Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

Kristina J. Allan; Douglas J. Mahoney; Stephen D. Baird; Charles A. Lefebvre; David F. Stojdl

doi:10.3791/56913

Methodenartikel

Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

8.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56913

⸱

3 april 2018

Kristina J. Allan¹^,² , Douglas J. Mahoney¹^,⁴ , Stephen D. Baird¹ , Charles A. Lefebvre¹ , David F. Stojdl¹^,²^,³

¹Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, ²Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, ³Department of Pediatrics, University of Ottawa, ⁴Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Samenvatting

High-throughput genoom-brede RNAi (RNA-interferentie) screening technologie is wijd verbeid gebruikt om gastheer factoren die van invloed zijn virus replicatie te ontdekken. Hier presenteren we de toepassing van deze technologie op blootleggen host doelen die specifiek het moduleren van de replicatie van Maraba virus, een oncolytische rhabdovirus en vacciniavirus met als doel verbetering van de therapie. Terwijl het protocol is getest voor gebruik met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, deze aanpak geldt voor andere oncolytische virussen en kan ook worden gebruikt voor de identificatie van de host-doelen die moduleren virus replicatie in zoogdiercellen in algemene. Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een assay voor high-throughput RNAi screening in zoogdiercellen, belangrijke overwegingen en voorbereiding maatregelen belangrijk zijn voor het uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm, en een stapsgewijze handleiding voor uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm; Bovendien is het in grote lijnen schetst voor de methoden voor de uitvoering van de secundaire scherm validatie en tertiaire validatieonderzoek. Het voordeel van high-throughput RNAi screening is dat het maakt het mogelijk een catalogus, in een uitgebreide en onbevooroordeelde manier, gastheer factoren die enig aspect van virus replicatie waarvoor een een in vitro assay zoals infectiviteit ontwikkelen kan, moduleren barsten grootte, en cytotoxiciteit. Het heeft de bevoegdheid om te ontdekken van biotherapeutic doelstellingen onvoorziene op basis van de huidige kennis.

Inleiding

High-throughput genoom-brede RNAi screening is gebleken een instrument van onschatbare waarde voor het openbaren van biologische inzichten in diverse gebieden van studie, met inbegrip van virus biologie. In de afgelopen tien jaar of zo, talrijke groepen hebben zich ertoe verbonden cel-gebaseerde grootschalige RNAi screening om te identificeren uitgebreid host genen die virus replicatie (herzien in¹^,²^,,³^,^{4 moduleren} ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷). interessa....