Methodenartikel

Begeleide Protocol voor fecale microbiële karakterisering door 16S rRNA-Amplicon Sequencing

DOI:

10.3791/56845

⸱

19 maart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sheba Medical Center, 2Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 3Ariel University, 4Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerde gestandaardiseerde protocol voor high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. Het protocol introduceert een protocol van het geïntegreerde, geüniformeerde haalbaar en goedkoop vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Dit protocol maakt analyse van grote aantallen monsters met strenge normen en diverse besturingselementen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De menselijke intestinale microbiome speelt een centrale rol bij de bescherming van cellen tegen verwonding, bij de verwerking van energie en voedingsstoffen en bij de bevordering van immuniteit. Afwijkingen van wat wordt beschouwd als een gezonde microbiota samenstelling (dysbiosis) kunnen de vitale functies leidt tot pathologische voorwaarden schaden. De karakterisatie van associaties tussen microbiële samenstelling en de menselijke gezondheid en ziekte hebben recente en aanhoudende onderzoeksinspanningen is gericht.

Voorschotten in high-throughput sequencing technologieën inschakelen karakterisering van de microbiële samenstelling van gut. Deze methoden omvatten 16S rRNA-amplicon sequencing en shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing wordt gebruikt om het profiel van taxonomische samenstelling, terwijl geweer sequencing aanvullende informatie over gene voorspellingen en functionele annotatie bevat. Een voordeel bij het gebruik van een methode gerichte sequentiebepaling van het 16S rRNA gene variabele regio is de aanzienlijk lagere kosten in vergelijking met jachtgeweer sequencing. Reeks verschillen in het 16S rRNA gen worden gebruikt als een microbiële vingerafdruk te identificeren en kwantificeren van de verschillende taxa binnen een afzonderlijke monster.

Grote internationale inspanningen hebben normen voor 16S rRNA-amplicon sequencing ingeroepen. Verschillende studies verslag echter een gemeenschappelijke bron van variatie, veroorzaakt door batch effect. Om te minimaliseren van dit effect, geüniformeerde protocollen voor sample collectie, moeten verwerking, en volgorde worden uitgevoerd. Dit protocol stelt de integratie van algemeen gebruikte protocollen fecale sample collectie vanaf tot data-analyses. Dit protocol bevat een kolom-vrij, direct-PCR aanpak waarmee gelijktijdige behandeling en DNA-extractie van grote aantallen fecale monsters, samen met PCR versterking van de V4-regio. Bovendien, het protocol beschrijft de analyse-pijpleiding en bevat een script met behulp van de nieuwste versie van QIIME (QIIME 2 versie 2017.7.0 en DADA2). Dit stapsgewijze protocol is gericht op diegenen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van het 16S rRNA-amplicon sequencing starten in een robuuste, reproductieve, makkelijk te gebruiken en gedetailleerde manier begeleiden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geconcentreerde inspanningen hebben gedaan om microbiome diversiteit en abundantie, als een ander aspect van het vastleggen van verschil en overeenkomsten tussen particulieren in gezonde en pathologische omstandigheden beter te begrijpen. Leeftijd2,3, geografie4, levensstijl5,6en ziekte5 werden getoond kunnen worden betrokken bij de samenstelling van de microbiome van de darm hebben, maar veel voorwaarden en populaties nog niet volledig gekenmerkt. Er werd onlangs gemeld dat de microbiome kan worden gewijzigd voor therapeutische toepassingen7,8,9. Daarom, meer inzicht in de relatie tussen verschillende fysiologische omstandigheden en de microbiële samenstelling is de eerste stap naar optimalisatie van de potentiële toekomstige wijzigingen.

De traditionele microbiële cultuur worden beperkt door lage opbrengst10,11, methodenen worden geconceptualiseerd als een binaire staat waar een bacterie is ofwel presenteren in de darm, of niet. High-throughput DNA gebaseerde sequencing heeft een revolutie teweeggebracht in microbiële ecologie, toelatend de vang van alle leden van de microbiële Gemeenschap. Nochtans, Las volgorde lengte en kwaliteit blijven belangrijke belemmeringen voor nauwkeurige taxonomie toewijzing12. High-throughput gebaseerde experimenten kunnen bovendien lijden van batch-effecten, waar metingen worden beïnvloed door niet-biologische of niet-wetenschappelijke variabelen13. In de afgelopen jaren zijn verschillende programma's vastgesteld om te bestuderen van de menselijke microbiome, met inbegrip van het Amerikaanse Gut-project, de menselijke Microbiome-Project van Verenigde Staten (VS) en het Verenigd Koninkrijk (UK)-MetaHIT-project. Deze initiatieven hebben gegenereerd grote hoeveelheden gegevens die niet gemakkelijk vergelijkbaar te wijten aan een gebrek aan samenhang in hun aanpak. Een scala aan internationale projecten zoals de International menselijke Microbiome Consortium, het project van de standaarden voor de menselijke Microbiome, en de National Institute of Standards and Technology (NIST) geprobeerd om enkele van deze kwesties14 , en de normen voor metingen van de microbiome waarmee de verwezenlijking van betrouwbare reproductieve resultaten moeten ontwikkeld. Hier wordt beschreven, is een geïntegreerde protocol verschillende algemeen gebruikte methoden15,16 voor het 16S rRNA high-throughput sequencing (16S-seq) vanaf fecale sample collectie door middel van data-analyses. Het protocol beschrijft een kolom-vrije PCR-aanpak, oorspronkelijk ontworpen voor directe extractie van plantaardige DNA16, zodat de gelijktijdige behandeling van grote aantallen fecale monsters in een relatief korte tijd met hoge kwaliteit versterkt DNA voor gerichte rangschikking van de microbiële variabele V4 regio op een gemeenschappelijk platform van de sequencing. Dit protocol is gericht op het begeleiden van de wetenschappers ook geïnteresseerd in de inleiding van het gebruik van het 16S rRNA-amplicon sequencing in een robuuste, reproductieve, makkelijk te gebruiken en gedetailleerde manier, belangrijke besturingselementen gebruiken. Na een begeleide en gedetailleerde stap-by stap protocol batch effect kan minimaliseren en dus meer vergelijkbare rangschikkend resultaten tussen labs zal toestaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethische goedkeuring voor de studie werd verleend door de ethische commissie voor Sheba lokale onderzoek en alle methoden werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Het protocol ontvangen een uitzondering van de patiënt toestemming van de plaatselijke ethische Review Board, sinds de fecaal materiaal die gebruikt werden waren reeds voorgelegd aan de kern van de microbiologie als onderdeel van de klinische workup en zonder identificeerbare patiënteninformatie dan leeftijd, geslacht en microbiële resultaten. Geschreven, geïnformeerde toestemming was verkregen uit gezonde vrijwilligers en de institutionele Review Board goedgekeurd de studie. Sommige van deze monsters zijn al opgenomen in een vorige analyse1.

1. sample Handling

  1. Een ongeveer 5 mm2 uitstrijkje (ongeveer de grootte van een potlood gum) uit een vers fecale monster met een steriel doekje in een test tube verzamelen (Zie Tabel van materialen). Bewaar alle swabs met fecale monsters bij-80 ° C binnen 24 uur. De fecale swabs kunnen er blijven totdat zij worden verwerkt.

2. DNA-extractie

  1. De extractie en verdunning oplossingen op kamertemperatuur ontdooien (Zie Tabel van materialen).
  2. Overdracht het fecale staafje in een verzameling lege 2 mL tube (Zie Tabel van materialen). De swab stick grootte aanpassen door te snijden met behulp van een schone schaar om sluiting van de buis met minimale kruisbesmetting. 250 μL van de extractievloeistof toevoegen aan elke buis van de collectie met de fecale doekje en vortex te mengen.
  3. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten in een kokend waterbad (95-100° C). Voeg toe 250 μL van verdunning oplossing aan elk monster en de vortex te mengen.
  4. Opslaan van de 2 mL tubes met de geëxtraheerde DNA en het staafje bij 4 ° C.

3. PCR en voorbereiding van de bibliotheek

Voor stap 3.1 en 3.2, werkomgeving in een PCR-workstation dat schone biedt, sjabloon en amplicon gratis.

  1. Label de inleidingen (tabel 1) volgens hun barcode. Verdun elk primer in dubbel gedestilleerd water (DDW) om een 50 μM concentratie en sla bij-20 ° C.
  2. Een 96-wells-plaat gebruiken voor PCR reacties. Elke plaat kan 32 verschillende monsters, die zijn gelabeld door 32 verschillende index inleidingen bevatten. De voorwaartse primer en de 32 omgekeerde inleidingen op kamertemperatuur ontdooien en vul ze tot 5 μM.
  3. Bereid de PCR reactie mixen voor 100 reacties (eindvolume in elk putje zullen 20 μl) door het mengen van 100 μl van 5 μM Forward primer, 1 mL 2 X PCR Master mix en 400 μL DDW. Zet 15 μL van deze PCR-mix in elk putje (in totaal 96-wells). Breng 1 μL van elk 5 μM Reverse geïndexeerde primer in 3 verschillende putjes (32 verschillende inleidingen in triplicates geeft een totaal van 96-wells).
  4. In een specifieke zone van pre-PCR, wat betekent dat een schone bankje thats sjabloon en amplicon gratis, Voeg 4 μL van elk geëxtraheerde DNA-monster aan reactie mengsels (elk geëxtraheerde DNA-monster wordt versterkt in drievoud — 32 monsters per 96-wells-plaat).
  5. PCR uitgevoerd met de volgende instellingen: eerste denaturatie van 94 ° C gedurende 3 minuten; gevolgd door 35 cycli van denaturatie bij 94 ° C voor 1 min, gloeien bij 55 ° C gedurende 1 minuut en uitbreiding bij 72 ° C gedurende 1 min; en een laatste uitbreiding bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
  6. Combineren op een andere bank, die zal worden gedefinieerd als een specifieke zone van post-PCR, elke drievoudige PCR-reactie in een enkel volume buis (60 μL per monster).
  7. Om te beoordelen van de kwaliteit van PCR waarbij, 4 μL van elke combinatie-PCR reactie worden uitgevoerd op een ethidium bromide gebeitste 1% agarose gel. Onder UV golflengte van 260 nm, de positieve waarbij zal verschijnen in een verwachte band grootte van 375-425 bp. Alleen deze waarbij zal worden opgenomen in de volgende stappen.
    Opmerking: Elk monster wordt versterkt in drievoudige, betekenis dat elk monster wordt versterkt in 3 verschillende PCR reacties. Niet schaalbaar.

4. bibliotheek kwantificering en reiniging

  1. Om een mengsel concentratie zwembad van alle monsters van PCR, kwantificeren elk amplicon door een dubbele gestrande DNA (dsDNA kwantificeren reagens) TL nucleïnezuur vlek (Zie Tabel of Materials), geschikt voor de gelijktijdige kwantificering van een grote bedrag van de monsters.
    Opmerking: Aangezien het bereik van de grootte van het amplicon dubbelzinnig is, wordt het werkelijke bedrag in nanogram gebruikt voor het laden van een mengsel concentratie.
  2. Combineer 500 ng van elk monster in een enkele, steriele buis. Vortex te mengen.
  3. Voer 200 μL van de gebundelde bibliotheek op een Ethidium Bromide gebeitste 1% agarose gel. Pak de 375-425 bp bands uit de gel met een gel-kit voor extractie volgens de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen) en elueer de gepoolde bibliotheek in 80 μL DDW.
    Opmerking: De gepoolde bibliotheek moet grootte geselecteerd om niet-specifieke versterking producten vanaf host DNA.
  4. Meten van de concentratie van de definitieve bibliotheek met behulp van een hooggevoelige dsDNA detectie kit volgens de instructies van de fabrikant (Zie Tabel van materialen). De grootte van de nauwkeurige bibliotheek met behulp van een hooggevoelige scheiding en analyse kit voor DNA bibliotheken volgens de instructies van de fabrikant meten (Zie Tabel van materialen).

5. sequencing

  1. Verdun de gepoolde bibliotheek tot 19u met toevoeging van 20% controle bibliotheek (Zie Tabel of Materials), volgens het protocol van de machine sequencing.
  2. Gebruik aangepaste ontworpen Lees voor sequencing, inleidingen die gratis naar de V4 amplificatie inleidingen (Zie tabel 1).
  3. Gebruik een derde aangepaste ontworpen sequencing primer die luidt de barcode in een extra cyclus (Zie tabel 1) en genereert gekoppeld-einde leest van 175 bases in lengte in elke richting, volgens de specificaties van de fabrikant.
  4. Start de machine sequencing en FASTQ bestanden volgens protocol van de fabrikant te verkrijgen.

6. verwerking van de gegevens

  1. Stik en verwerken van de overlappende gekoppeld-end FASTQ bestanden in een gegevens curatie pijpleiding uitgevoerd in QIIME 2 versie 2017.7.017. Demultiplex het luidt volgens monster specifieke barcodes.
  2. DADA218 wordt gebruikt voor kwaliteitscontrole en volgorde variant (SVs) detectie. Afkappen leest op 13 bases van de 3'-eind en 15 honken na 5', discard leest met meer dan 2 verwachte fouten. Identificeren en verwijderen van de Chimaera met behulp van de methode van consensus — Chimaera worden gedetecteerd in monsters individueel en sequenties gevonden chimeer in een voldoende aantal monsters worden verwijderd.
  3. Uitvoeren van SVs taxonomische classificatie op basis van een classificatie Naive Bayes uitgerust, opgeleid op de augustus 2013 99% identiteit Greengenes database6, voor 175 lang leest en de vooruit-/ achteruitspoelen primer instellen.
  4. Rarefy alle monsters diepte van 2,146 sequenties.
  5. Gebruik ongewogen UniFrac voor meting van β-diversiteit (tussen monster diversiteit19,20) op de ijle monsters, om te voorkomen dat een steekproef-grootte-effect.
  6. Gebruik de resulterende matrix van afstand voor het uitvoeren van een analyse van de belangrijkste coördinaten (PCoA).
    Opmerking: De gegevensverwerking script en mapping-bestanden worden geleverd als aanvullend materiaal (aanvullend materiaal 1 en 2).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische illustratie van het protocol is afgebeeld in Figuur 1.

We hebben prospectief kruk monsters van gehospitaliseerde patiënten met vermoedelijke infectieuze diarree verzameld. Deze monsters werden ter beschikking gesteld aan de klinische microbiologie Lab aan het Sheba Medical Center tussen februari en mei 2015, zoals eerder beschreven1was. Kruk monsters werden o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

16S rRNA-amplicon en metagenomics jachtgeweer sequencing hebben opgedaan populariteit in klinische microbiologie toepassingen21,22,23. Deze technieken zijn voordelig in hun toegenomen capaciteit om te vangen culturable en niet-culturable taxa, verstrekken van gegevens over de relatieve abundantie van de pathogene entmateriaal en hun vermogen om te identificeren nauwkeuriger een besmettelijke polymicrobial vingerafdruk24. De vooruitgang op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het programma van de ik-CORE (verleent nr. 41/11), de Israël Science Foundation (grant nr. 908/15), en de Europese ziekte van Crohn en Colitis organisatie (ECCO).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solutionSigma-AldrichE7526
Dilution solutionSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kitInvitrogenP7589dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kitQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kitMolecular probesQ32854dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000Agilent TechnologiesScreen Tape 5067-5582separation and analysis
Screen Tape AssayAgilent TechnologiesReagents 5067-5583for DNA libraries
PhiX Control v3Illumina15017666control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)IlluminaMS-102-2003
Ethidium BromideAmrescoE406-10mL-TAM
2 mL collection tubesSARSTEDT72.695.400Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tubeSTERILE INTERIOR23117
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR MachineApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
scissors
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
  2. De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
  3. Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
  4. Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050(2015).
  5. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
  6. McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
  7. Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
  8. Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
  9. Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
  10. Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
  11. Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
  12. Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
  13. Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
  14. Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
  15. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
  16. Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
  17. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  18. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
  21. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617(2015).
  22. Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
  23. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
  24. Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226(2013).
  25. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

16S rRNA ampliconsequencingverzameling van fecesmonstersDNA extractiePCR amplificatieV4 regioQIIME 2DADA2bibliotheekpreparatiegelelektroforeseprincipale co rdinaatanalyse

Gerelateerde artikelen