Homeobox genen zijn regelgevende genen vaak geassocieerd met tumoren in de volwassen organismen. We onderzochten hun vergelijkende expressie door immunohistochemische en real-time PCR analyse, in normale en inflammatoire nasale mucosae en in sinonasal gezwellen om ze te gebruiken als mogelijk diagnostische en therapeutische doelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Identificatie van OTX1 en OTX2 als twee mogelijk moleculaire merkers voor Sinonasal carcinomen en olfactorische Neuroblastomas
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
OTX homeobox (HB) genen worden uitgedrukt tijdens de embryonale genuitdrukking en tijdens de ontwikkeling van olfactorische epitheel in volwassen organismen. Mutaties die zich voordoen in deze genen zijn vaak gerelateerd aan tumorigenesis in mens. Er zijn geen gegevens over het mogelijke verband tussen OTX genen en tumoren van de neusholte die vandaag beschikbaar zijn. Het doel van dit werk is te begrijpen als OTX1 en OTX2 kan worden beschouwd als moleculaire merkers in de ontwikkeling van tumoren van de neus. We kozen de nasale en sinonasal adenocarcinomas te onderzoeken van de expressie van genen die OTX1 en OTX2 door middel van immunohistochemical en real-time PCR-analyses. Zowel de OTX1 als de OTX2 afwezig waren in alle monsters van sinonasal Intestinal-Type Adenocarcinomas (ITACs). OTX1 mRNA werd geïdentificeerd alleen in niet-intestinale Type Adenocarcinomas (NITACs), terwijl OTX2 mRNA kwam tot uitdrukking alleen in olfactorische Neuroblastomas (ONs). We hebben aangetoond dat de differentiële genexpressie voor zowel OTX1 als OTX2 genen zou een nuttige moleculaire marker te onderscheiden van de verschillende soorten sinonasal tumoren.
Inleiding
OTX HB genen zijn de gewervelde homologe van de Drosophila orthodenticle genen (otd) en ze coderen voor transcriptiefactoren, die normaal gesproken tijdens de embryonale morfogenese worden uitgedrukt, maar ze kunnen ook worden uitgedrukt in het volwassen organisme met verschillende functies . Tijdens de embryonale ontwikkeling bepalen ze de specificatie van de cel identiteit, celdifferentiatie en de positionering van het lichaam axis¹. De familie OTX bevat OTX1 en OTX2 genen die verschillende functies weergeven. OTX1 is betrokken in de hersenen en orgel van de zintuiglijke ontwikkeling. In het volwassen organisme, het wordt uitgedrukt in zintuiglijke organen en wordt omgezet op een laag niveau in de voorste kwab van de slijmachtige klier2; het speelt ook een rol in Haematopoiese, worden uitgedrukt in de hematopoietische pluripotente en voorlopercellen cellen3. OTX2 is betrokken bij de ontwikkeling van de rostraal hoofd en haar vertaalde eiwit fungeert als een morphogen want het genereert een verloop via welke andere genen worden geactiveerd of onderdrukt wijze spatio-temporele, ten behoeve van cel proliferatie en differentiatie. OTX2 komt voor in het volwassen organisme, uitsluitend in de choroideus plexus en pijnappelklier4.
Mutaties in de genen van de OTX zijn vaak gerelateerd aan de verschijning van de mens aangeboren, somatische of metabole defecten. Winst of verlies mutaties in OTX genen kunnen tumorvorming bevorderen als zij niet kundig voor zeggenschap goed cellulaire groei en/of differentiatie5. In leukemieën en lymfomen zo goed zoals in vele solide tumoren (bijvoorbeeld, medulloblastomas6, agressief non-Hodgkin lymfomen2, borst carcinomen7, colorectal kanker8en Retinoblastoom9), de gedereguleerde expressie van genen die OTX HB is goed gedocumenteerd10. Daarnaast zijn OTX2 mutaties aangetoond in gevallen van anophthalmia en microphtalmia11 vanwege de cruciale rol voor dit gen in de controle van de ontwikkeling van het oog.
In het kader van solide gezwellen is de ontdekking van moleculaire en fenotypische markers een belangrijke uitdaging voor de diagnose, classificatie en behandeling van verschillende soorten tumor11, met inbegrip van die van oorsprong uit de neusholte en de neusbijholten zijn sinussen. In feite, ondanks dat deze gebieden bezetten slechts een bescheiden anatomische ruimte, mucosal epitheel, klieren, zachte weefsels, bot, kraakbeen of neurale/neuroectodermal, en hematolymphoid cellen kunnen vaak de site voor de oorsprong van complexe en histologisch verschillende groepen van tumoren. Verschillende typen gezwellen waarbij het sinonasal-darmkanaal presenteren een verscheidenheid aan functies die overwinnen wat wordt meestal gezien in de aerodigestive van de bovenste tractus of zelfs in de meeste delen van het lichaam12hele. Sinonasal maligniteiten zijn zeldzaam en presenteren een jaarlijkse incidentie van bewoners van de 1:100,000 wereldwijd, en dus dit voorkomt dat de studies over de trajecten die betrokken zijn bij de tumorigenesis en het testen van alternatieve behandelingsstrategieën. Ondanks dit, de vooruitgang in de beeldvormende technieken, verbeterd chirurgische benaderingen en radiotherapie de klinische behandeling van kanker van de sinonasal. Bovendien, de ontwikkeling van cellijnen, alsmede diermodellen en kanker genetische profielen momenteel de basis vormen voor de toekomstige gerichte antikanker therapieën13. Tot op heden zijn er geen rapporten met betrekking tot OTX1 en/of OTX2 expressie in gezwellen van de neusholte, de bijholten en de Nasofarynx. Aangezien wij hebben eerder geconstateerd dat de OTX1 en OTX2 zijn betrokken bij borst kanker7, we vroegen ons af als deze genen aanwezig zijn niet alleen in de normale nasale mucosa maar ook in tumoren van de neusholte kon zijn. Dit doel die wij verkregen uit de afdeling pathologie van het "Ospedale di Circolo" in Varese monsters van normaal mucosa en nasaal en sinonasal adenocarcinomas die van 1985 tot 2012 verzameld en ingedeeld volgens de World Health Organization (WHO) te bereiken classificatie van hoofd en hals tumoren. Wij willen door middel van real-time PCR en immunohistochemistry analyses te analyseren en we geëvalueerd uitdrukking van OTX1 en OTX2 om te bepalen als zij moleculaire merkers voor deze soorten tumoren kunnen worden beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle studies werden uitgevoerd volgens de verklaring van Helsinki (1975) met schriftelijke geïnformeerde toestemming en goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Insubrië in Varese.
1. het verzamelen van de monsters
- Verzamelen en verdelen van alle menselijke Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) monsters in verschillende subgroepen volgens de WHO-classificatie van hoofd en hals tumoren14.
Opmerking: Hier de volgende voorbeelden wordt gebruikt: normale sinonasal mucosa als besturingselement (10 monsters); Inverted Papilloma (IP, ICD-O code 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O code 8144/3, 32 monsters); NITAC (ICD-O code 8140/3, 12 monsters); Adenoid Cystic Carcinoma (ACC, ICD-O code 8200/3); Pleomorfe adenoom (PA, ICD-O code 8941/3); OP (ICD-O code 9522/3, 13 monsters); Slecht gedifferentieerd neuro-endocriene Carcinoma (PDNEC, ICD-O code 8041/3, 19 monsters); Neuro-endocriene Tumor (netto, ICD-O code 8041/3).
2. de immunochemie
-
Deparaffinization en rehydratie van secties
- Verwarm de voorbeelddia's in een oven op 60 ° C gedurende 30 minuten en hydrateren 3 µm dik FFPE secties met behulp van een reeks van de alcohol aan water.
- Kort wassen van de dia's in xyleen gedurende 10 minuten en herhaalt u deze stap; de dia's gedurende 5 minuten wassen in 100% alcohol en herhaalt u deze stap met behulp van 95%, 85% en 75% alcohol serieel. Spoel de dia's gedurende 5 minuten in gedistilleerd water.
-
Het blokkeren van de endogene activiteit
- Blokkeren de endogene activiteit door het plaatsen van de dia's in de waterige waterstofperoxide 3% voor 12 min.
-
Antigeen ophalen
- Herwinning van het antigeen door de behandeling met 10 mM citraat Buffer (pH 6) gedurende 10 minuten in een magnetron-behandeling uitvoeren
-
Incubatie met primair antilichaam
- Wassen van de secties in TBS buffer (pH 7.4), voeg dan blokkeren oplossing voor 10 min.
- Wassen van de secties in TBS buffer (pH 7.4), voeg dan 0,2% Triton X.
- Na een nacht bebroeden bij 4 ° C met geit anti-menselijke OTX2 antilichaam verdund 1:100.
-
Incubatie met secundair antilichaam
- Incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met biotinyleerd konijn anti-geit secundair antilichaam verdund 1:200 gevolgd door ABC-peroxidase complex (Zie Tabellen van materialen).
-
Ontwikkeling van de immunoreaction
- Ontwikkelen van de immunoreaction met behulp van 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride en counterstain van de kernen met Harris Hematoxylin.
-
Montage en beeldvorming
- Uitdrogen van de secties met behulp van een halve alcohol-schaal en verduidelijken ze met behulp van een stof van de clearing van terpeen oorsprong (Zie Tabel van materialen). Secties in montage medium insluiten, plaatst u de secties op een microscoopglaasje en observeren van de secties door een optische Microscoop.
3. RNA extractie en Reverse-transcriptie
-
RNA extractie
- RNA uittreksel uit de secties door het uitvoeren van de eerste stap van immunoprecipitation protocol (zie punt 2.1) en de dia's blijven in gedestilleerd water. Het Onbevlekt secties overlappen met de overeenkomstige Haematoxyline-eosine gekleurd secties teneinde fragmenten van belang.
- Het RNA extractie met behulp van een commerciële RNA extractie kit voor FFPE monsters (Zie Tabel van materialen) en volgende fabrikant instructies uit te voeren.
-
RNA omgekeerde-transcriptie
- Gebruik een commerciële kit naar retro-transcriberen RNA in cDNA (Zie Tabel van materialen) volgens het protocol. Retro-transcriberen ten minste 1.000 ng van totale RNA verschillende analyses uitvoeren.
4. real-time PCR en Data-analyse
-
PCR in real time
- Uitvoeren van kwantitatieve analyses voor real-time PCR (qRT-PCR) met sonde gebaseerde technologie (Zie Tabel van materialen) en een thermische cycler.
-
Voorbereiding van de PCR-mix
- Voorbereiden van de PCR-mix met behulp van 12,5 µL van sonde gebaseerde master mix, 1,25 µL van OTX1, OTX2 en ACTB sondes (Zie Tabel of Materials), 50 ng van cDNA, en nuclease-gratis water maximaal 25 µL van het totale volume.
- Alle reacties in drievoud met behulp van het ACTB gen als de endogene controle te normaliseren van gen expressie niveau uitvoeren.
- Centrifugeer de plaat bij 1,109 x g gedurende 3 min en bewaar de plaat beschermd tegen licht bij 4 ° C tot en met het experiment.
-
Instellen van de thermische cycler
- Set de thermische cycler profiel met een eerste warme start cyclus bij 50 ° C gedurende 2 minuten en 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli bij 95 ° C voor 15 s en een laatste cyclus bij 60 ° C voor 1 min.
-
Gen expressie niveau analyses
- Normaliseren de gen expressie niveaus via de vergelijkende cyclus drempel (ΔCt)-methode met behulp van het ACTB gen als de endogene controle.
- Evalueren van gen expressie niveaus met behulp van de methode 2-ΔCt en het uitzetten van de resultaten.
-
Statistische analyses
- Het uitvoeren van statistische analyses met behulp van de Student t-Test, gelet op statistisch significante resultaten met p < 0.05.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de normale mucosa waargenomen sterke en homogene nucleaire reactiviteit voor OTX genen in de ciliated pseudostratified epitheel van de luchtwegen-type zowel in de submucosal klieren cellen (figuur 1A). We vonden nucleaire expressie voor OTX1 in alle NITACs monsters (figuur 1B), terwijl weinig of afwezige immunoreactivity werd benadrukt in ITACs (Figuur 1 c). Intense immunoreactivity was aanwezig i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie toont voor de eerste keer dat, op basis van mRNA de niveaus, de HB-genen OTX1 en OTX2 worden uitgedrukt in normale sinonasal mucosa en submucosal klieren, inflammatoire poliepen, sinonasal Schneiderian papillomas, en in de verschillende epitheliale en neuroectodermal gezwellen, met inbegrip van squamous carcinomen, niet-intestinale type sinonasal adenocarcinomas speekselklier-type tumoren, neuro-endocriene gezwellen en ONs.
Wijzigingen en probleemoplossing:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door Centro Grandi Strumenti Università dell'Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia en Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Uit productie. Reeks beschermd door auteursrecht | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Uit productie. Reeks beschermd door auteursrecht | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Uit productie. Reeks beschermd door auteursrecht | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Uit productie. Catalogusnummer niet beschikbaar | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
Referenties
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma. American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).
- Levantini, E., et al. Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).
- Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain. J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).
- Abate-Shen, C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence? Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).
- de Haas, T., et al. OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).
- Terrinoni, A., et al. OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53. Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).
- Yu, K., et al. OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition. Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).
- Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma. J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).
- Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis. J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).
- Cordes, B., et al. Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification. Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).
- Stelow, E. B., Bishop, J. A. Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base. Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).
- Llorente, J. L., et al. Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).
- Sidransky, D. World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors. 9, WHO Press. (2005).
- Radulesku, T., et al. Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).
- Muller, P. A. J., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Holmila, R., et al. Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer. Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
