Dit protocol beschrijft de fabricage van optische kwaliteit glazen oppervlakken geadsorbeerde met verbindingen met lange-keten-koolwaterstoffen die kunnen worden gebruikt voor het controleren van macrofaag fusie van levende specimens en super resolutie microscopie van vaste specimens in staat stelt .
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fabriceren van optische kwaliteit glazen oppervlakken te studeren Macrophage Fusion
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Visualiseren van de vorming van multinucleaire reus cellen (MGCs) van levende specimens heeft zijn uitdagend wijten aan het feit dat meest levende imaging technieken voortplanting van het licht door glas vereisen, maar op glas macrofaag fusion een zeldzame gebeurtenis is. Dit protocol stelt de fabricage van verschillende optische kwaliteit glazen oppervlakken waar adsorptie van verbindingen met lange-keten koolwaterstoffen glas transformeert in een fusogenic oppervlak. Voor het eerst, voorbereiding van schone glazen oppervlakken als grondstof voor oppervlakte modificatie is beschreven. Ten tweede, een methode wordt alleen ondersteund voor de adsorptie van verbindingen met lange-keten koolwaterstoffen om te converteren van niet-fusogenic glas naar een fusogenic ondergrond. Ten derde, wordt dit protocol beschreven fabricage van oppervlakte micropatterns ter bevordering van een hoog beschermingsniveau Spatio controle over MGC vorming. Tot slot is het fabriceren van glazen bodem gerechten wordt beschreven. Voorbeelden van gebruik van deze cel in vitro stelsel als een model te bestuderen macrofaag fusion en MGC vorming zijn weergegeven.
Inleiding
De vorming van MGCs begeleidt een aantal pathologische toestanden in het menselijk lichaam gekenmerkt door chronische ontsteking1. Ondanks het akkoord dat macrofagen van mononucleated fuse aan formulier MGCs2, verrassend weinig studies hebben aangetoond fusion in verband met levende specimens3,4. Dit is omdat de macrofaag fusion wanneer geïnduceerd door inflammatoire cytokines5zijn niet bevorderlijk voor schone glazen oppervlakken die vereist voor de meeste beeldvormingstechnieken zijn. Inderdaad, als schoon glas wordt gebruikt als substraat voor macrophage fusion, vervolgens laag tot vergroting van de tussentijdse doelstellingen (dat wil zeggen, 10-20 X) en meer dan 15 uur continue imaging vaak moeten observeren van een enkele fusion-gebeurtenis.
Op de andere hand, fusogenic kunststof oppervlakken (bijvoorbeeld, permanox) of bacteriologische kwaliteit kunststof fusion2te bevorderen. Beeldvorming door middel van kunststof is echter problematisch omdat het substraat dik is en licht verstrooit. Dit compliceert imaging sinds lang werkende afstand (LWD) doelstellingen nodig zijn. LWD doelstellingen hebben echter meestal weinig licht het verzamelen van de capaciteit in vergelijking met hun tegenhanger dekglaasje aan-gecorrigeerd. Verder zijn technieken die gebruik maken van de veranderingen in de polariteit van het passeren van het model zoals differentiële interferentie contrast licht niet onmogelijk omdat kunststof birefringent. De belemmeringen die zijn gekoppeld aan het gebruik van kunststof zijn verder onderstreept door het feit dat het is onmogelijk om te voorspellen waar de macrofaag fusion/MGC vorming zal plaatsvinden op het oppervlak. Samen, deze beperkingen beperken de visualisatie van macrofaag fusie aan fase contrast optica, totale imaging duur verlengd (> 15 ononderbroken uur), en lage resolutie.
We onlangs geïdentificeerd een zeer fusogenic glazen oppervlak terwijl het uitvoeren van single-molecuul super resolutie microscopie met vaste macrofagen/MGCs4. Deze observatie was verrassend omdat schoon glas oppervlakken bevorderen fusion zeer laag debiet van ~ 5% na 24 uur in aanwezigheid van Interleukine-4 (IL-4), zoals bepaald door de fusie index4. We vonden dat de capaciteit ter bevordering van kernfusie te wijten aan oleamide besmetting was. Adsorptie van oleamide of andere verbindingen die ook lange-keten koolwaterstoffen maakte de glazen fusogenic. De meeste fusogenic samengestelde (paraffine) was micropatterned, en het een hoge mate van Spatio beheersing van de macrofaag fusion en een 2-fold stijging van het aantal fusion gebeurtenissen in dezelfde hoeveelheid tijd in vergelijking met permanox waargenomen bijgebracht. Deze optische kwaliteit oppervlakken verschaft de eerste glimp in de morfologische kenmerken en kinetiek die gelden voor de vorming van MGCs in levende specimens.
In dit protocol beschrijven we de fabricage van een verscheidenheid van glazen oppervlakken die kan worden gebruikt voor het controleren van de vorming van MGCs van levende specimens. Bovendien laten we zien dat deze oppervlakken vatbaar voor ver-veld super resolutie technieken zijn. Oppervlakte fabricage is afhankelijk van het doel van het experiment, en elk oppervlak met verwante voorbeelden in de tekst van de procedure wordt beschreven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Procedures die gebruik maken van dieren werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik comités op Mayo Clinic, Janelia Research Campus en Arizona State University.
1. voorbereiding van de zuur-gereinigd Cover glas
Opmerking: Cover glas gekocht bij veel fabrikanten wellicht niet zo schoon zoals verwacht. Overwegen regelmatig schoonmaken batches van dekking glas vóór elke procedure waar microscopie is betrokken.
- Koop hoge starheid cover glas. Zorg om te kiezen van de juiste dikte (0,15 of 0,17 mm).
Opmerking: De keuze van cover glasdikte is afhankelijk van de doelstelling van de Microscoop en staat direct op het objectieve vat. - Incubeer het glas van de cover in de 12 M zoutzuur in een goed geventileerde chemische zuurkast voor 1 h met ultrasoonapparaat (42 kHz, 70 W). Herhaal deze stap voor aanvullende tweemaal met vers 12 M HCl.
- Vul een afzonderlijk bekerglas met ultrazuiver water en voeg de glazen cover. Bewerk ultrasone trillingen ten het glas cover voor 5-10 min in een goed geventileerde chemische kap. Herhaal deze stap tien keer.
- Incubeer het glas van de cover in pure aceton in een goed geventileerde chemische kap voor 30 min met ultrasoonapparaat. Herhaal deze stap voor aanvullende tweemaal.
- Vul een afzonderlijk bekerglas met steriele ultrazuiver water en voeg de glazen cover. Bewerk ultrasone trillingen ten het glas cover voor 5-10 min in een goed geventileerde chemische kap. Herhaal deze stap tien keer.
- Incubeer het glas van de cover in 100% ethylalcohol in een chemische kap voor 30 min met ultrasoonapparaat. Herhaal deze stap twee extra keer.
Opmerking: De zuiverheid van de ethyl alcohol is belangrijk. Verontreinigende stoffen in de vorm van opgeloste vaste stoffen zal droog op het glas en macrofaag fusion kunnen bevorderen. - Voor langdurige opslag, plaatst u het glas cover zuur-gereinigd in een container gevuld met zuivere ethylalcohol. U kunt ook droog de cover glas met stikstofgas en winkel in een vacuüm exsiccator.
2. bereiding van Fusogenic optische hoogwaardige oppervlakken
- Ontbinden DMSO-gratis high-smelten van punt paraffine in ultrazuiver tolueen.
Opmerking: Voorraad concentraties zijn gemaakt bij 10 mg/mL, en zijn verdunde 1:9 in ultrazuiver tolueen te maken een 1 mg/mL werkoplossing.
Let op: Tolueen moet voorzichtig behandeld worden als een teratogen. Buitengebruikstelling van tolueen volgens de institutionele chemische hygiëneplan. - Toepassing van de paraffine werkoplossing aan een droog zuur-gereinigd cover glas op een volume dat evenredig betrekking heeft op het glasoppervlak. Decanteren overtollige oplossing en droog de cover glas met stikstofgas of lucht. Voorbereiding van de bulk, gebruiken een pot van de Coplin ontworpen voor de glazen cover.
- De cover glas Pools door 3 slagen in de x-as en volgende 3 lijnen in de y-as met een pluisvrije doekje (Zie Tabel van materialen).
- Onmiddellijk voordat het experiment wordt uitgevoerd, het glas van de cover met steriele ultrazuiver water wassen en vervolgens steriliseren gedurende 15-30 min met ultraviolet licht in een biologische veiligheid kap. Als alternatief, steriliseren het glas cover in ethyleen oxide of gamma straling.
3. Micropatterning koolwaterstoffen bevattende verbindingen beperken Fusion aan vooraf bepaalde regio 's
- Droog het glas cover zuur-gereinigd en immobiliseren van het glas op een vlakke ondergrond.
- Met behulp van Tang, onderdompelen zorgvuldig een gouden elektronenmicroscopie finder transmissienet in een werkende oplossing van de koolwaterstof verbinding(en). Kies een koolwaterstof samengestelde die voldoet aan het uiteindelijke doel van het experiment (Zie tabel 1). Pit weg overtollige oplossing door zachtjes te tikken op het raster op filterpapier, en onmiddellijk het raster te plaatsen in het midden van het glas van de cover. Laat de tolueen drogen gedurende 2 minuten voordat u verdergaat met de volgende stap.
- Controleer of dat het raster is gebonden aan het glas door zachtjes het omkeren van het glas. Als het raster Herhaal stap 3.2 met behulp van een nieuwe cover glas wordt.
Opmerking: Als een plasma reiniger niet beschikbaar is, weglaten stap 3.4. - Plasma schoon het glas cover door behandeling met vacuüm gasplasma.
Opmerking: De finder-net fungeert als een masker ter bescherming van het onderliggende oppervlak geadsorbeerde met lange-keten koolwaterstoffen uit het plasma. De regio's die zijn onbeschermd door het raster zijn niet-fusogenic door de blootstelling aan plasma geworden. De hoeveelheid tijd die het glas cover bloot aan plasma is moet empirisch worden bepaald. - Met behulp van fine-tip pincet, verwijder voorzichtig het raster van het glasoppervlak bloot van de micropattern.
4. het fabriceren van glazen bodem gerechten
- Boor een 6-10 mm ronde gat in de bodem van een 35-mm plastic petrischaal met behulp van een boor stap.
Opmerking: Het is cruciaal met een boor van de stap maken van schermlettertypen bijwerken. Als randen te ruw, zal niet het glas cover band plat aan de onderkant van de schotel. Onvolkomen vlakke oppervlakken bemoeilijken microscopie. - Zorgvuldig mixen en ontgas silicone-elastomeer volgens de instructies van de fabrikant (d.w.z., Polydimethylsiloxaan; PDMS).
- Een dunne laag van elastomeer alleen naaste aan de rand van toepassing (d.w.z., gedeelten) het gat.
Opmerking: De elastomeer moet worden weergegeven als een ononderbroken zij dunne band rond het gat. - Zachtjes toepassen of het fusogenic cover glas (beschreven in sectie 2), of het droog zuur-gereinigd cover glas (beschreven in sectie 1) de schotel ter dekking van het gat omgeven door elastomeer. Ervoor zorgen dat het glas cover uitgelijnd met de onderkant van de schotel verschijnt en de diameter van het gat overschrijdt, zodat een aanzienlijk deel van het glas in contact met de plastic is. De elastomeer genezen door het baksel bij 50 ° C gedurende 2-3 uur.
- Indien de voorkeur wordt fusogenic glas, UV steriliseren de schotel en cultuur cellen volgens standaardprotocollen. Echter als de voorkeur wordt gegeven aan een micropattern, gaat u verder met stap 3.2 voorbereiding op de micropattern (de gasplasma gebruikt tijdens micropatterning Steriliseert de schotel en sterk paren PDMS aan glas).
5. het verzamelen van macrofagen Thioglycollate-ontlokte
- Injecteren 8-week-oude C57BL/6 muizen met 0,5 mL van een steriele oplossing van 4% Brewer's thioglycollate als eerder beschreven3,4,6.
- Tweeënzeventig uur later, euthanaseren het dier volgens goedgekeurde dierenverzorgers en gebruiken van richtsnoeren en verzamelen van macrofagen door peritoneale lavage met ijskoude-fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met 5 mM ethyleendiaminetetraacetaat.
- Centrifugeer de macrofagen bij 300 x g gedurende 3 min en resuspendeer in 1 mL DMEM:F12 aangevuld met 15 mM HEPES, 10% FBS, en 1% antibiotica (kweekmedium).
Opmerking: De cellen worden vervolgens geteld met een Neubauer-hemocytometer. Macrofagen zijn naar de geschikte concentratie verdund en toegepast op de oppervlakken. Het aantal cellen toe te passen op een bepaald oppervlak moet zorgvuldig worden overwogen door de onderzoeker ten behoeve van de experimentele vraag. Bekende normen in de primaire literatuur te raadplegen. - Na 30 min was de oppervlakken met HBSS aangevuld met 0,1% BSA niet-aanhanger cellen verwijderen en vervangen door verse kweekmedium. De culturen terugkomen in de incubator (5% CO2 in lucht bij 37 ° C).
- 2 uur later, gecombineerd het medium en vervangt door cultuurmedium aangevuld met 10 ng/mL voor IL-4. Het imago van de cellen zoals elders beschreven4.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Fysisch-chemische parameters van materialen dramatische gevolgen hebben voor de omvang van de macrofaag fusion7,8,9,10. Oppervlakte verontreinigingen zijn bovendien bekend om macrofaag fusion11. Daarom is het belangrijk om te beginnen met schone cover glas als een negatieve controle voor macrophage fusion. Wanneer schoongemaakt zoals besc...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De noodzaak om te identificeren en vervolgens het ontwikkelen van optische kwaliteit glazen oppervlakken die macrofaag fusion bevorderen vloeide voort uit het feit dat tot onlangs niet gepubliceerde studie direct gevisualiseerd macrofaag fusie in het kader van levende specimens3, 4. Dit is de wijten aan het feit dat fusogenic kunststofoppervlakken, die vaak worden gebruikt LWD doelstellingen vereisen en grotendeels beperkt tot de fase contrast optiek zijn. Deze ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij wensen dank aan leden van het Ugarova laboratorium en onderzoekers in het midden voor Metabolic en vasculaire biologie voor nuttige discussie van dit werk. James Faust wil zijn dank betuigen aan de instructeurs op de Europese moleculaire biologie laboratorium Super resolutie microscopie cursus in 2015. Wij willen bedanken Satya Khuon op Janelia voor hulp bij de bereiding van de monsters voor LLSM. Tijdens de beoordeling en filmen delen van dit werk werd James Faust ondersteund door een T32 Fellowship (5T32DK007569-28). De Lattice licht blad component van dit werk werd gesteund door HHMI en Betty en Gordon Moore Foundation. T.U. wordt gefinancierd door de NIH HL63199 verlenen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Tolueen | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Aceton | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloridezuur | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petrischaal | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont nr. 5 pincet | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA-oplossing | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct muizen | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
Referenties
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
