Het combineren van kwantitatieve voedselinname-Assays en onder dwang activeren neuronen om te bestuderen van eetlust in Drosophila

Samenvatting

Kwantitatieve voedselinname testen met geverfd voedsel bieden een robuuste en high-throughput betekent om voeding motivatie. De voedsel consumptie-bepaling te combineren met thermogenetic en optogenetic schermen is een krachtige aanpak van de onderzoeken van de neurale circuits die ten grondslag liggen aan de eetlust in volwassen Drosophila melanogaster.

Samenvatting

De voedselconsumptie is onder de strakke controle van de hersenen, die integreert de fysiologische status, smakelijkheid en voeding inhoud van de voedingsmiddelen, en kwesties opdrachten starten of stoppen van de voeding. Ontcijferen van de processen die ten grondslag liggen aan de besluitvorming van tijdige en matig voeden draagt grote gevolgen in ons begrip van de fysiologische en psychologische aandoeningen gerelateerd aan het voeden van de controle. Robuuste, eenvoudige en kwantitatieve methoden zijn vereist voor het meten van de inname van het voedsel van dieren na experimentele manipulatie, zoals gedwongen het verhogen van de activiteiten van bepaalde doel neuronen. Hier, introduceerden we kleurstof labeling-gebaseerde voeding tests om te vergemakkelijken de neurogenetic studie van het voederen van controle in volwassen fruitvliegjes. Wij bekijken beschikbaar voeding testen en vervolgens beschrijven onze stap voor stap van setup analyse, die combineren thermogenetic en optogenetic manipulatie van neuronen controleren voeding motivatie met kleurstof-geëtiketteerden voedsel inname test methoden. Ook bespreken we de voordelen en beperkingen van onze methodes, in vergelijking met andere voeding testen, om te helpen lezers kiezen van een passende bepaling.

Inleiding

Kwantificeren van de hoeveelheid geconsumeerd voedsel is belangrijk voor de evaluatie van meerdere aspecten van het voederen van controles door de hersenen in reactie op de interne behoeften (zoals honger de Staten) en externe factoren (zoals voedselkwaliteit en smakelijkheid)^{1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. in de afgelopen jaren, de inspanningen van het ontcijferen va....

Protocol

1. voorbereiding van de voeding zaal

Opmerking: De voeding zaal voor voeding assay kleurstof-labeling bestaat uit twee delen: de buiten container (als een cover) en de binnenkant container (als bron van voedsel).

1. Wijzigen van de buiten container uit een flesje van glas voor het kweken van Drosophila met (een inwendige diameter van 31.8 mm) en een lijfhoogte van 80 mm (figuur 1A, 1 C). Dekking de onderkant van de container met een laagje van 1% agarose (5 mL) te houden van de voeding setup goed bevochtigde en dienen als een zachte ondergrond voor de vliegen om....

Resultaten

Thermogenetic scherm.

Abnormaal verhoogde eetlust veroorzaakt verhoogde voedselinname, ongeacht de fysiologische behoeften. We gebruikt deze regeling voor het ontwerpen van een high-throughput gedrags scherm te verkrijgen van genetische handgrepen van neuronen met betrekking tot honger en verzadigd Staten (Figuur 1). Het scherm leverde Taotie-Gal4-²⁴. Wanneer de .......

Discussie

Dit rapport richt zich op het technische proces van kleurstof-labeling voeding tests van de voedselconsumptie in de context van thermogenetic en optogenetic activering te manipuleren neuronen controleren van voeding. Dit eenvoudig en betrouwbaar protocol zal bijdragen tot het ophelderen van de functie van neuronen van de kandidaat voor het voederen van controle, voor het meten van de voedsel-voorkeur van vliegen en identificeren van nieuwe spelers in de voeding aanstuurkringen via genetische schermen voederen gebaseerde<.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
UAS-CsChrimson	Bloomintoon	55135
UAS-dTrpA1	Bloomintoon	26263
TDC1-GAL4	Bloomintoon	9312
TDC2-GAL4	Bloomintoon	9313
sNPF-GAL4			Verstrekt door Z. Zhao
NPF-GAL4			Verstrekt door Y. Rao
TH-GAL4			Verstrekt door Y. Rao
5-HT-GAL4			Verstrekt door Y. Rao
AKH-GAL4			Verstrekt door Y. Rao
dip2-GAL4			Verstrekt door Y. Rao
Taotie-GAL4			Verstrekt door J. Carlson
Agarose	Biowest	G-10
Sucrose	Sigma	S7903
Erioglaucine disodium salt	Sigma	861146
all-trans-retinal	Sigma	R2500	bewaard in het donker
Triton X-100	Amresco	9002-93-01
Vliegvoer		1 L voedsel bevat: 77,7 g maïsmeel, 32,19 g gist, 5 g agar, 0,726 g CaCl2, 31,62 g sucrose, 63,2 g glucose, 2 g kaliumsorbaat, pH
1x PBS-buffer		1 L 1X PBS bevat: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, pH 7,4
PBST-buffer		1X PBS met 1% Triton X-100
Maalmolen	Shang Hai Jing Xin	Tissuelyser-24
Incubator	Ning Bo Jiang Nan	HWS-80
Magneetroerer met een verwarmingsplaat	Chang Zhou Bo Yuan	CJJ 78-1
Spectrometer	Thorlabs	CCS200/M
Microplate spectrofotometer	Thermo Scientific	Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200
Fluorescentie stereomicroscoop	Leica	M205FA
Stereomicroscoop	Leica	S6E
Buitenkoker	Jiang Su Hai Men	glazen buisje met een diameter van 31,8 mm en een hoogte van 80 mm (binnenmaat)
Binnencontainer	Beijing Yi Ran-machinefabriek	kunststof schaaltje met een diameter van 13,6 mm en een hoogte van 7,5 mm (binnenmaat)
1,5 mL Eppendorfbuisjes	Hai Men Ning Mong
96-wellsplaat	Corning Incorporated	Costar 3599
LEDs	Xin Xing Yuan Guangdian	607 nm, 3W	https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058