuten; 50% ethanol gedurende 10 minuten; 70% ethanol gedurende 10 minuten; 90% ethanol gedurende 10 minuten; dan tweemaal in 100% ethanol voor 10 min.
    2. Overgang van monster, tot op kamertemperatuur door vervanging van de laatste 100% ethanol met gekoelde pure aceton en plaats de flacon monster op een bankje lab kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    3. Één meer 10 minuten wassen in pure aceton bij kamertemperatuur te verwijderen van condensatie thats waarneembare binnen de flesjes uitvoeren. Tijdens het broeden, make-up de aceton/hars-oplossingen.
    4. Vervang de zuivere aceton in de flesjes met 50:50 pure aceton en epoxy hars (met verhoudingen voor epoxy hars onderdelen zoals vermeld door de fabrikant). Alle onderdelen uit dezelfde batch gebruiken. Laat de hars gevulde monster flesjes 's nachts op een rotor.
  4. Monsters in de hars ingesloten.
    1. Vervang 50:50 hars met 75% hars (25% aceton) en incubeer gedurende 3 uur, gevolgd door verdere incubatie/infiltratie in 100% hars gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
    2. De 100%-hars vervangen door verse 100% hars, en laat de monster flesjes 's nachts voor een diepere penetratie van de hars in de weefselmonsters.
    3. Monsters te nemen uit de flesjes en plaats ze in containers die oven-vriendelijk zijn en hebben een vlakke basis; aluminium of zilver folie baking cups kan worden gebruikt voor dit doel, bijvoorbeeld.
    4. Zachtjes pour (om te voorkomen dat de verplaatsing van de monsters) verse hars over de monsters (dus het insluiten van monsters in hars) en de hars en de monsters in een oven bij 60 ° C gedurende 48 h polymeriseren.
  5. Heroriënteren hars blokken naar afbeelding cellen in doorsnede.
    1. 1 µm dik test secties van de hars blokken met behulp van een ultramicrotome met een glas mes te beoordelen cel oriëntatie24verkrijgen.
    2. Vlekken van de secties van de dikke test voor 20 s met 1% tolueen blauwe en 1% borax.
    3. Spier cel oriëntatie onder een heldere veld Microscoop onderzoeken.
    4. Op grond van de geaardheid afgeleid uit de beelden van de secties gebeitst test, heroriënteren overlangs of schuin georiënteerde (vergelijkbaar met figuur 2A) hars blokken om ervoor te zorgen dat de cellen worden blootgesteld aan het glas mes zodat zij zal worden gesneden in dwarsdoorsnede ( vergelijkbaar met figuur 2B).
  6. Afbeelding weefselsecties met behulp van Elektronentomografie.
    1. Verkrijgen van semi-dunne secties (~ 300 nm) van het heroriënteren weefsel blokken met behulp van een diamant mes en overdracht van de secties op koperen rasters25.
    2. De dikke secties met 2% UA en Sato lood25vlek.
    3. Colloïdale gouddeeltjes aan beide zijden van de secties25van toepassing.
    4. Single of dual-axis tilt tijdreeksen van geprojecteerde beelden verkrijgen bij-70 ° tot + 70 °25.
  7. IMOD20 te reconstrueren de 3D afbeeldingsstapel (een reeks van 2D-afbeeldingen waarmee de 3D-informatie van een sectie één elektron tomografie) gebruik van de cel. Deze gereconstrueerde stack zal worden onderverdeeld in de volgende stap.

3. gesegmenteerde Myofibrils- en mitochondriën regio's van de EM 3D beeld Dataset

  1. De IMOD programma "3dmod" uitvoeren.
  2. Binnen de 3dmod graphical user interface, typ het adres van de ".rec" of ".mrc"-bestand waarin het 3D beeld dataset van de cel (gegenereerd in stap 2.7) gereconstrueerd in het vak met het label "Image File (s):", druk op "OK".
  3. Onder het menu "File", selecteer Nieuw Model en sla het bestand op met een toepasselijke naam met behulp van de "Save Model als"... onder "Bestand" menu-item.
    Opmerking: Een object in de IMOD kan een verzameling gesegmenteerde componenten die deel van het 'object uitmaken' bevatten. Een nieuw model bevat standaard een nieuw object met de id '#1'.
  4. Selecteer "Hulpmiddelen voor tekenen" onder het "Speciaal" menu. Hiermee opent u een nieuwe werkbalk vergelijkbaar met dat weergegeven in figuur 3A.
    Opmerking: Er zijn verschillende hulpprogramma's die kunnen worden gebruikt voor het maken van contouren rond de verschillende organel grenzen. Meer informatie over manieren om het gebruik van deze hulpprogramma's kunnen worden gevonden in de IMOD20 documentatie.
  5. Kies de optie "Sculpt" in het menu "Hulpmiddelen voor tekenen" en beweeg de muis over naar het afbeeldingsvenster; een circulaire contour gecentreerd op de muisaanwijzer zal verschijnen.
  6. Door de middelste muisknop ingedrukt over een mitochondrion (de donkerste gedeelten van de afbeeldingsbestanden opslaat, zoals wordt geïllustreerd door begrenzingen met groene contour lijnen in de figuur 3A), sleept u de omtrek van de cirkel contour in de vorm van de grens.
  7. Zodra de contouren van de mitochondrion grens is voltooid, de middelste loslaat en herhaal stap 3.6 voor elke mitochondrion in de gegevens. Elke contour zal automatisch worden herkend door de IMOD als een nieuwe contour binnen hetzelfde object.
  8. Onder de "bewerken | Object "selecteren in het menu"New"om een nieuw object te maken. Dit zal automatisch verhogen van het totale aantal objecten met één en dit nummer toewijzen aan het nieuwe object.
  9. Herhaal stap 3.6 en 3.7 opslaan myofibril contouren te segmenteren.
  10. Herhaal stap 3.8, gevolgd door stap 3.6, evenals de celrand in segmenten.
  11. Sla het modelbestand onder het menu "Bestand".
  12. Voer de volgende commando's in een opdrachtregelvenster om elk object in een binair masker groeperen, zoals wordt geïllustreerd in Figuur 4A-Cte converteren.
    1. Uittreksel een specifiek object uit het model "imodextract-object modelfile outputmodelfile" waar "object" het nummer van het object is moet worden geëxtraheerd.
    2. Maak een masker voor dat object: imodmop-masker 255 outputmodelfile beeldbestand outputmask.mrc
    3. Het bestand converteren naar een tif-stapel: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. Maak een eindige elementen Mesh van de gesegmenteerde onderdelen

  1. Iso2mesh is een vrij beschikbare MATLAB programma TIFF afbeeldingsstapels omzetten in volumetrische tetrahedral eindige elementen mazen. Downloaden en iso2mesh toevoegen aan de MATLAB-pad vanuit iso2mesh.sourceforge.net.
  2. Download de broncodes en gegevens te simuleren RyR clusters op de Maas vanuit de github website https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
  3. Start de toepassing CardiacCellMeshGenerator MATLAB (Figuur 5).
  4. Laad de verschillende organel component maskers in MATLAB met behulp van de drie drukknoppen op de bovenste linker kant van de GUI.
  5. Maak een andere binaire afbeeldingsstapel die kloof tussen myofibrils- en mitochondriën zoals weergegeven in figuur 6Aafbakent.
    1. Open ImageJ.
    2. Met behulp van het bestand | Openen, laden de myofibrils- en mitochondriën TIFF-stacks in het programma.
    3. De afbeelding toevoeging plugin starten door het selecteren van "proces | Rekenmachine Plus ".
    4. Selecteer de afbeeldingsstapel myofibril als i1, de mitochondriën beeld van stapel als i2, en kies de "Toevoegen"-operator. Klik op "OK".
    5. Nadat een nieuwe afbeeldingsstapel vertegenwoordigen van het resultaat van 4.5.4 verschijnt, selecteert u "bewerken | Omkeren"voor de productie van een vergelijkbaar figuur 6Aafbeeldingsstapel.
  6. Laad het bestand met de binaire afbeeldingsstapel van de kloof tussen de myofibrils- en mitochondriën door het indrukken van de knop "RyRGapsFile" op het CardiacCellMeshGenerator-programma.
  7. Druk op "Genereren Mesh" op de GUI. Dit zal leiden tot de opdracht v2m van de iso2mesh met de optie 'cgalmesh' voor het genereren van een tetraëdrische mesh vergelijkbaar met figuur 4E. Drie bestanden zullen worden uitgevoerd aan het eind van deze stap: een .ele-bestand, een bestand .face en een .node-bestand waarin u de lijst van knooppunten die deel uitmaken van de elementen, de knooppunten die deel van de gezichten uitmaken, en de coördinaten van de knooppunten , respectievelijk.

5. wiskundig kaart de ruimtelijk-variërende dichtheid van Ion-kanalen van belang op de eindige elementen Mesh.

  1. De nodige input voor de RyR-Simulator genereren door het indrukken van de knop geëtiketteerd genereren RyR-Simulator ingangen van de GUI.
    Opmerking: De knop zal leiden tot een functie generateRyRsimulatorInputs.m, die de volgende gegevens van stap 4 gebruikt voor het genereren van de ingangen:
    (1) outDir: de locatie waar u wilt output-bestanden die nodig voor RyR cluster simulatie zijn.
    (2) imres: de pixelresolutie in de drie richtingen van de afbeeldingsstapels.
    (3) myofibril_file: het bestand met de binaire afbeeldingsstapel dergelijks getoond in figuur 4B.
    (4) sarcolemma_file: het bestand met de binaire afbeeldingsstapel dergelijks getoond in figuur 4A.
    (5) ryrgaps_file: het bestand met de binaire afbeeldingsstapel dergelijks getoond in figuur 5A.
    1. Nadat deze functie uitvoert, controleert u dat de volgende bestanden zijn gemaakt binnen de map hebt opgegeven als standaardpad voor outDir:
    • d_axial_micron.txt, die de axiale afstand tussen de positie van de z-schijf en de rest van de pixels in de afbeelding stack aangeeft.
    • d_radial_micron.txt, die de Euclidische afstand vertegenwoordigt (met uitzondering van de axiale component) van elke pixel in de set van mogelijke RyR cluster locaties tot de pixels op het vlak van de z-disc.
    • W_micron.txt, die representatief is voor de lijst van de ruimtelijke coördinaten van alle beschikbare posities voor RyR clusters aanwezig te zijn.
    • De resterende 3 bestanden in de map bevatten het achtervoegsel "_pixel" in plaats van "_micron" om aan te duiden dat de waarden in deze bestanden zijn geschreven uit in pixel coördinaat vorm.
  2. Simuleren RyR cluster distributies op de binaire afbeeldingsstapel van myofibrils.
    1. Druk op de knop "Open RyR-simulator in R" geëtiketteerd om de R-programma te starten.
    2. Op de R-gui, selecteer "bestand | Open"en zoek het bestand 'instellingen. R"binnen de RyR-Simulator-pakket (RyR-Simulator/bron/instellingen. R).
    3. Ook het openen van het bestand ryr-simulator-parallel. R (gevestigd te RyR-Simulator/bron/ryr-simulator-parallel. R). omgevingen zoals Rstudio (https://www.rstudio.com) of een eenvoudige opdrachtregelinterface kan worden gebruikt, bijvoorbeeld met de opdracht R64 in een shell of een command venster.
    4. De parameters in de instellingen wijzigen. R bestand als gedetailleerde hieronder:
      1. Ingesteld pad2 op het adres van de map waarin de bestanden vermeld in 5.1.2 voor een experimenteel verworven confocal afbeeldingsstapel van RyR clusters en myofibrils.
        Opmerking: De github repository map-bestanden/master-invoercel / al bestanden bevat die zijn gegenereerd voor een eerder verzamelde afbeeldingsstapel.
      2. Stel Path4 naar een adres van de map waar de bestanden die zijn gegenereerd in stap 5.1.2 zijn opgeslagen.
      3. Path3 punt op een map waar de gebruiker wil dat de gesimuleerde RyR cluster locaties om gered te worden ingesteld.
      4. Verzameling N het aantal RyR clusters gesimuleerd moet worden in het model (meestal in het bereik van 200 tot 300).
      5. Instellen van Compostelle, een tolerantie instellen, voor het verschil tussen de experimenteel gemeten ruimtelijke spreiding van RyR clusters en de ruimtelijke spreiding van model gesimuleerd van RyR clusters.
      6. NumIter te beperken van het aantal pogingen dat de RyR-Simulator nemen moet om het vinden van een gesimuleerde RyR cluster patroon dat voldoet aan de Compostelle waarde instellen
        Opmerking: Waarden voor Compostelle en numIter hebben ingesteld op typische waarden binnen de instellingen. R bestand.
      7. NumPatterns ingesteld op het aantal verschillende RyR cluster patronen die de gebruiker wil simuleren (meestal, het is nuttig praktijk simuleren 99 patronen voor statistische vertrouwen).
      8. Instellen van numCores om het gebruik van meerdere CPU threads (cores) voor snellere parallelle verwerking met R te simuleren de punt patronen.
    5. Controleer of de volgende pakketten zijn geïnstalleerd met behulp van package installer gui in R: sneeuw, doSNOW, doparallel, foreach, iterators en rgl.
    6. De simulator uitvoeren door het invoeren van het volgende commando in het opdrachtvenster R: bron (' pad naar ryr-simulator-parallel. R', chdir = TRUE)
      Opmerking: De output van het programma RyR-Simulator is een lijst van txt-bestanden (een numPatterns-bestand wordt gegenereerd) coördinaat lijsten in N rijen bevatten en 3 kolommen, die de x-, y- en z-coördinaten van de N vertegenwoordigen gesimuleerde RyR clusters.
  3. Kaart punten als ruimtelijke dichtheden op een computationele model met behulp van de CardiacCellMeshGenerator.
    1. Door het selecteren van de knop geëtiketteerd "Selecteer RyR punten bestand", kies een gesimuleerde RyR cluster distributie tekstbestand die uitgevoerd door de RyR-Simulator werden.
    2. Uitvoeren "RyR dichtheid Mapper" op de GUI in MATLAB. Dit zal de ruimtelijke locaties van de gesimuleerde RyR clusters in het txt-bestand in stap 5.3.1 op de Maas van eindige elementen die werd gegenereerd in stap 4.8 met behulp van een methode met de naam van een sferische kernel intensiteit schatter methode26kaart.
      Opmerking: De uitvoer van deze stap is een bestand met de extensie .txt die een lijst met waarden voor de numerieke dichtheid van het ion-kanaal per eenheid sferische volume aan elk van de computationele mesh-knooppunten bevat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 2 t/m Figuur 7 bieden representatieve resultaten van verscheidene belangrijke stappen in dit protocol: (i) visualiseren en heroriënteren weefsel blokken voor transversale elektronenmicroscopie opvattingen; (ii) het genereren van een afbeeldingsstapel 3D elektronenmicroscopie; (iii) het segmenteren van sub cellulaire ultrastructuur voor organellen van belang; (iv) generatie van de maaswijdte van een eindige elementen met be...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bovenstaande protocol worden belangrijke stappen voor het genereren van een roman eindige elementen geometrische model van cardiomyocyte ultrastructuur beschreven. De methode kunt computationele fusie van verschillende microscopie (of, in principe, andere gegevens) modaliteiten te ontwikkelen van een meer omvattende computational model van cardiomyocyte dynamiek waarin details van ruimtelijke cel het platform. Er is momenteel geen andere protocol beschikbaar voor het maken van een dergelijk model van een cardiomyocyt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de Koninklijke Maatschappij van Nieuw-Zeeland Marsden snel starten subsidie 11-UOA-184, de menselijke grenzen Science programma Research grant RGP0027/2013 en de Australische onderzoek Raad Discovery Project Grant DP170101358.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materialen
NatriumchlorideSigma-Aldrich746398
CalciumchlorideSigma-AldrichC8106
MagnesiumchlorideSigma-AldrichM2393
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS5761
KaliumchlorideSigma-AldrichP5405
DextroseSigma-AldrichD9434
NatriumhydroxideSigma-AldrichS8045
ProbenecideSigma-AldrichP8761
2,3-Butaanedion monoximeSigma-AldrichB0753
25% glutaraldehyde EM Grade (fles van 500 ml)Merck354400-500ML
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
TanninezuurSigma-Aldrich403040-500G100 g EM-kwaliteit
NatriumcacodylateSigma-AldrichC0250
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Sigma-AldrichP4593
OsmiumtetrooxideSigma-Aldrich75632-10ML4% in water, fles van 5 ml (of fles van 10 ml ook beschikbaar)
UranylacetaatEM Sciences22400fles van 25 g
KaliumferrocyaanMerck Millipore104973
TolueenblauwSigma-AldrichT3260
BoraxSigma-AldrichS9640ook wel natriumboraat genoemd
EthanolSigma-Aldrich792780Verdund tot verschillende percentages met zuiver water
AcetonEM SciencesRT10017
HarskitEM Sciences14040ACM Durcupan werkt goed
ZoutzuurSigma-AldrichH98921 normale oplossing
Apparatuur
UltramicrotoomLeicaEM UC7
Transmissie-elektronenmicroscoopThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
RetortstandaardProscitechT752
BuisjesBioStrategy75831-346voor langendorff-perfusieapparaat, diameter van 3 mm wordt aanbevolen maar is niet essentieel
KraanjesSDRQP13813voor langendorff-buisjes; product is slechts een voorbeeld, gebruiker kan elk willekeurig product selecteren
retortstandaardklemmenProscitechT715
Kunststof spuitenSDRQPC1108voor oplossingen op langendorff-apparaat
Cannulatiezijde 7-0TeleFlex15B051000voor het vastbinden van het hart op het langendorff-apparaat
CanuleGemaakt van stalen naald met een buitendiameter van 3 mm
Rubberen petrischaalmatProscitechH068voor gebruik als snijplank tijdens het dissecteren van een vast hart
ScheermesjesProscitechL056voor het snijden van een vast hart in kleine blokjes voor EM-verwerking
Glazen flessenBioStrategy89000-236voor het opslaan van oplossingen tijdens weefselfixatie en verwerking voor EM
BekersBioStrategy213-0477voor het tijdelijk opslaan van oplossingen en tijdens perfusie
ScintillatiebuisjesBioStrategy548-2170voor weefselmonsters tijdens EM-verwerking
DissectiesetProscitechT161voor dierdissectie
SpuitfiltersProscitechWS3-02225Svoor zuivering van uranylacetaat
Aluminium/zilverfolie bakbekersVan elke bakproductenwinkel
Dupont Diamond mesBioStrategy102680-78035 graden hoek versie produceert de beste secties.
Colloidaal goudBBI SolutionsEM. GC1515 nm colloïdaal goud
EM-gaasrastersProscitechGCU150een verscheidenheid aan maten kan worden getest: GCU150h, GCU200h bijvoorbeeld
Kunststof wegwerpspuitenProscitechLCH20het beste om plastic wegwerpartikelen te gebruiken, vooral bij het werken met hars
Software
SerialEMUniversity of Bouldertomografie-acquisitie
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODUniversity of Boulderbeelduitlijning en segmentatie
iso2meshbeschikbaar op http://iso2mesh.sourceforge.net
Fiji of vergelijkbare beeldverwerkingssoftwareImageJFiji is Just Image Jbeschikbaar op https://fiji.sc voor manipulatie van binaire beeldstacks
RyR-Simulator codes/dataCellSMB groupbeschikbaar op https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGeneratorCellSMB groupwordt geleverd met RyR-Simulator onder de map "gui-version"
R-statistiekensoftwareR-projectDownloaden van https://www.r-project.org
spatstatR-projectinstalleren via R-programma
rglR-projectinstalleren via R-programma
doparallelR-projectinstalleren via R-programma
foreachR-projectinstalleren via R-programma
doSNOWR-projectinstalleren via R-programma
iteratorsR-projectinstalleren via R-programma

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
  2. Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
  3. Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
  4. Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
  5. Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
  6. Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
  7. Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
  8. Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
  9. González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
  10. Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
  11. Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
  12. Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
  13. Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
  14. Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
  15. Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
  16. Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
  17. Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
  18. Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417(2015).
  19. Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
  20. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  21. Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
  22. Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908(2015).
  23. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
  24. Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
  25. He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
  26. Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
  27. Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
  28. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  29. Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
  30. Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
  31. LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
  32. Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
  33. Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
  34. Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Finite Element ModelCardiomyocyte ArchitectureElectron TomographyConfocal MicroscopyCellular ArchitectureCalcium SignalingMitochondrial BioenergeticsRyR Cluster SimulationImage SegmentationMesh Generation

Related Articles