We beschrijven de strategie van de productie van integrase-deficiënte lentivirale vectoren (IDLVs) als voertuigen voor het leveren van CRISPR/Cas9 naar de cellen. Met een vermogen om te bemiddelen snelle en robuuste gene bewerken in cellen, IDLVs presenteren een veiliger en even effectieve vector platform voor de levering van het gen in vergelijking met integrase-bevoegde vectoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Lentivirale vectoren zijn een ideale keuze voor het bewerken van gene onderdelen leveren naar de cellen als gevolg van hun capaciteit voor stabiel transducing een brede waaier van cellen en bemiddelen van hoge niveaus van de genexpressie. Echter, hun vermogen om te integreren in het genoom van de cel host verhoogt het risico dat mutageniteit en dus verhoogt bezorgdheid over de veiligheid en beperkt hun gebruik in klinische instellingen. Verder, de aanhoudende uitdrukking van gen-editing-onderdelen geleverd door deze verhogingen van de integratie-bevoegde lentivirale vectoren (ICLVs) de kans op promiscue gentargeting. Als alternatief, heeft een nieuwe generatie van integrase-deficiënte lentivirale vectoren (IDLVs) ontwikkeld, waarin veel van deze zorgen. Hier het protocol van de productie van een nieuwe en verbeterde IDLV platform voor CRISPR-gemedieerde gene bewerken en lijst de stappen betrokken bij het zuiveren en concentratie van dergelijke vectoren wordt beschreven en hun transductie en bewerken van gen efficiëntie met behulp van HEK-293T cellen werd aangetoond. Dit protocol is eenvoudig schaalbaar en kan worden gebruikt voor het genereren van hoge titer IDLVs die kunnen transducing cellen in vitro en in vivo. Dit protocol kunnen bovendien gemakkelijk aan te passen voor de productie van ICLVs.
Inleiding
Precieze gene bewerken vormt de hoeksteen van grote biomedische ontwikkelingen die betrekking hebben op de ontwikkeling van nieuwe strategieën om genetische ziekten te bestrijden. Op de voorhoede van gen-bewerken technologieën is de methode afhankelijk van het gebruik van de clustered regularly -Iknterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / Cas9-systeem dat aanvankelijk werd geïdentificeerd Als een onderdeel van bacteriële immuniteit tegen de invasie van virale genetische materiaal (herzien in verwijzingen1,2). Een groot voordeel van het systeem van CRI....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. het kweken van HEK-293T cellen en cellen zaaien voor Transfectie
Opmerking: Menselijke embryonale nier 293T (HEK-293T) cellen worden gekweekt in DMEM, hoge glucose media aangevuld met 10% boviene kalfsserum aangevuld met ijzer en groei initiatiefnemers, en 1 x antibiotica-antimycotic oplossing (100 x oplossing bevat 10.000 eenheden penicilline 10 mg streptomycine en 25 µg amfotericine B per mL). De media is ook aangevuld met 1 x natrium pyruvaat, 1 x niet-essentiële aminozuur mix en 2 mM L-Glutamine (voorraad 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0,85% NaCl). Cellen worden gekweekt in 100 mm weefselkweek platen (geschatte groei oppervla....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Validatie van de knock-out-efficiëntie van IDLV-CRISPR/Cas9 vectoren
We gebruikten GFP-uiting van 293T cellen als een model voor het valideren van de efficiëntie van CRISPR/Cas9-gemedieerde gene knock-out. GFP + cellen werden gegenereerd door transductie van HEK-293T cellen met lolploeg-GFP (vBK201a) bij een MOI van 0,5 (Figuur 3b, "neen-virus" paneel). De sgRNA-naar-GFP/Cas9 alles-in-één vector cassette was verpakt in IDLV of ICLV deeltje.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
IDLVs zijn begonnen te ontstaan als het voertuig van keuze voor in vivo gen-bewerking, met name in het kader van genetische ziekten, grotendeels als gevolg van het geringe risico van mutagenese gekoppeld aan deze vectoren in vergelijking met de integratie van levering platformen22 , 28. in het huidige manuscript, wij willen het protocol die samenhangen met de opwekking van het verbeterde alles-in-één IDLV-CRISPR/Cas9-systeem, dat onlangs in ons laborator.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Patent USC-499-P (1175) werd ingediend door de Universiteit van South Carolina met betrekking tot het werk beschreven in dit manuscript.
Dankbetuigingen
We zouden graag bedanken het departement van neurobiologie, Duke University School of Medicine en Dean's Bureau voor fundamentele wetenschap, Duke University. Wij danken ook leden van de Duke virale-Vector kern voor opmerkingen op het manuscript. Plasmide lolploeg CRISPRv2 was een geschenk van Feng Zhang (brede Instituut). De LV-verpakkingen systeem met inbegrip van de psPAX2 van plasmiden, was VSV-G, pMD2.G en pRSV-Rev een soort geschenk van Didier Trono (EPFL, Zwitserland). Financiële steun voor dit werk werd verstrekt door de University Of South Carolina School Of Medicine, verlenen RDF18080-E202 (B.K).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| Allegra 25R tafelcentrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| xMark Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Omgekeerde fluorescentiemicroscoop | Leica | DM IRB2 | |
| 0,45-μm filterunit, 500mL | Corning | 430773 | |
| Ultracentrifugeerbuizen met conische bodem | Seton Scientific | 5067 | |
| Adapters voor conische buizen | Seton Scientific | PN 4230 | |
| SW32Ti swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| 15 mL conische centrifugeerbuizen | Corning | 430791 | |
| 50mL conische centrifugeerbuizen | Corning | 430291 | |
| High-binding 96-well platen | Corning | 3366 | |
| 150 mm TC-behandelde celcultuurschalen met 20 mm raster | Corning | 353025 | |
| 100mm TC-behandelde kweekschaal | Corning | 430167 | |
| 0,22 μM filterunit, 1L | Corning | 430513 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Weefselcultuur pipetten, 5 mL | Corning | 4487 | |
| Weefselcultuur pipetten, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Weefselcultuur pipetten, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Hemacytometer met deksels | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Celcultuurreagentia | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cellen | ATCC | CRL-3216 | |
| 293FT cellen | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| DMEM, hoge glucose media | Gibco | 11965 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| Antibioticum-antimycotic oplossing, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Natriumpyruvaat | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| Niet-essentiële aminozuur (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Trypsine-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethaansulfonzuur) | Sigma Aldrich | B9879 - BES | |
| Gelatine | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| p24 ELISA reagentia | |||
| Monoklonaal anti-p24 antilichaam | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| HIV-1 standaarden | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Polyklonaal konijn anti-p24 antilichaam | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| Geiten anti-konijn paardenradenperoxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Werkconcentratie 1:1500 |
| Normaal muis serum, sterieel, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Geiten serum, sterieel, 10mL | Sigma | G9023 | Werkconcentratie 1:1000 |
| TMB peroxidase substraat | KPL | 5120-0076 | Werkconcentratie 1:10.000 |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Plasmids | |||
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
| Restrictie-enzymen | |||
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Referenties
- Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
