Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde gestandaardiseerde protocol voor high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. Het protocol introduceert een protocol van het geïntegreerde, geüniformeerde haalbaar en goedkoop vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Dit protocol maakt analyse van grote aantallen monsters met strenge normen en diverse besturingselementen.

Samenvatting

De menselijke intestinale microbiome speelt een centrale rol bij de bescherming van cellen tegen verwonding, bij de verwerking van energie en voedingsstoffen en bij de bevordering van immuniteit. Afwijkingen van wat wordt beschouwd als een gezonde microbiota samenstelling (dysbiosis) kunnen de vitale functies leidt tot pathologische voorwaarden schaden. De karakterisatie van associaties tussen microbiële samenstelling en de menselijke gezondheid en ziekte hebben recente en aanhoudende onderzoeksinspanningen is gericht.

Voorschotten in high-throughput sequencing technologieën inschakelen karakterisering van de microbiële samenstelling van gut. Deze methoden omvatten 16S rRNA-amplicon sequencing en shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing wordt gebruikt om het profiel van taxonomische samenstelling, terwijl geweer sequencing aanvullende informatie over gene voorspellingen en functionele annotatie bevat. Een voordeel bij het gebruik van een methode gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA gene variabele regio is de aanzienlijk lagere kosten in vergelijking met jachtgeweer sequencing. Reeks verschillen in het 16S rRNA gen worden gebruikt als een microbiële vingerafdruk te identificeren en kwantificeren van de verschillende taxa binnen een afzonderlijke monster.

Grote internationale inspanningen hebben normen voor 16S rRNA-amplicon sequencing ingeroepen. Verschillende studies verslag echter een gemeenschappelijke bron van variatie, veroorzaakt door batch effect. Om te minimaliseren van dit effect, geüniformeerde protocollen voor sample collectie, moeten verwerking, en volgorde worden uitgevoerd. Dit protocol stelt de integratie van algemeen gebruikte protocollen fecale sample collectie vanaf tot data-analyses. Dit protocol bevat een kolom-vrij, direct-PCR aanpak waarmee gelijktijdige behandeling en DNA-extractie van grote aantallen fecale monsters, samen met PCR versterking van de V4-regio. Bovendien, het protocol beschrijft de analyse-pijpleiding en bevat een script met behulp van de nieuwste versie van QIIME (QIIME 2 versie 2017.7.0 en DADA2). Dit stapsgewijze protocol is gericht op diegenen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van het 16S rRNA-amplicon sequencing starten in een robuuste, reproductieve, makkelijk te gebruiken en gedetailleerde manier begeleiden.

Inleiding

Geconcentreerde inspanningen hebben gedaan om microbiome diversiteit en abundantie, als een ander aspect van het vastleggen van verschil en overeenkomsten tussen particulieren in gezonde en pathologische omstandigheden beter te begrijpen. Leeftijd^2,3, geografie⁴, levensstijl^5,6en ziekte⁵ werden getoond kunnen worden betrokken bij de samenstelling van de microbiome van de darm hebben, maar veel voorwaarden en populaties nog niet volledig gekenmerkt. Er werd onlangs gemeld dat de microbiome kan worden gewij....

Protocol

Ethische goedkeuring voor de studie werd verleend door de ethische commissie voor Sheba lokale onderzoek en alle methoden werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Het protocol ontvangen een uitzondering van de patiënt toestemming van de plaatselijke ethische Review Board, sinds de fecaal materiaal die gebruikt werden waren reeds voorgelegd aan de kern van de microbiologie als onderdeel van de klinische workup en zonder identificeerbare patiënteninformatie dan leeftijd, geslacht en microbiële resultaten. Geschreven, geïnformeerde toestemming was verkregen uit gezonde vrijwilligers en de institutionele Review Board goedgekeurd de studie. Somm....

Resultaten

Een schematische illustratie van het protocol is afgebeeld in Figuur 1.

We hebben prospectief kruk monsters van gehospitaliseerde patiënten met vermoedelijke infectieuze diarree verzameld. Deze monsters werden ter beschikking gesteld aan de klinische microbiologie Lab aan het Sheba Medical Center tussen februari en mei 2015, zoals eerder beschreven¹was. Kruk monsters werden o.......

Discussie

16S rRNA-amplicon en metagenomics jachtgeweer sequencing hebben opgedaan populariteit in klinische microbiologie toepassingen^21,22,23. Deze technieken zijn voordelig in hun toegenomen capaciteit om te vangen culturable en niet-culturable taxa, verstrekken van gegevens over de relatieve abundantie van de pathogene entmateriaal en hun vermogen om te identificeren nauwkeuriger een besmettelijke polymicrobial vingerafdruk²⁴. De vooruitgang op .......

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Primers	Integrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solution	Sigma-Aldrich	E7526
Dilution solution	Sigma-Aldrich	D5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit	KAPABIOSYSTEMS	KK2601	PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit	Invitrogen	P7589	dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kit	Qiagen	28606
Agarose	Amresco	0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free	Biological Industries	01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kit	Molecular probes	Q32854	dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000	Agilent Technologies	Screen Tape 5067-5582	separation and analysis
Screen Tape Assay	Agilent Technologies	Reagents 5067-5583	for DNA libraries
PhiX Control v3	Illumina	15017666	control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)	Illumina	MS-102-2003
Ethidium Bromide	Amresco	E406-10mL-TAM
2 mL collection tubes	SARSTEDT	72.695.400	Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tube	STERILE INTERIOR	23117
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PCR Machine	Applied Biosystems	2720 Thermal Cycler
Sequncing Machine	Illumina	Miseq
PCR workstation	Biosan	UV-cleaner
scissors
vortexer	Scientific Industries	Vortex-Genie 2

```