Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Samenvatting

Een standaard Western blotting protocol is geoptimaliseerd voor het analyseren van slechts 500 hematopoietische stamcellen of voorlopercellen. Optimalisatie houdt zorgvuldige behandeling van het monster van de cel, beperking van de overdracht tussen buizen en direct het lysing van cellen in Laemmli monster buffer.

Samenvatting

Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn zeldzame cellen, met de muis het beenmerg met slechts 25.000 ~ fenotypische lange termijn repopulatie HSCs. Een westelijke bevlekkende protocol werd geoptimaliseerd en geschikt voor de analyse van kleine aantallen HSCs (500-15.000 cellen). Fenotypische HSCs werden gezuiverd, nauwkeurig geteld en direct lysed in Laemmli monster buffer. Lysates met gelijke aantallen cellen werden geanalyseerd door elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-pagina), en de vlek was bereide en verwerkte na standaard Westelijke Bevlekkende Protocollen. Met behulp van dit protocol, 2.000-5.000 HSCs kan routinematig worden geanalyseerd, en in sommige gevallen kunnen gegevens worden verkregen uit zo weinig als 500 cellen, in vergelijking met de cellen van de 20.000 tot 40.000 gemeld in de meeste publicaties. Dit protocol gelden over het algemeen andere hematopoietische cellen en maakt de routinematige analyse van kleine aantallen cellen met behulp van standaard laboratorium procedures.

Inleiding

Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn zichzelf vernieuwende cellen die aanleiding tot alle bloed geslachten geven kunnen. Ze zijn relatief zeldzaam cellen in het beenmerg, waardoor biochemische analysen moeilijk. Benaderingen die geschikt zijn voor het analyseren van zeldzame cellen, zoals de stroom cytometry, zijn uiterst nuttig voor het kwantificeren van de relatieve hoeveelheden van cel oppervlakte markeringen en intracellulaire eiwitten. Echter, de analyse van intracellulaire eiwitten vereist het gebruik van cel permeabilization procedures antilichaam-toegang inschakelen, en niet alle cel oppervlakte epitopes overleven deze procedures^1,2. Bovendien antilichamen die onderscheid tussen verschillende isoforms of decolleté eiwitproducten maken zijn vaak niet beschikbaar voor stroom cytometry en daarom onderzoekers nog steeds rekenen op Western blots voor bepaalde soorten analyses.

Westelijke vlekkenanalyse van cel lysates is een routineprocedure in de meeste laboratoria. Cellen onder inheemse voorwaarden die de epitopes van cel-oppervlakte molecules bewaren kunnen worden gezuiverd, en cel lysates kan vervolgens worden voorbereid en geanalyseerd. De analyse van eiwitten in zeldzame primaire cel populaties door Western blot kunt echter verplicht stellen grote aantallen dieren om voldoende cellen euthanizing. Door kleine aanpassingen aan de verschillende stappen, was een conventionele westelijke bevlekkende protocol kundig voor speurder eiwitten in relatief kleine aantallen HSCs (500-15.000, afhankelijk van de proteïne van belang). De aanpassingen omvatten nauwkeurig tellen de cellen, zorgvuldig hanteren de cel pellet, vermindering van de overdracht van cellen tussen buizen tot een minimum beperken van het verlies van de cel, en een bepaald aantal cellen met een geconcentreerde laden lysing buffer met proteasoom en phosphatase inhibitors. Vele gepubliceerde rapporten omvatten Western blots verkregen met 20.000 of meer HSCs^3,4,5,6,7; deze eenvoudige procedure zal het verminderen van het aantal cellen en proefdieren nodig voor de productie van gelijkwaardige gegevens door tussen 4 en 40-voudige. Het protocol is ontworpen voor het normaliseren van resultaten op basis van de per cel, in plaats van aan een interne controle. Hierdoor kan de detectie van algemene verlagingen eiwitniveaus die worden over het hoofd gezien kunnen als gegevens worden genormaliseerd naar een interne controle. Het belang van normalisatie op basis van de per cel werd beschreven voor de analyse van gen expressie gegevens⁸, en hetzelfde principe geldt voor het kwantificeren van de eiwitten door westelijke vlek. Dit geoptimaliseerd protocol moet zinvol zijn voor iedereen die voor het analyseren van kleine aantallen cellen.

Protocol

Alle procedures moeten worden uitgevoerd overeenkomstig de institutionele dierlijke gebruik en zorg richtsnoeren. De procedure werd ontwikkeld voor de analyse van lymfkliertest hematopoietische stamcellen en voorlopercellen cellen (HSCs en HPs), maar kan worden aangepast voor de analyse van andere cel populaties.

1. Stroom Cytometry Isolatievan lymfkliertest HSCs en HPs

1. Oogst lymfkliertest beenmergcellen zoals beschreven in de literatuur⁶.
   Opmerking: In de gegevens in Figuur 1 en Figuur 2, beenmerg werd geoogst van C57BL/6J muizen.
2. Uitvoert afkomst uitputting van beenmergcellen met behulp van een muis lineage uitputting kit, na instructies van de fabrikant.
3. Incubeer de cellen met antistoffen tegen de cel oppervlakte markers van belang als beschreven⁷. In de experimenten weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2, worden antilichamen tegen Sca-1, Kit, Flt3 en geslacht (Lin) markeringen Mac1 Gr1, CD3e, B220 en Ter119 gebruikt.
4. Sorteren van 2.000-20,000 Lin^- Sca1⁺Kit⁺ Flt3^- cellen (HSCs) of Lin^-Sca1^-Kit⁺ cellen (HPs) 1,5 mL Eppendorf buizen met 0,1 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 2% foetale runderen serum (FBS).
   Opmerking: Voor de gegevensset die wordt getoond in Figuur 1 en Figuur 2, cellen wordt gesorteerd met behulp van een Flow Cytometer met een mondstuk 70 µM. Het maximale collectie volume is 1,4 mL.

2. de monstervoorbereiding

Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang. Het monster zorgvuldig worden verwerkt. Bij het verwijderen van de bovendrijvende substantie, Wees zeer voorzichtig niet te verstoren, de cel-pellet.

1. Centrifuge de 1,5 mL tubes met gesorteerde cellen in een swingende emmer rotor bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min. verwijderen alle maar ongeveer 100 µL van het supernatans dat uit de cel pellet heel voorzichtig met behulp van een pipet en een 20 µL Pipetteer tip. De pellet niet storen.
   1. Als het monster minder dan 5000 cellen bevat, en het totale volume van de gesorteerde steekproef lager dan 0,2 mL is, overbrengen in de cellen eerst laag bindende 0,2 mL PCR buizen voor centrifugeren.
   2. Als monster minder dan 5000 cellen bevat en volume meer dan 0,2 mL is, draaien de cellen naar beneden met een centrifuge bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min, en verwijdert alle maar 200 µL van het supernatans. Resuspendeer de Ingehuld cellen in de resterende 200 µL van supernatans, vervolgens de cellen overbrengen in de 0,2 mL PCR buizen en spin naar beneden weer. Verwijder alle maar 20-30 µL van de pellet na de tweede spin en resuspendeer de cellen.
2. Resuspendeer de cellen in de bovenstaande links in de buis. Zo nodig typt u extra PBS in 2% FBS/PBS (u kunt ook 2% bovien serumalbumine (BSA) / PBS, of PBS alleen) tot een verwachte concentratie 5 x10⁴ tot 5 x 10⁵ cellen/mL.
   Opmerking: Gebruik de cel telt verzameld door cytometry te schatten van het volume dat wordt gebruikt om op te schorten van cellen.
3. Gebruik 2-5 µL van het opnieuw gesuspendeerde cellen om te bepalen van de concentratie van een nauwkeurige cel met behulp van een geautomatiseerde cel teller (na instructies van de fabrikant) of een hemocytometer-⁹.
4. Breng een hoeveelheid opnieuw zwevende cellen met het gewenste aantal cellen nieuwe 1,5 mL buizen. Voor het experiment in Figuur 1, werden 2000, 1000, 500 HSCs of HPs overgedragen. Het gewenste aantal cellen afhankelijk van de sterkte van het signaal verkregen door westelijke vlek en empirisch wordt bepaald. Met behulp van een 20 µL of 100 µL Eppendorf Pipetteer tip overdraagt.
5. Centrifugeer de cellen in een swingende rotor van de emmer bij 4 ° C, 500 x g, voor 5 min.
6. Voor het genereren van 100 x stamoplossingen, ontbinden proteasoom en phosphatase inhibitors in DMSO volgens de instructies van de fabrikant.
7. 2 x Laemmli monster buffer voor te bereiden door de 4 x Laemmli monster buffer geleverd door de fabrikant met een equivalente hoeveelheid gedestilleerd water verdunnen. Het toevoegen van een passend bedrag van de 100 x voorraad van proteasoom en fosfatase remmers te verkrijgen van een eindconcentratie van 2 x remmers in 2 x Laemmli monster buffer.
   Nota: De 2 x Laemmli monster buffer kan op voorhand worden gemaakt, maar het proteasoom en phosphatase inhibitors moeten worden toegevoegd onmiddellijk voordat het toevoegen van de 2 x Laemmli monster buffer (plus remmers) naar de cel pellet om lyse de cellen, zoals beschreven in de volgende stap.
8. Zorgvuldig verwijderen van een deel van het supernatans van de cel pellet, en naar het supernatant resterende in de buis met de cel pellet, voeg een gelijk volume 2 x Laemmli monster buffer plus proteasoom en phosphatase inhibitors om een eindconcentratie van 500 cellen/µL in 1 x Laemmli monster buffer.
   Opmerking: bijvoorbeeld, als u transfer 2.000 cellen in een totaal volume van 20 µL van een buis in stap 2.5, na centrifugeren van de cellen (stap 2.6), moet u 18 µL van het supernatans verwijderen uit de pellet, en naar de 2 µL van het supernatans dat is overgebleven Voeg een gelijk volume (2 µL) 2 x Laemmli monster buffer om een eindconcentratie van 500 cellen/µL in 1 x Laemmli monster buffer.
9. Resuspendeer de pellet voor het genereren van de lysate zo spoedig mogelijk. Op dit punt, de monsters kunnen onmiddellijk worden electrophoresed door SDS-pagina gelen, of kan worden module in vloeistof N₂ bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.

3. elektroforese

1. Verwarm de lysates in een blok van warmte bij 95 ° C of in kokend water gedurende 5 minuten.
2. 1-40 µL van het (met van 500 tot 20.000 cel equivalenten) lysates electrophorese door SDS-pagina gelen op 100V met behulp van standaard protocollen¹⁰.
   Opmerking: Het volume van lysate geladen in de gel wordt bepaald door het aantal cellen die nodig zijn voor het genereren van het wenselijk signaal en zal afhangen van de overvloed van de proteïne van belang, en de kwaliteit van het antilichaam. De gegevens in Figuur 1 werden verkregen met 2.000, 1000 en 500 cel equivalenten van lysate. De breedte van de put moet worden in het bereik van 3 mm tot 1,5 mm. 1,5 mm tanden kunnen worden gesneden uit een commercieel beschikbare kam met brede tanden met behulp van schaar.

4. overdracht en blokkeren

Opmerking: Voer een westelijke vlek na standaardprotocollen¹¹. De stappen worden hier kort beschreven:

1. Voorbehandeling een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan met methanol voor 10 s, dan wassen het membraan kort met gedestilleerd water.
2. Het eiwit van de SDS-pagina gel overbrengen naar de membraan volgens de instructies in de handleiding geleverd door de fabrikant van het apparaat van de overdracht.
3. Na overdracht, het blokkeren van het membraan met 2 mL bovien serumalbumine (BSA) van 5% in PBST (PBS met 0,1% Tween) overnachting bij 4 ° C na standaardprotocollen¹¹.

5. antilichaam Labeling

1. Incubeer het membraan met antilichamen op een shaker's nachts bij 4 ° C met behulp van antilichaam verdunningen aanbevolen door de leverancier.
   Opmerking: In de tabel van materialen, antistoffen, die we hebben gevalideerd voor HPs, HSCs en de bijbehorende antilichaam verdunningen, worden weergegeven. Het antilichaam labelen met behulp van standaardprocedures⁸uitvoeren

6. detectie

1. Wassen het membraan 3 keer, 5 min. voor elke wassen in PBST bij kamertemperatuur.
2. Laat het membraan met 2 mL Verbeterde Chemiluminescentie buffer voor 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken. Detecteren van de signalen met behulp van een imaging systeem na de fabrikant instructies of autoradiografie film en film processor.

Resultaten

Representatieve resultaten uit 500-2000 zuivere HSCs en HPs worden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. Het signaal van de β-actine in Figuur 1 uit zo weinig als 500 HSCs kan worden herkend en HPs gezuiverd uit het beenmerg van een muis. Merk op dat het laden van de lysates in 1,5 mm wells geproduceerd een veel sterker signaal van 500 HPs dan laden in 3.0 mm wells. Figuur 2

Discussie

Westelijke bevlekken is een gemeenschappelijke techniek voor het opsporen van specifieke proteïnen en de activering van signaalroutes in weefsels of cellen. Door de invoering van kleine aanpassingen aan een veelgebruikte procedure, konden we 15 verschillende eiwitten (Tabel of Materials) routinematig detecteren in 15.000 HSCs, en in sommige gevallen in zo weinig als 500 HSCs. The most kritische stappen in dit protocol zijn: 1) nauwkeurig de cellen tellen, 2) het aantal overdrachten tussen buizen minimali...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
sodium dodecylsulfaat (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis-oplossing	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammoniumpersulfaat	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 kam	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Overdrachtssysteem	Bio-Rad	1704155EDU	overdracht
PowerPac HC-voeding	Bio-Rad	1645052EDU	elektroforese
Beeldvormingssysteem	Bio-Rad	1708195	signaaldetectie
4x Laemmli-monsterbuffer	Bio-Rad	1610747EDU	monstervoorbereiding
10x Tris/Glycine/SDS-elektroforesebuffer	Bio-Rad	1610732EDU	elektroforese
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	monstervoorbereiding
RTA Mini PVDF-overdrachtskit, voor 40 blots	Bio-Rad	1704272	overdracht
Protease-remmercocktail	Sigma	11697498001	monstervoorbereiding
Fosfatase-remmercocktail	Gold Biotechnology	GB-450-1	monstervoorbereiding
EIF4G	Cell signaling	2469	WB-antilichaam, gevalideerd in 1000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB-antilichaam,gevalideerd in 1000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): Fig2
actine(HRP-geconjugeerd)	abcam	ab49900	WB-antilichaam,gevalideerd in 500 cellen antilichaamconcentratie: 1:5000 referentie(figuur): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB-antilichaam, gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:1000 referentie(figuur): ref5 (FigS1)
actine	Santa Cruz	sc-47778	WB-antilichaam,gevalideerd in 15000 cellen antilichaamconcentratie: 1:3000 referentie(figuur): ref5 (Fig4)
lijnuitputtingskit (muis)	Miltenyi Biotec	130-090-858	zuivering van hematopoëtische stamcellen en voorlopercellen
LS-kolommen	Miltenyi Biotec	130-041-305	zuivering van hematopoëtische stamcellen en voorlopercellen
SCF	PeproTech	250-03	fosforyleringsstimulatie
APC-Cy7 c-kit-antilichaam	ThermoFisher	A15423	celsortering
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	celsortering
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	celsortering
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	celsortering
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	celsortering
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	celsortering
Spacer-platen met geïnte