Methodenartikel

Oppervlakte modificatie van de alvleesklier eilandjes met een Heparinized StarPEG Nanocoating

DOI:

10.3791/56879

⸱

23 juni 2018

 ,  ,  , 
1Tianjin Key Laboratory of Biomaterial Research, Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is gericht op een oppervlak engineering van alvleesklier eilandjes met behulp van een heparine-opgenomen starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemie tussen de fracties N- hydroxysuccinimide van de nanocoating en de amine groepen islet celmembraan.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cel oppervlakte techniek kunt geïmplanteerde cellen beschermen tegen gastheer immuun aanval. Het kan ook het omvormen van cellulaire landschap ter verbetering van de functie van de prothese en overleving na transplantatie. Dit protocol is gericht op een oppervlak engineering van alvleesklier eilandjes met behulp van een uiterst dunne heparine-opgenomen starPEG (Hep-PEG) nanocoating. Voor het genereren van de Hep-PEG nanocoating voor alvleesklier islet oppervlakte engineering, heparine succinimidyl succinaat (heparine-NHS) werd eerst gesynthetiseerd door wijziging van haar carboxylaat-groepen met behulp van N--(3-dimethylamino propyl) -N'-ethyl carbodiimide Waterstofchloride (EDC) en N- hydroxysuccinimide (NHS). De Hep-PEG mengsel werd vervolgens gevormd door crosslinking van de amino einde-matiemaatschappij acht-armig starPEG (starPEG-(NH2)8) en heparine-NHS. Voor islet oppervlaktelaag werden muis eilandjes geïsoleerd via collagenase spijsvertering en kleurovergang zuivering met behulp van Histopaque. Geïsoleerde eilandjes werden vervolgens behandeld met ijs koud Hep-PEG oplossing voor 10 min. zodat covalente binding tussen NHS en de amine-groepen van islet celmembraan. Nanocoating met de Hep-PEG oploopt minimale wijziging islet grootte en volume en heparinization van de eilandjes met Hep-PEG kunnen ook onmiddellijke bloed-gemedieerde inflammatoire reactie tijdens islet transplantatie verminderen. Deze aanpak van "gemakkelijk-aan-vast" is mild genoeg is voor oppervlakte-engineering van levende cellen zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van de cellen. Gezien het feit dat de heparine bindende affiniteit met meerdere cytokines heeft aangetoond, de Hep-PEG nanocoating biedt ook een open platform waarmee opneming van onbeperkte functionele biologische bemiddelaars/mediators en multi-gelaagde oppervlakken Woonlandschappen celoppervlak studierichtingen Bio-ingenieur.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De therapeutische werking van cel-gebaseerde therapieën wordt beperkt door lage cel retentie en arme survival1,2. Ter verbetering van het resultaat van celtherapieën, cel oppervlakte engineering via enzymatische manipulatie, peptide conjugatie, bioorthogonal chemie en fysieke inkapseling met biomaterialen geweest uitgebuite3,4, 5,6,7,8,9,10. Het huidige protocol is gericht op een oppervlak engineering van levende cellen met behulp van een methode "gemakkelijk-aan-adopt" door het toepassen van een uiterst dunne heparine-opgenomen starPEG (heparine-PEG) nanocoating aan het celoppervlak. Oppervlakte modificatie van de alvleesklier eilandjes werd gepresenteerd als een voorbeeld vanwege de heterogene aard van de eilandjes van Langerhans en de kleinerende resultaten van de huidige klinische islet transplantatie.

Inderdaad, klinische islet transplantatie wordt momenteel uitgevoerd door directe injectie van geïsoleerde eilandjes in de hepatische ader van de portal en deze procedure is alleen beschikbaar voor de selectieve patiënten vanwege de schaarste van donor materialen en lage therapeutische werking 11. conventioneel, alginaat is de meest gebruikte biomaterial voor islet inkapselen en oppervlakte modificatie, hoewel het is minder dan ideaal als gevolg van de chemische instabiliteit van alginaat en inflammatoire-gerelateerde fibrose12, 13. Bovendien, vergeleken met de natuurlijke grootte van eilandjes die tussen 100 tot 200 µm varieert, de alginaat-islet microcapsules zijn groter, variërend tussen 400 en 800 µm, die hoger zijn dan de fysiologische diffusing afstand van zuurstof. Hoekgetrouwe islet inkapseling, dwz., encapsulating eilandjes zonder significante wijziging van islet volume, werd vervolgens ontwikkeld. Aldus, afzetting van nanomembranen samengesteld uit PEG, tetrafluorethyleen, silicium membraan of multi-gelaagde nanocoating (ook bekend als de "laag-voor-laag" [LBL] techniek) is gemeld, wat resulteert in verbeterde in vitro islet survival14 ,15,16,17,18, hoewel de LBL aanpak vaak vereist uitgebreide eilandjes overdracht periode tegen afzetting van meerdere lagen, die kan levensvatbaarheid van islet . Bovendien instabiliteit van nanomembranen die is gebaseerd op elektrostatische of covalente interacties tussen biomembraan lagen of hydrofobe interacties tussen nanomembranen en het eilandje oppervlak geeft ook aanleiding tot bezorgdheid9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.

Een andere beperkende factor die encumbers van de therapeutische resultaten van intraportal islet transplantatie is de onmiddellijke bloed-gemedieerde inflammatoire reactie (IBMIR) veroorzaakt door direct contact van geïmplanteerde eilandjes met bloed, wat resulteert in de aggregatie van bloedplaatjes, stolling en schadelijk immuun effect of ongewenste cellulaire activering9. Om aan deze problemen, is een ultra-dunne nanocoating samengesteld uit stervormige polyethyleenglycol (starPEG) zijn gevestigde biocompatibiliteit en veelzijdigheid als islet huisvesting materiaal voorbereid. Heparine, een sterk verzuurde glycosaminoglycaan, werd ook opgenomen in de starPEG nanocoating voor zijn anti-inflammatoire, anti-coagulant eigenschappen en de mogelijkheid om de vascularisatie vergemakkelijken door de indienstneming van de pro-angiogenic groeifactoren22, 23.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabricage van heparine-opgenomen Starpeg Nanocoating

  1. Synthese van heparine succinimidyl succinaat (heparine-NHS)
    1. Weeg 0,69 g van heparine en ontbinden in 2,0 mL ijskoud gedeïoniseerd water.
    2. Weeg 0,23 g van NHS en los op in 0,5 mL ijskoud gedeïoniseerd water in een rondbodemkolf.
    3. Weeg 0.77 g van EDC en los op in 0,5 mL ijskoud gedeïoniseerd water in een rondbodemkolf.
    4. Meng de NHS en EDC oplossingen in een rondbodemkolf. Laat de gemengde oplossing op de Bank bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Centrifugeer het EDC NHS mengsel bij 5,031 x g gedurende 10 minuten om overtollige EDC en NHS te verwijderen.
    6. Voeg 30 mL koud ethanol aan de oplossing van het mengsel en centrifuge op 5,031 x g gedurende 10 minuten.
      1. Herhaal dit twee keer.
  2. Voorbereiding van starPEG-heparine nanocoating
    1. Voeg 1,0 mL 10% (m/v) starPEG-(NH2)8 tot een rondbodemkolf.
    2. Voeg 0,67 mL 10% (m/v) heparine-NHS tot de dezelfde rondbodemkolf.
    3. Plaats de gemengde oplossing van starPEG-(NH2)8 en heparine-NHS in een incubator bij 25 ° C gedurende 20 minuten een duidelijke oplossing met viscositeit te verkrijgen.
      Opmerking: Voor experimenten waarin fluorescently geëtiketteerde heparine (FAM-heparine) vereist was, de fabricatie-procedure is hetzelfde behalve dat de ster - PEG-(NH2)8 werd ontbonden in gedeïoniseerd water aangevuld met 5, lid 6- carboxyfluorescein N- succinimidyl ester 0,1% (molaire ratio) van starPEG-(NH2)8. )
  3. Karakterisering van heparine-PEG nanocoating door Fourier Transform infraroodspectroscopie (FT-IR)
    1. Voordat u begint, spoel het Agaat Mortier, de stamper en de pillering apparaat (kleine schijven met een diameter van 13 mm) met aceton en gedeïoniseerd water. Droog het glaswerk in een oven vóór gebruik.
    2. Mix ongeveer 0,1-1% heparine-PEG monster met 200-250 mg fijn poeder van de KBr.
    3. Plaats de heparine-PEG en KBr mengsel in de mortel Agaat en fijn verpulveren in kleine pellets met een diameter van 2 µm.
    4. Breng het mengsel in een pelleting apparaat. Hoge compressie force (8 T/cm2) in een vacuüm voor 1-2 minuten te vormen transparant pellets van toepassing.
    5. Trek voorzichtig de monster-pellets uit de buurt van het pelleting apparaat. Wees voorzichtig niet te trek te hard dus niet te scheuren oplopen.
    6. Overbrengen in de steekproef pellets zeer zorgvuldig een Fourier Transform Infrared spectroscoop om te bepalen van de chemische structuur van de steekproef.
  4. Onderzoek van de interne poreuze structuur van heparine-PEG nanocoating door gescande elektronenmicroscopie (SEM)
    1. De volgende procedures opstellen standaard 48-well cel cultuur plaat en pipetten.
    2. Pipetteer de heparine-PEG copolymeer oplossing in de putjes van de plaat van een 48-well cultuur.
    3. Het bevriezen van de plaat bij-80 ° C gedurende 24 uur.
    4. Lypophilize de monsters bij-50 ° C in vacuüm omgeving (0.1 Pa) gedurende 24 uur.
    5. Monsters verspreid over de kleverige oppervlak van een aluminium-stub.
    6. Jas van de monsters met goud en observeren onder de gescande elektronenmicroscoop te observeren interne poreuze structuur.
  5. Onderzoek van het oppervlak nanocoating heparine-PEG door atomaire kracht microscopie (AFM)
    1. Schone silica glas dia's met piranha-oplossing (70% H2SO4, 30% H2O2) bij 80 ° C gedurende 40 min.
    2. Bewerk ultrasone trillingen ten de dia's in methanol gedurende 10 minuten en vervolgens in tolueen gedurende 10 minuten.
    3. Droog de dia's door vacuüm drogen.
    4. De dia's met veel 3-aminopropyl-triethoxysilane oplossing (2% in tolueen), schud voorzichtig wassen.
    5. Bewerk ultrasone trillingen ten dia's in methanol gedurende 10 minuten daarna in tolueen gedurende 10 minuten.
    6. Plaats 100 µL van 3% heparine-PEG-oplossing over het oppervlak van de dia's met behulp van een precisiepipet standaard.
    7. Onderzoeken van het oppervlak van heparine-PEG onder een atomic force microscope (een resonante frequentie van 50-80 kHz, dwingen constante van 0.350 N m 21, tip straal van 600 nm).

2. muis Islet oppervlakte Engineering met heparine-PEG Nanocoating

  1. Muis islet oppervlaktelaag met heparine-PEG nanocoating
    1. Pak de muis eilandjes door collagenase spijsvertering en histopaque kleurovergang zuivering zoals eerder gemeld in JoVE19.
    2. Handpick 200 eilandjes onder een Microscoop dissectie tot een 1,5 mL koker.
    3. Voeg 500 µL van PBS op de eilandjes en centrifuge op 503 x g voor 1 min.
    4. Opstijgen het supernatant en voeg 250 µL van de heparine-PEG-oplossing en houd het mengsel op het ijs voor 10 min. Pipetteer omhoog en omlaag om de eilandjes te mengen goed met de heparine-PEG-oplossing.
    5. Centrifugeer bij 503 x g gedurende 1 minuut.
    6. Verwijder het supernatant en voeg 500 µL van PBS. Pipetteer omhoog en omlaag om meng goed.
    7. Centrifugeer bij 503 x g voor 1 min en verwijder het supernatant en houd van de eilandjes voor verder gebruik. Voor behandeling van muis eilandjes bedekt met de heparine-PEG, werd FAM-heparine-PEG gebruikt voor islet coating volgt.
  2. Onderzoek van muis eilandjes bedekt met de FAM-heparine-PEG nanocoating
    1. Voeg 1-2 mL RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale runderserum aan de gecoate eilandjes en breng deze eilandjes in een steriele bacteriecultuur niet geladen schotel.
    2. Observeer de morfologie en fluorescentie signalen van FAM-heparine-PEG nanocoating beklede eilandjes onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop.

3. de functie van heparine-PEG gecoat muis eilandjes in vergelijking met niet-gecoate eilandjes

  1. Levensvatbaarheid van heparine-PEG gecoat muis eilandjes
    1. Handpick 20 van de heparine-PEG gecoat muis eilandjes en plaats ze in een putje van een 96-Wells cel cultuur plaat.
    2. Vul een totaal van 10 putten met 20 heparine-PEG gecoat muis eilandjes voor elk putje.
    3. Handpick 20 van noncoated controle eilandjes en plaats ze in een putje van de dezelfde 96-Wells cel cultuur plaat.
    4. Vul een totaal van 10 putten met 20 noncoated controle eilandjes voor elk putje.
    5. Zet 200 µL van RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale runderserum in elk putje van de 96-wells-plaat met eilandjes en handhaven in cultuur voor 14 dagen.
    6. Vervang islet voedingsbodems om de 2 dagen.
    7. Behandel de eilandjes met een leven/dood kleuring kit aan het einde van 14 dagen in cultuur en onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop waargenomen.
    8. PI+ (rood) cellen binnen elke islet onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop tellen.
  2. Revascularisatie van de heparine-PEG gecoat muis eilandjes in vitro
    1. Cool vooraf alle experimentele kunststoffen met inbegrip van cultuur plaat en Pipetteer tips ten minste 12 uur vóór gebruik.
    2. Plaats een 24-well plaats op een koeling pad. Voeg 250 µL van ijs koud groeifactor verminderde Matrigel in elk putje van de plaat van een 24-well cel cultuur. Plaats de gecoate 24-well plaat bij 4 ° C gedurende ten minste 30 min.
    3. Terwijl de oplossing matrix in de koelkast ondergaat, trypsinize de muis alvleesklier endothelial mijl Sven 1 (MS1) eilandjecellen.
      1. Verwijder alle voedingsbodems uit de kolf weefselkweek. Spoel de kolf met 5 mL PBS.
      2. Verwijder de PBS en voeg 3 mL trypsine-EDTA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten in een standaard incubator.
      3. Tik licht op de bodem van de kolf loskoppelen van de cellen en voeg 5 mL serum-aangevuld media.
    4. De cellen in een tube van 15 mL centrifuge en centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min verzamelen.
    5. Opstijgen het supernatant en voeg 5 mL PBS. Pipetteer omhoog en omlaag om meng goed.
    6. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 min en het supernatant opstijgen.
    7. Voeg serum-aangevuld DMEM media in de buis en 50.000 cellen in elk putje van de plaat 24-well matrix-oplossing-gecoat zaad.
    8. 5 heparine-PEG gecoat eilandjes of noncoated control eilandjes toevoegen aan elk putje.
    9. Serum-aangevuld DMEM media in elk putje toevoegen tot een totaal van 500 µL per putje.
    10. Vorming van de buis na 4 uur en 24 uur incubatie onder een lichte Microscoop te observeren.
  3. Glucose-gestimuleerd insuline secretie van heparine-PEG gecoat eilandjes
    Opmerking: Om te beoordelen of nanocoating afbreuk aan de functie van muis eilandjes doen zou, glucose-gestimuleerd insuline secretie van heparine-PEG bekleed en noncoated eilandjes evalueerden.
    1. Handpick 30 heparine-PEG gecoat eilandjes of noncoated control eilandjes in een 1,5 mL-buis. Een totaal van 10 buizen voor gecoate eilandjes en noncoated eilandjes elke voorbereiden.
    2. Voeg 1 mL fysiologische zoutoplossing, aangevuld met 2 mmol/L glucose20 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.
      Opmerking: Het recept van de fysiologische zoutoplossing, Raadpleeg voor tabel 1. Houd de dop van buizen los tijdens de incubatie in de incubator.
    3. Verwijder zo veel oplossing mogelijk.
    4. Stimuleren eilandjes door toevoeging van 600 µL van fysiologische zoutoplossing aangevuld met 20 mmol/L glucose bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
    5. Verzamelen 200 µL van supernatant van elke buis voor insuline ELISA kwantificering met behulp van een commerciële ELISA-insuline kit.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De heparine-PEG nanocoating werd gesynthetiseerd door de vervoeging van starPEG-(NH2)8 en heparine gebruik van EDC en NHS als koppeling agenten (Figuur 1). Chemische structuur van de heparine-PEG nanocoating werd onderzocht door FT-IR en zoals blijkt uit Figuur 2, karakteristieke pieken van heparine kon worden waargenomen op 3300 – 3.600 cm-1, overeenkomt met de hydroxylgroepen van heparine (Figuur 2 rode). De afname van de amplitude van de piek op 3300 – 3.600 cm-1 (Figuur 2 blauwe) vertegenwoordigt tussen de starPEG-(NH2)8 amidegroepen en heparine carbonylgroep Woordherkomst en-opbouw. Amplitude van piek 1.650 cm-1 overeenkomt met het amide carbonyl uitrekken trillingen werd ook verminderd, met vermelding van voldoende reactie tussen de fracties van carboxylaat van heparine met succinimidyl succinaat en amine van starPEG-(NH2) 8. oppervlakte structuur van de heparine-PEG nanocoating werd onderzocht door atomaire kracht microscopie en het blijkt uit Lou et al., de nanocoating was ongeveer 30 nm in hoogte en 2 µm breed met kleine poreuze functies (donkere vlekken) variërend tussen 100 tot 200 nm in diameter10. Gegevens die zijn verkregen uit gescande elektronische microscopie bevestigen ook de sterk met elkaar verbonden poreuze structuur van de heparine-PEG (Figuur 3), wat suggereert dat het geschikt is voor de overleving van de cel tijdens in vivo levering zou kunnen zijn.

Oppervlaktelaag van geïsoleerde muis eilandjes werd onderzocht en als aangegeven in Figuur 4, dun laagje nanocoating, weergegeven door groene fluorescentie zonder duidelijk wijzigingen op islet/volumegrootte gelijkmatig over het oppervlak van het gecoate eilandjes werd afgezet. Tijdens de coating, wordt aangeraden om te houden van de eilandjes op ijs te handhaven hun levensvatbaarheid. Ook werd de periode van de coating, 10 min in dit geval ook geoptimaliseerd zodat het onderhoud van de levensvatbaarheid van de eilandjes. Het is vermeldenswaard dat voor betere waarneming van de nanocoating, elektronenmicroscopie dat de dwarsdoorsneden van gecoate eilandjes als eerder gemeld9,16 onderzoekt zou gepaster, hoewel de gegevens moet worden gegenereerd van vaste en ingesloten eilandjes in plaats van levende eilandjes in de cultuur.

Met betrekking tot overleving en functie van gecoate eilandjes, islet revascularisatie en functies in zijn beoordeeld in vitro. Gezien de gunstige eigenschappen van heparine, kan heparine functionalization op het eilandje oppervlak vergemakkelijken islet revascularisatie in cultuur en daardoor haar voortbestaan. Wij hebben geconstateerd dat de heparine-PEG gecoat muis eilandjes tentoongesteld robuuste islet levensvatbaarheid in cultuur (Figuur 5). Aanzienlijk meer geavanceerde vasculaire formatie was ook blijkt uit endotheel eilandjecellen (MS1) die samen werden gekweekt met heparine-PEG gecoat eilandjes, aangegeven door een verlengde microvessel-achtige structuren en netwerk-achtige vasculaire structuren (Figuur 6 ).

Het proces van nanocoating gemaakte geen effect glucose-gestimuleerd insuline secretoire vermogen van de eilandjes van heparine-PEG bekleed. Laag niveau van insuline secretie werd waargenomen in alle behandelgroepen wanneer eilandjes werden geperfundeerd met fysiologische zoutoplossing, aangevuld met sub-stimulatory niveau van glucose (2 mmol/L; Figuur 7). Wanneer eilandjes werden gestimuleerd met een supra-fysiologische niveau van glucose (20 mmol/L glucose), werd stijging van de insuline secretie waargenomen in alle groepen van de behandeling.

figure-results-1
Figuur 1: Chemische structuur van de Hep-PEG nanocoating voor alvleesklier islet oppervlakte engineering. Islet coating werd bereikt door covalente crosslinking tussen de heparine-NHS en primaire amines binnen de celmembraan en ster - PEG-(NH2)8. Elke molecuul heparine bezit meerdere carboxylgroepen, die werden gewijzigd om een NHS groep. De NHS-geactiveerde carboxylgroepen zal reageren met primaire amines van eiwitten aan formulier amide verbanden, waarlangs nanocoating Hep-PEG en eilandjes is gestabiliseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 : Infrarood spectrum van sterren - PEG-(NH2)8, heparine en Hep-PEG nanocoating in gedroogde toestand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3: Elektronische microscopie beelden van Hep-PEG in gedroogde toestand gescand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-4
Figuur 4: Representatieve beelden van heparine-PEG gecoat eilandjes onder fluorescentie Microscoop.
Heparine was vooraf gelabelde met FAM (afgebeeld in groen). Beelden zijn representatief voor 100 eilandjes. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-5
Figuur 5: Heparine-PEG gecoat eilandjes tentoongesteld robuuste islet levensvatbaarheid. (A) gegevens gepresenteerd als mean± standaardfout van middelen, n = 50 eilandjes per groep. (B) levende cellen werden getoond in groen en dode cellen in het rood. Schaal bar = 100 µm. beelden zijn vertegenwoordiger van 50 eilandjes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-6
Figuur 6: Heparine-PEG nanocoating vergemakkelijkt intra-islet revascularisation. Matrigel buis vorming van MS1 cellen samen gekweekt met heparine-PEG gecoat eilandjes en noncoated controle eilandjes. Beelden werden genomen op 4 en 24 h. schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-7
Figuur 7: Heparine-PEG nanocoating oploopt geen verandering op islet insuline secretie functie. Heparine-PEG gecoate eilandjes en noncoated controle eilandjes (met elk 30) werden blootgesteld aan 2 mmol/L (witte balk) of 20 mmol/L (zwarte balk) glucose voor 30 min. insuline secretie in reactie op 20 mmol/L glucose was vergelijkbaar tussen de gecoate encontrole eilandjes. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking van middelen, n = 10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel, we blijk geven van een "gemakkelijk-aan-adopt" aanpak voor levende celoppervlak engineering een heparine-opgenomen starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemie tussen de fracties N- hydroxysuccinimide van de nanocoating en de Amine groepen alvleesklier islet oppervlakte membraan. Inderdaad, de amino groepen binnen celmembranen zijn zeer reactief, en dientengevolge, eerdere studies hebben gemeld interacties tussen primaire amino groepen met geactiveerde ester van N- hydroxysuccinimidyl (NHS) onder fysiologische omstandigheden14 ,16,21. Bovendien heeft uitgebreid onderzoek gemeld dat de opneming van heparine en een belangrijk onderdeel van de extracellulaire matrix, en sterk verzuurde glycosaminoglycaan tijdens islet inkapseling, tot verbeterde na transplantatie leiden kan revascularisatie en verminderde IBMIR22,23. Gezien de biocompatibiliteit van PEG en multivalent eigenschappen van heparine, we 8-gewapend PEG gebruikt voor maximale heparine laden tijdens de fabricage van de nanocoating. Heparine is bewerkt met -NHS, die vervolgens met de -NH2 groepen op eilandje cel membraan zou reageren. Door de vorming van covalente binding tussen -NH2 (van de celmembraan) en -NHS van de Hep-PEG, de eilandjes zou worden gemakkelijk "bekleed" in te schakelen door de PEG heparine-opgenomen, en vormt aldus een nano-dunne laag (nanocoating) op de buitenkant van de alvleesklier eilandjes.

De huidige aanpak is anders dan eerder gepubliceerde methoden die ook PEG als het grote polymeer voor islet microencapsulation in die pseudo-bioorthogonal-chemie tussen de -NHS (van de nanocoating) en -NH,2 van de eilandje cel geselecteerd membraan werd gebruikt. Overwegende dat stabiliteit van islet/cel coating, met name in een complexe omgeving zoals het plasma, is cruciaal voor na transplantatie revascularisatie en overleving, de vorming tussen -NHS en -NH2 zou meer stabiel in vergelijking met hydrofobe interactie tussen PEG en celmembraan24, Elektrostatische interacties9,15,24,25,26 of biologische koppeling tussen Biotine streptavidine14.

Bovendien, in tegenstelling tot islet vereist coating aanpak die op de aanpak van de LBL met uitgebreide islet behandeling periode voor multi-layer afzetting14,16,25, de huidige techniek ook berust minimale verwerking en zeer korte coating periode van de geïsoleerde eilandjes. Beide van deze factoren zijn essentieel voor overleving na transplantatie islet aangezien eilandjes levensvatbaarheid vaak al gecompromitteerde volgende islet isolement als gevolg van beschadigde ECM tijdens de enzymatische vertering is. Een beperking van de huidige aanpak is echter dat, in tegenstelling tot de LBL, waarlangs de dikte van de buitenste coating kan worden gecontroleerd door te verhogen of verminderen van het aantal laag depositie, dikte van de Hep-PEG nanocoating voorlopig kan niet worden aangepast.

Bovendien, te wijten aan de milde aandoening waar chemische reactie tussen -NHS en -NH2 plaatsvindt, de huidige aanpak is van toepassing op levende cel oppervlak engineering niet beperkt tot de alvleesklier eilandjes, maar de meeste celtherapie. Bovendien, gezien het feit dat de heparine is bekend om te interageren met een bereik van cytokines en biologisch actieve moleculen, de Hep-PEG nanocoating ook presenteert een open platform dat het potentieel voor opneming van onbeperkte biologische bemiddelaars, evenals interfaces voor meer complexe cel oppervlakte techniek.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor de financiële steun van de nationale natuurwetenschappen fondsen van China (31770968), Tianjin onderzoek programma van Application Foundation en de Advanced Technology (17JCZDJC33400).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
PBSHycloneAAJ207798
StreptozototineSigmaS0130
HistopaqueSigma10831
RPMI 1640GIBCO, by Life Technologies31800022
Fetaal RunderserumGIBCO, by Life Technologies16000-044
Penicillin StreptomycinGIBCO, by Life Technologies15140
Cell Dissociation SolutionGIBCO, by Life Technologies13150-016
DMEMGIBCO, by Life Technologies12800017
D-(+)-Glucose oplossingSigmaG8644
488 phalloidinSigmaA12379
CFSESigma21888-25mg-F
Annexin V/PI apoptosekitDojindoAD10
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Collagenase van Clostridium, Type XISigmaC7657
HeparineSigma-AldrichH3149
NHSSigma-Aldrich56480
EDCSigma-Aldrich3449
8-armige PEGJ&K Scientific Ltd1685176
FAMSigma-AldrichM041100
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl esterSigma-Aldrich21888
KBrJ&K Scientific Ltd32036
3-aminopropyl-triethoxysilaanSigma-AldrichA3648
tolueenJ&K Scientific LtdS-15497-20X
Live/dead stainingkitBiovision, USK501
BD MatrigelTM, basement membraanmatrix, groeifactor gereduceerdBD Bioscience354230
Natriumchloride, 99,5%J&K Scientific Ltd105864
Kaliumchloride, 99%, extra zuiverJ&K Scientific Ltd991468
Natriumbicarbonaat, 99,7%, ACS reagensJ&K Scientific Ltd988639
Magnesiumchloride hexahydraat, 99%, ACS reagensJ&K Scientific Ltd182158
Kaliumdiwaterstoffosfaat, 99%, extra zuiverJ&K Scientific Ltd128839
Magnesiumsulfaat heptahydraat, 99%, voor analyseJ&K Scientific Ltd119370
Calciumchlorideoplossing volumetrisch, 1,0 M CaCl2J&K Scientific Ltd21114
Rund Serum AlbumineSigma-AldrichV900933
Rat/Muis Insuline ELISA kitMillipore-lincoEZRMI-13K

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ke, T., et al. Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice. Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).
  2. Ke, T., et al. Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration. Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).
  3. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287 (5460), 2007-2010 (2000).
  4. Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118 (25), 184-191 (2011).
  5. Kato, M., Mrksich, M. Rewiring cell adhesion. J Am Chem Soc. 126 (21), 6504-6505 (2004).
  6. Cheng, H., et al. Stem cell membrane engineering for cell rolling using peptide conjugation and tuning of cell-selectin interaction kinetics. Biomaterials. 33 (20), 5004-5012 (2012).
  7. Merzaban, J. S., et al. Cell surface glycan engineering of neural stem cells augments neurotropism and improves recovery in a murine model of multiple sclerosis. Glycobiology. 25 (12), 1392-1409 (2015).
  8. Silvescu, C. I., Sackstein, R. G-CSF induces membrane expression of a myeloperoxidase glycvariant that operates as an E-selectin ligand on human myeloid cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10696-10701 (2014).
  9. Zhi, Z. L., et al. Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings. Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).
  10. Lou, S., et al. Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).
  11. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  12. Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).
  13. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
  14. Kizilel, S., et al. Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion. Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).
  15. Zhi, Z. L., et al. Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).
  16. Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction. ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).
  17. Kollmer, M., et al. Long-term function of alginate-encapsulated islets. Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).
  18. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).
  19. Zmuda, E. J., et al. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).
  20. Gey, G. O., Gey, M. K. The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation. Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).
  21. Chen, X., et al. Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach. Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).
  22. Cabric, S., et al. Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis. Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).
  23. Cabric, S., et al. Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation. Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).
  24. Asif, S., et al. Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes. Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).
  25. Teramura, Y., et al. Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers. Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).
  26. Zhi, Z., et al. Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management. Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Heparine nanocoatingStarPEG coatingisolatie van eilandjescollagenasedigestieHistopaque zuiveringheparine NHS syntheseEDC NHS koppelingfluorescentiemicroscopieFTIR analyse

Gerelateerde artikelen