Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen

16K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/56915

⸱

12 december 2017

 , 
1Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven de strategie van de productie van integrase-deficiënte lentivirale vectoren (IDLVs) als voertuigen voor het leveren van CRISPR/Cas9 naar de cellen. Met een vermogen om te bemiddelen snelle en robuuste gene bewerken in cellen, IDLVs presenteren een veiliger en even effectieve vector platform voor de levering van het gen in vergelijking met integrase-bevoegde vectoren.

Samenvatting

Lentivirale vectoren zijn een ideale keuze voor het bewerken van gene onderdelen leveren naar de cellen als gevolg van hun capaciteit voor stabiel transducing een brede waaier van cellen en bemiddelen van hoge niveaus van de genexpressie. Echter, hun vermogen om te integreren in het genoom van de cel host verhoogt het risico dat mutageniteit en dus verhoogt bezorgdheid over de veiligheid en beperkt hun gebruik in klinische instellingen. Verder, de aanhoudende uitdrukking van gen-editing-onderdelen geleverd door deze verhogingen van de integratie-bevoegde lentivirale vectoren (ICLVs) de kans op promiscue gentargeting. Als alternatief, heeft een nieuwe generatie van integrase-deficiënte lentivirale vectoren (IDLVs) ontwikkeld, waarin veel van deze zorgen. Hier het protocol van de productie van een nieuwe en verbeterde IDLV platform voor CRISPR-gemedieerde gene bewerken en lijst de stappen betrokken bij het zuiveren en concentratie van dergelijke vectoren wordt beschreven en hun transductie en bewerken van gen efficiëntie met behulp van HEK-293T cellen werd aangetoond. Dit protocol is eenvoudig schaalbaar en kan worden gebruikt voor het genereren van hoge titer IDLVs die kunnen transducing cellen in vitro en in vivo. Dit protocol kunnen bovendien gemakkelijk aan te passen voor de productie van ICLVs.

Inleiding

Precieze gene bewerken vormt de hoeksteen van grote biomedische ontwikkelingen die betrekking hebben op de ontwikkeling van nieuwe strategieën om genetische ziekten te bestrijden. Op de voorhoede van gen-bewerken technologieën is de methode afhankelijk van het gebruik van de clustered regularly -Iknterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / Cas9-systeem dat aanvankelijk werd geïdentificeerd Als een onderdeel van bacteriële immuniteit tegen de invasie van virale genetische materiaal (herzien in verwijzingen1,2). Een groot voordeel van het systeem van CRISPR/Cas9 over andere gen-bewerkingsgereedschap, zoals zink-vinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs) (herzien in verwijzing3), is de relatieve eenvoud van plasmide ontwerp en bouw van de CRISPR componenten — een functie die de uitbreiding van het gen-bewerkingen van enkele gespecialiseerde laboratoria tot een veel ruimere onderzoeksgemeenschap heeft aangedreven. Bovendien hebben de eenvoud van CRISPR/Cas9 programmering en haar capaciteit voor multiplexed doel erkenning voor het verder aangewakkerd zijn populariteit als een rendabele en easy-to-use technologie. Onder de verschillende methoden beschikbaar voor onderzoekers te leveren van dergelijke componenten bewerken van gen naar cellen, blijven virale vectoren verreweg het populairste en meest efficiënte systeem.

Lentivirale vectoren (LVs) opgedoken als het voertuig van keuze te leveren van de onderdelen van CRISPR/Cas9 systeem in vivo voor uiteenlopende toepassingen4,5,6,7. Aantal belangrijke functies maken LVs een populaire keuze voor dit proces met inbegrip van hun vermogen om te verdelen en niet-delende cellen, lage immunogeniciteit zowel minimale cellulaire toxiciteit (herzien in verwijzing8) besmetten. Dientengevolge, is LV-gemedieerde gentherapie werkzaam in de behandeling van infectieziekten, zoals HIV-1, HBV en HSV-1, alsook in de correctie van fouten ten grondslag liggen aan erfelijke ziekten bij de mens, zoals mucoviscidose en neo-vasculaire macula degeneratie 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Bovendien, LVs effectief zijn gewijzigd om een multiplex gene bewerkingsfuncties op verschillende genomic loci met behulp van een enkele vector systeem12.

Echter de inherente eigenschap van LVs te integreren in het genoom van de gastheer kan mutagene en handicaps vaak hun nut als transgenic leverende voertuigen, met name in klinische instellingen. Bovendien, aangezien stabiel geïntegreerde LVs hun transgenen op een duurzaam hoog niveau uiten, dit systeem is niet geschikt voor de levering van gen-bewerken onderdelen zoals CRISPR/Cas9; overexpressie van Cas9-gids RNA (gRNA), en soortgelijke eiwitten zoals ZFNs, worden geassocieerd met verhoogde niveaus van off-target effecten, waaronder ongewenste mutaties13,14,15,16 , 17 en het potentieel van de cytotoxiciteit18kan verbeteren. Daarom, om precieze gen-bewerken met minimale uit-target effecten, is het noodzakelijk om ontwerpsystemen waarmee voor de voorbijgaande expressie van gen editing-onderdelen.

In de afgelopen jaren een scala aan levering platforms zijn ontwikkeld om te Transient express CRISPR/Cas9 in cellen16,19,20,21 (herzien in verwijzing22). Het gaat hierbij om methoden die afhankelijk zijn van direct invoering van gezuiverde Cas9 samen met de juiste gids RNAs in cellen, die werd getoond om meer effectief bij gerichte gen-bewerken in vergelijking met de plasmide gemedieerde transfectie16. Studies hebben aangetoond dat ribonucleoprotein (RNP) complexen bestaande uit begeleiden RNA/Cas9 deeltjes zijn snel overgedragen na bemiddeling van DNA decollete op hun doelen, suggereert dat op korte termijn uitdrukking van deze componenten is voldoende om te bereiken robuuste gene16bewerken. Denkbaar, niet-integratie van virale vector platforms zoals adeno-geassocieerde virale vectoren (AAVs) bieden een levensvatbaar alternatief voor het bewerken van gen machines leveren aan cellen. Helaas, AAV capsids aanzienlijk lager verpakking mogelijkheid dan LVs bezitten (< 5kb), die ernstig belemmert hun vermogen voor het inpakken van de multi-component CRISPR toolkit binnen een enkele vector (herzien in verwijzing8). Het is vermeldenswaard dat toevoeging van verbindingen die remmen Histon deacetylases (b.v., natrium butyraat23) of belemmeren van de celcyclus (b.v., cafeïne24) is aangetoond dat het verhogen van lentivirale titers. Ondanks de recente vooruitgang, zijn de Transiënte expressiesystemen ontwikkeld tot nu toe nog steeds belemmerd door verschillende tekortkomingen, zoals lagere productie-efficiëntie, die tot verminderde virale titers, en lage transductie efficiëntie van de virussen die zijn gegenereerd leiden door dergelijke benaderingen25.

Integrase-deficiënte lentivirale vectoren (IDLVs) vormen een grote vooruitgang in de ontwikkeling van gen-leverende voertuigen, zoals zij het vermogen van de verpakking van LVs met het extra voordeel van AAV-achtige episomal onderhoud in cellen combineren. Deze voorzieningen helpen IDLVs grotendeels het omzeilen van de belangrijke kwesties in verband met het integreren van vectoren, vis-à-vis continu overexpressie van potentieel genotoxisch elementen en integratie-gemedieerde mutageniteit. Het werd eerder aangetoond dat IDLVs met succes kan worden aangepast voor het verbeteren van de episomal gen expressie26,27. Met betrekking tot de CRISPR/Cas9 IDLV-gemedieerde levering beperkt lage productie titers en lagere expressie van isomer overgedragen genomen ten opzichte van integrase-bedreven lentivirale systemen hun nut als bona fide tools voor het leveren van genoom-bewerken transgene constructies. We onlangs aangetoond dat zowel transgenic expressie en virale titers IDLV productie gekoppeld aanzienlijk worden verhoogd door de opneming van bindende sites voor de transcriptiefactor Sp1 binnen de virale expressie cassette28. De gewijzigde IDLVs ondersteund krachtig CRISPR-gemedieerde gene zowel in vitro (HEK-293T cellen) en in-vivo (in post mitotische hersenen neuronen), terwijl het minimale uit-target mutaties ten opzichte van de bijbehorende ICLV-gemedieerde inducerende bewerken systemen28. Globaal, ontwikkelden we een roman, compact, alles-in-één CRISPR toolkit uitgevoerd op een platform van IDLV en geschetst van de verschillende voordelen van het gebruik van dergelijke een leveringsvoertuig voor het bewerken van de verbeterde gen.

Hier, is het protocol van de productie van de IDLV-CRISPR/Cas9-systeem beschreven, met inbegrip van de verschillende stappen in de vergadering, zuivering, concentratie en titratie van IDLVs, evenals strategieën voor het valideren van het bewerken van gene werkzaamheid van deze vectoren. Dit protocol is eenvoudig schaalbaar naar de behoeften van verschillende onderzoekers en is ontworpen om met succes tot LV vectoren met titers in het bereik van 1 x 1010 eenheden (TU) transducing / mL. De vectoren gegenereerd door dit protocol kunnen worden gebruikt om verscheidene verschillende soorten cellen, met inbegrip van moeilijk-aan-transduce embryonale stamcellen, hematopoietische cellen (T-cellen en macrofagen), en gekweekt en in vivo- efficiënt te besmetten ingespoten neuronen. Bovendien is het protocol is even geschikt voor de productie van integrase-bevoegde lentivirale vectoren in vergelijkbare hoeveelheden.

figure-introduction-1
Figuur 1: IDLV verpakking. (a) schematische voorstelling van de wild type integrase eiwit (b) de gemodificeerde plasmide is afgeleid van psPAX2 (Zie methoden, plasmide constructie voor details). Vertegenwoordiger agarose gel afbeelding van klonen gescreend voor gemuteerde integrase klonen. Bereid met behulp van een standaard plasmide DNA isolatie Mini-Kit DNA-monsters werden geanalyseerd door de spijsvertering met EcoRV en SphI. De kloon van goed verteerd (nummer 5, onderbroken rood kader) werd verder gecontroleerd door directe (Sanger) volgorde van de vervanging van de D64E in INT. De integrase-deficiënte verpakking cassette heette pBK43. (c) schematische voorstelling van het protocol van de voorbijgaande transfectie werkzaam voor het genereren van IDLV-CRISPR/Cas9 vectoren, toont 293T cellen transfected met VSV-G, verpakking en transgenic cassettes (plasmide van de alles-in-één van de Sp1-CRISPR/Cas9). Virale deeltjes die bud uit van de celmembraan bevatten de full-length RNA van de vector (uitgedrukt uit de transgenic cassette). De tweede generatie van het systeem van de IDLV-verpakking werd gebruikt, waaronder de regelgevende eiwitten Tat en Rev. Rev expressie is verder aangevuld van een aparte cassette (RSV-REV-plasmide). Abbrev: LTR-lange-terminal herhalen, VSV-G, vesiculaire stomatitis virus G-eiwit, pCMV-cytomegalovirus promotor; Rous Sarcoom virus (RSV) promotor; RRE-(Rev respons-Element). Andere regulerende elementen op de expressie cassette opnemen Sp1-bandplaatsen, Rev Response element (RRE), Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional regelgevende Element (WPRE), een kern-rek factor 1α promotor (EFS-NC), de vector-verpakking element ψ (psi), menselijke Cytomegalovirus (hCMV) promotor en menselijke U6 promotor. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. het kweken van HEK-293T cellen en cellen zaaien voor Transfectie

Opmerking: Menselijke embryonale nier 293T (HEK-293T) cellen worden gekweekt in DMEM, hoge glucose media aangevuld met 10% boviene kalfsserum aangevuld met ijzer en groei initiatiefnemers, en 1 x antibiotica-antimycotic oplossing (100 x oplossing bevat 10.000 eenheden penicilline 10 mg streptomycine en 25 µg amfotericine B per mL). De media is ook aangevuld met 1 x natrium pyruvaat, 1 x niet-essentiële aminozuur mix en 2 mM L-Glutamine (voorraad 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0,85% NaCl). Cellen worden gekweekt in 100 mm weefselkweek platen (geschatte groei oppervlakte is 55 cm²). Een sub teelt verhouding van 1:10 wordt gebruikt met de sub kweken van elke 2-3 dagen. Trypsine-EDTA 0,05% wordt gebruikt voor de dissociatie van cellen tussen passages. Om redenen van consistentie tussen experimenten, wij adviseren testen kalf sera wanneer het schakelen naar een andere veel/batch en controleren van wijzigingen in de celgroei, transfectie efficiëntie, en vector productie.

  1. Start een nieuwe cultuur met lage passage cellen (het is aanbevolen om de cellen niet te gebruiken na passage 15 of als groei vertraagt) door zaaien in een 10-cm weefselkweek plaat. Gebruik DMEM aangevuld met 10% serum voor celgroei. Het groeien van cellen bij 37 ° C met 5% CO2 in een standaard weefselkweek incubator. Gebruik een standaard hemocytometer om cellen voor alle volgende stappen tellen.
  2. Zodra de cellen bij 90-95% confluente groei, reseed in 15 cm weefselkweek platen (hieronder stappen 1.3 - 1.5).
  3. Om reseed, media van de confluente plaat gecombineerd en zachtjes afspoelen met steriele 1 x PBS. Cellen met 2 mL van een dissociatie reagens (b.v., trypsine-EDTA) incuberen bij 37 ° C gedurende 3-5 min. Voeg 8 mL medium met serum om de inactivering van het reagens dissociatie, en triturate van 10 - 15 keer met een pipet 10 mL serologische maken een enkele cel schorsing. Resuspendeer de cellen in de voedingsbodems voor het verkrijgen van een celdichtheid van ongeveer 4 x 106 cellen/mL.
  4. Om naleving van het substraat te verbeteren, jas vooraf de 15 cm platen met 0,2% gelatine, toevoeging van 8 mL gelatine per plaat. Verspreid gelijkmatig over het oppervlak van de plaat, Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en sifon uit de vloeistof.
  5. Zodat het totale volume van elke plaat tot 25 mL met warm (37 ° C)-HEK-293 T media (zie opmerking onder stap 1) en zaad van de platen door toevoeging van 2.5 mL van cellen (totaal ~ 1 x 107 cellen/plaat). Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 's nachts of tot 70-80% confluentie is bereikt.
    Opmerking: Maximaal zes 15 cm platen kan worden gebruikt voor de productie. Volume van media per plaat tot ~ 20-22 mL aanpassen bij het gebruik van meer dan vier platen (zie stap 5 van het protocol voor rationale).

2. transfecting HEK-293T cellen met behulp van een Protocol calciumfosfaat gebaseerde

  1. Transfectie reagentia
    1. Ter voorbereiding van 2 x BES-gebufferd oplossing BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1.5 mM nb2HPO4), het combineren van 16.36 g NaCl, 10.65 g van BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-amino-ethanesulfonic acid), en Na2HPO40.21 g. Toevoegen van tweemaal gedestilleerd H2O (dd-H2O) tot 900 mL. Ontbinden en titreer pH 6,95 met 1 M NaOH brengen volume aan 1 L. Filter via 0,22 µM filter eenheid. Winkel bij-20 ° C.
    2. Bereiden 1M CaCl2. Filtreer de oplossing via een 0,22 µM filter. Bewaren bij 4 ° C.
  2. Let op de platen die een dag voorafgaand werden zaadjes. Cellen zijn klaar voor Transfectie zodra ze 70-80% confluentie bereiken.
  3. Oude media aan de platen gecombineerd en zachtjes toevoegen vers bereide media zonder serum.
    Opmerking: Zie Aanvullende bestand 1-plasmiden voor meer informatie over het gekozen plasmiden en hun voorbereiding.
  4. Bereid de plasmide mix door aliquoting de vier plasmiden in een conische buis 15 mL. Gebruik voor een preparaat dat enkel 15 cm schotel, 37.5 µg voor de CRISPR/Cas9-overdracht vector (pBK198 of pBK189), 25 µg pBK43 (psPAX2-D64E), 12,5 µg pMD2.G en 6,25 µg pREV (Figuur 1 c).
  5. Voeg 312.5 µL CaCl 1M2 aan de plasmide-mix. Voeg aan dit, tot 1,25 mL steriele dd-H20.
  6. Langzaam (drop-wise) Voeg 1,25 mL 2 x BBS oplossing terwijl vortexing de mix. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Voeg het mengsel van de transfectie ontkleuring aan elke plaat 15-cm (2,5 mL per plaat). De platen zachtjes Swirl en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2-3 uur. Daarna, voeg 2,5 mL (10%) serum per plaat en blijven broeden overnachting (12-18 h).
    Opmerking: Sommige labs kunnen 3% CO2 starterscentra media pH stabiliseren. Echter, wij niet respecteren geen verschil in Transfectie efficiëntie tussen 3% en 5% CO2. Ook is de grootte van CaPO4 precipitaten cruciaal voor Transfectie efficiëntie; de transfectie mix moet duidelijk vóór de toevoeging ervan op de cellen. Als de mix weer troebel tijdens de incubatie wordt, voor te bereiden verse 2 x BBS (pH = 6,95).

figure-protocol-1
Figuur 2: concentratie van de virale deeltjes met behulp van dubbel-sacharose kleurovergang protocol. Op kleurovergang sacharose verloop virale deeltjes verzameld uit het supernatant (SN) geladen. 70%, 60%, 30% en 20% sacharose oplossingen worden gebruikt voor het maken van het verloop. Na centrifugeren, de deeltjes verzameld uit de 30-60% sacharose breuken zijn verder geladen op een 20% sacharose kussen en neergeslagen. De laatste pellet met gezuiverde virale deeltjes is geresuspendeerde in 1 x PBS voor verder gebruik (zie tekst voor nadere bijzonderheden). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

3. overmorgen transfectie

  1. Observeer de cellen om ervoor te zorgen dat ze zijn bijna 100% confluentie op dit punt met weinig tot geen celdood. Media te vervangen door 25 mL van de verse DMEM + 10% serum aan elke plaat toe te voegen. Blijven incuberen bij 37 ° C met 5% CO2 voor een extra 48 uur.
    Opmerking: Het volume van media in stap 3.1 als met behulp van meer dan zes 15 cm platen (zie stap 5.2, opmerking).

4. oogsten Virus

  1. Zorgvuldig verzamelen het supernatant van alle weefselkweek platen met de transfected cellen met behulp van een steriele 10 mL weefselkweek pipet en een zwembad in 50 mL centrifuge buizen.
  2. Schakel de opschorting door centrifugeren bij 400-450 x g gedurende 10 minuten met behulp van een tafelblad centrifuge. Filteren van het supernatans dat door een 0,45 µm vacuüm filter eenheid.
    Opmerking: Het gefilterde supernatant kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal 4 dagen voordat u verdergaat met concentratie, of aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C. De verwachte titers van IDLV-Sp1-CRISPR/Cas9 (niet-geconcentreerd) virale preparaten moeten worden ~ 2 x 107 TU/mL (zie stap 6 voor bepaling van de titer). Echter te vermijden dat de virale voorbereidingen voor meerdere cycli bevriezen-ontdooien, als elke ronde van bevriezen en ontdooien van resultaten in een 10-20% verlies in functionele titers.

5. de concentratie van virale deeltjes door ultracentrifugatie

Opmerking: Wij gebruiken een dubbel-sacharose methode van zuivering dat bestaat uit twee stappen: een kleurovergang stap van sacharose en een sacharose kussen (Figuur 2).

  1. Laden van de conische ultracentrifugatie buizen in de volgende volgorde naar een sacharose verloop maken: 0,5 mL 70% sucrose (ontbonden 1 x PBS), 0,5 mL 60 gewichtspercenten sacharose (ontbonden in DMEM), 1 mL 30% sucrose (ontbonden in DMEM) en 2 mL 20% sucrose (opgelost in 1 x PBS).
  2. Voeg het supernatant virus-bevattende zorgvuldig op het verloop. Aangezien het totale volume van het supernatans dat uit vier 15 cm platen 100 mL, gebruik maken van zes ultracentrifugatie buizen per draai voor het verwerken van het volledige volume van het supernatant virus.
    1. Elke ultracentrifugatie buis gebruikt voor deze stap heeft een capaciteit van het volume van maximaal 30 mL (met inbegrip van het volume van sucrose), het verspreiden van de virale supernatant even onder buizen, verlaten van ten minste 10% headspace ter voorkoming van lekkages.
    2. Stel het volume van de cultuur tot ~ 20-22 mL per plaat bij het gebruik van meer dan vier 15 cm platen voor elk experiment, zodat het uiteindelijke volume van het supernatans dat gepoolde virale gemakkelijk kan worden opgevangen binnen zes ultracentrifugatie buizen.
    3. Opvulling ultracentrifugatie buizen aan ten minste drie vierden hun totale volumecapaciteit, anders breuk van buizen tijdens centrifugeren, wat resulteert in mogelijke verlies van monster en/of apparatuur schade kan optreden.
  3. Evenwicht van de buizen met 1 x PBS en centrifuge monsters bij 70.000 x g gedurende 2 uur op de 17 ° C (Zie Tabel van materialen voor rotor details).
    Opmerking: Voorkom verstoring van de sucrose laag tijdens acceleratie en stel de ultracentrifuge langzaam de rotor om naar te versnellen 200 rpm tijdens de eerste 3 min van de spin. Ook stelt de ultracentrifuge langzaam vertragen de rotor van 200 rpm tot 0 TPM meer dan 3 min aan het einde van de spin.
  4. Zorgvuldig verzamelen 30-60% sacharose breuken in schone buizen (Figuur 2). Toevoegen van koud 1 x PBS naar de gepoolde breuken en breng omhoog het volume tot 100 mL; Meng door pipetteren op en neer meerdere malen.
  5. Ga naar de sacharose kussen stap door zorgvuldig stapelen de virale voorbereiding op een kussen van sacharose. Voeg hiervoor 4 mL 20% sucrose (in 1 x PBS) aan de buis, gevolgd door ~ 20-25 mL van de virale oplossing per buis. Als buizen minder dan driekwart zijn vol, bovenaan omhoog met steriele 1 x PBS.
  6. Zorgvuldig evenwicht en centrifugeer de monsters bij 70.000 x g gedurende 2 uur op de 17 ° C, als voorheen. Giet af het supernatant en laat de resterende vloeistof door het omkeren van de buizen op keukenpapier uitlekken.
  7. Resterende druppels gecombineerd om het verwijderen van alle vloeistof uit de pellet. Bij deze stap moet de pellets virus-bevattende nauwelijks zichtbaar als kleine doorschijnende vlekken.
  8. Resuspendeer pellets door 70 µL van 1 x PBS toe te voegen aan de eerste buis en grondig pipetteren de schorsing, daarna de schorsing overbrengen naar de volgende buis en mengen als eerst, totdat alle de pellets zijn geresuspendeerde.
  9. Spoel de buizen met een extra 50 µL van koude 1 x PBS en mix als voorheen. Ervoor zorgen dat het gezamenlijke volume van de definitieve opschorting ~ 120 µL en iets melkachtig verschijnt; Schakel het door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 30 s op een tafelblad microcentrifuge.
  10. Het supernatant overbrengen in een verse microfuge buis, maak 10 µL aliquots en sla ze op-80 ° C.
    Opmerking: Vermijd het herhaaldelijk bevriezen-ontdooien cycli wilt uitvoeren op de lentivirale monsters. Behalve wanneer centrifugeren vereist is, moeten inspanningen worden gemaakt voor het uitvoeren van de resterende stappen in weefselkweek afzuigkappen of aangewezen weefselkweek kamers met behulp van passende bioveiligheid maatregelen (zie discussie).

6. de schatting van virale Titers

  1. p24 -enzym-verbonden immunosorbent assay (ELISA) methode
    Opmerking: De bepaling is uitgevoerd met behulp van hoge-bindende 96-wells-platen als per de instructies van de NIH AIDS vaccin programma voor HIV-1 p24 antigeen-Capture-Assay Kit (Zie Tabel van materialen) met wijzigingen29.
    1. De volgende dag was de putjes drie keer met 200 µL 0,05% Tween-20 in koude PBS (PBS-T-oplossing). Jas van de plaat met 100 µL van monoklonaal anti-p24 antilichaam bij een verdunning 1:1500 in 1 x PBS en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    2. Om te elimineren niet-specifieke binding, blokkeren de plaat met 200 µL 1% BSA in PBS; wassen drie keer met 200 µL 0,05% Tween-20 in koude PBS (PBS-T oplossing) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
    3. Bereiden monsters: Voor geconcentreerde vector preparaten, verdund 1 µL van het monster 100-fold door toevoeging van 89 µL van dd-H20 en 10 µL van Triton X-100 (eindconcentratie van 10%). Voor niet-geconcentreerde preparaten voorbereiden tienvoudige verdunde monsters (Voeg 80 µL van dd-H20 en 10 µL van Triton X-100 (eindconcentratie van 10%) aan 10 µL van het monster).
      Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C bij deze stap voor een langere periode van tijd voor later gebruik.
    4. HIV-1 normen voor te bereiden door een 2-fold seriële verdunning (met een startende concentratie 5 ng/mL) toe te passen.
    5. Verdunnen van de geconcentreerde monsters (uit 1:100 vooraf verdunde voorraden) in RPMI 1640 aangevuld met 0,2% tween-20 en 1% BSA om 1:10, 000, 1:50 000, en verdunningen van de 1:250,000. Niet-geconcentreerde monsters verdund (van 1:10 vooraf verdund voorraden) in RPMI 1640 aangevuld met 0,2% tween-20 en 1% BSA om 1:500, 1:2500 en 1:12,500 verdunningen.
    6. Monsters van toepassing op de plaat in triplicates en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    7. De volgende dag was de putjes goed zesmaal en Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur met 100 µL polyklonale konijn anti-p24 antilichaam, verdunde 1:1000 in RPMI 1640 10% FBS, 0,25% BSA en 2% normale muis serum (NMS).
    8. Wassen zesmaal als hierboven en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur met geit anti-konijn mierikswortelperoxidase IgG verdund 1:10,000 in RPMI 1640 aangevuld met 5% normale geit serum, 2% NMS 0,25% BSA en 0,01% tween-20.
    9. Wassen van de plaat, zoals hierboven, en broeden met TMB peroxidase substraat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
    10. Zet de reactie stop door 100 µL van 1 N HCL toe te voegen. Meten van de extinctie van het monster bij 450 nm met behulp van de extinctie plaat lezer.
  2. Meting van de intensiteit van de fluorescentie verslaggever
    1. FACS methode
      Opmerking: De omvang van GFP signaal uitputting in cellen kan nauwkeurig worden geraamd door het meten van de gemiddelde fluorescentie intensiteit van de getransduceerde cellen via stroom cytometry. Gelieve te verwijzen naar de recente papier 28 voor FACS data-analyse, presentatie en interpretatie. Het protocol is als volgt beschreven.
      1. Maak een tienvoudige seriële verdunning van het preparaat (vanaf 10-1 op 10-5) van het virale preparaat in 1 x PBS.
      2. Beënt, ongeveer 5 x 10,5 293T cellen in elk putje van de plaat van een 6-well in een eindvolume van 2 mL per putje. 10 µL van elke virale verdunning toevoegen aan de cellen en cellen bij 37 ° C gedurende 48 uur uit te broeden.
      3. Oogsten van cellen voor FACS analyse als volgt: Voeg 200 µL trypsine-EDTA-oplossing 0,05% en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 min. toevoegen 2 mL van een volledige DMEM media en het verzamelen van monsters in 15 mL conische buizen.
      4. Pellet cellen door centrifugeren bij 400 x g bij 4 ° C en resuspendeer de pellet in 500 µL van koude 1 x PBS.
      5. Voor fixatie, voeg een gelijk volume van 4% formaldehyde-oplossing tot deze schorsing en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      6. Pellet vaste cellen en resuspendeer in 1 mL 1 x PBS. Analyseren van GFP expressie met behulp van een instrument van FACS, zoals beschreven in Ortinski et al. 28 kort, gebruik de volgende formule om te bepalen van het virus functionele titer:
        figure-protocol-2
        Opmerking: Hier GS = aantal GFP-positieve cellen geteld; TN = totaal aantal cellen geteld; N = totaal aantal cellen getransduceerde; V = volume (in µL) dat wordt gebruikt voor signaaltransductie. Bijvoorbeeld: als 1 x 106 cellen werden getransduceerde met 10 µL van virus, 2 x 104 cellen waren geteld en 5 x 103 GFP-positieve, op basis van de bovenstaande vergelijking, de functionele titer zou:
        figure-protocol-3
    2. GFP-positieve cellen tellen
      1. Bereken de veelheid van infectie (MOI) gebruikt voor signaaltransductie. Test een breed scala van MOIs (1-10), met toenemende MOIs wat resulteert in een hogere efficiëntie van de transductie.
      2. Zaad vóór transfectie, een 6-well plaat met ongeveer 3-4 x 105 cellen per putje. Zodra de cellen bij > 90% confluentie (meestal binnen 24 uur), transduce met het gezuiverde virus op vooraf bepaalde MOIs.
      3. Incubeer plaat bij 37 ° C met 5% CO2 in een standaard weefselkweek en monitor cellen met regelmatige tussenpozen gedurende 1-7 dagen voor wijzigingen in GFP signaal.
      4. Het aantal GFP-positieve cellen tellen met een fluorescente microscoop (PLAN 4 X doelstelling, 0.1 N.A, 40 X vergroting) uitgerust met een GFP filter set (excitatie golflengte-470 nm, emissie golflengte-525 nm) met naïef (un-getransduceerde) cellen in te stellen van de bevolking GFP-negatieve en positieve cellen.
      5. Een schatting van de uiteindelijke titer door aan te passen voor de verdunningsfactor en het volume, met de volgende formule:
        figure-protocol-4
        Opmerking: Hier, N = aantal GFP-positieve cellen, D = verdunningsfactor, M = vergrotingsfactor (meestal 20 X), V = volume van de gebruikte voor signaaltransductie virus. Bijvoorbeeld, voor 20 GFP-positieve cellen (N) geteld bij een verdunning van 10-4 (1:10, 000) in een 10 µL monster (V) bij 20 X vergroting (M) (D) zou resulteren in een functionele titer van (20 x 10,4) x (20) x (10) x (100 *) = 4 x 108 TU/mL.
        (* aan te passen aan per mL)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Validatie van de knock-out-efficiëntie van IDLV-CRISPR/Cas9 vectoren
We gebruikten GFP-uiting van 293T cellen als een model voor het valideren van de efficiëntie van CRISPR/Cas9-gemedieerde gene knock-out. GFP + cellen werden gegenereerd door transductie van HEK-293T cellen met lolploeg-GFP (vBK201a) bij een MOI van 0,5 (Figuur 3b, "neen-virus" paneel). De sgRNA-naar-GFP/Cas9 alles-in-één vector cassette was verpakt in IDLV of ICLV deeltje...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

IDLVs zijn begonnen te ontstaan als het voertuig van keuze voor in vivo gen-bewerking, met name in het kader van genetische ziekten, grotendeels als gevolg van het geringe risico van mutagenese gekoppeld aan deze vectoren in vergelijking met de integratie van levering platformen22 , 28. in het huidige manuscript, wij willen het protocol die samenhangen met de opwekking van het verbeterde alles-in-één IDLV-CRISPR/Cas9-systeem, dat onlangs in ons laborator...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Patent USC-499-P (1175) werd ingediend door de Universiteit van South Carolina met betrekking tot het werk beschreven in dit manuscript.

Dankbetuigingen

We zouden graag bedanken het departement van neurobiologie, Duke University School of Medicine en Dean's Bureau voor fundamentele wetenschap, Duke University. Wij danken ook leden van de Duke virale-Vector kern voor opmerkingen op het manuscript. Plasmide lolploeg CRISPRv2 was een geschenk van Feng Zhang (brede Instituut). De LV-verpakkingen systeem met inbegrip van de psPAX2 van plasmiden, was VSV-G, pMD2.G en pRSV-Rev een soort geschenk van Didier Trono (EPFL, Zwitserland). Financiële steun voor dit werk werd verstrekt door de University Of South Carolina School Of Medicine, verlenen RDF18080-E202 (B.K).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Optima XPN-80 UltracentrifugeBeckman CoulterA99839
Allegra 25R tafelcentrifugeBeckman Coulter369434
xMark Microplate Absorbance plate readerBio-Rad1681150
BD FACSBecton Dickinson338960
Omgekeerde fluorescentiemicroscoopLeicaDM IRB2
0,45-μm filterunit, 500mLCorning430773
Ultracentrifugeerbuizen met conische bodemSeton Scientific5067
Adapters voor conische buizenSeton ScientificPN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotorBeckman Coulter369650
15 mL conische centrifugeerbuizenCorning430791
50mL conische centrifugeerbuizenCorning430291
High-binding 96-well platenCorning3366
150 mm TC-behandelde celcultuurschalen met 20 mm rasterCorning353025
100mm TC-behandelde kweekschaalCorning430167
0,22 μM filterunit, 1LCorning430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
Weefselcultuur pipetten, 5 mLCorning4487
Weefselcultuur pipetten, 10 mLCorning4488
Weefselcultuur pipetten, 25 mLCorning4489
Hemacytometer met dekselsCole-ParmerUX-79001-00
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Celcultuurreagentia
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cellenATCCCRL-3216
293FT cellenThermo Fisher ScientificR70007
DMEM, hoge glucose mediaGibco11965
Cosmic Calf SerumHycloneSH30087.04
Antibioticum-antimycotic oplossing, 100XSigma AldrichA5955-100ML
NatriumpyruvaatSigma AldrichS8636-100ML
Niet-essentiële aminozuur (NEAA)HycloneSH30087.04
RPMI 1640 mediaThermo Fisher Scientific11875-085
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Trypsine-EDTA 0,05%Gibco25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethaansulfonzuur)Sigma AldrichB9879 - BES
GelatineSigma AldrichG1800-100G
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
p24 ELISA reagentia
Monoklonaal anti-p24 antilichaamNIH AIDS Research and Reference Reagent Program3537
HIV-1 standaardenNIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP968F
Polyklonaal konijn anti-p24 antilichaamNIH AIDS Research and Reference Reagent ProgramSP451T
Geiten anti-konijn paardenradenperoxidase IgGSigma Aldrich12-348Werkconcentratie 1:1500
Normaal muis serum, sterieel, 500mLEquitech-BioSM30-0500
Geiten serum, sterieel, 10mLSigmaG9023Werkconcentratie 1:1000
TMB peroxidase substraatKPL5120-0076Werkconcentratie 1:10.000
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Plasmids
psPAX2Addgene12260
pMD2.GAddgene12259
pRSV-RevAddgene12253
lentiCRISPR v2Addgene52961
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Restrictie-enzymen
BsrGINew England BiolabsR0575S
BsmBINew England BiolabsR0580S
EcoRVNew England BiolabsR0195S
KpnINew England BiolabsR0142S
PacINew England BiolabsR0547S
SphINew England BiolabsR0182S

Referenties

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146(2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987(2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968(2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147(2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27(2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O'Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
  37. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products - Revisiting Current FDA Recommendations. , Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017).
  38. CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017).
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CRISPR Cas9 gen knockoutproductie van virale vectorenzuivering door ultracentrifugatiescheiding via sucrosegradi ntp24 ELISA assayHEK 293T transductiekwantificering van virale titercalciumfosfaattransfectieconcentratie van virale deeltjes
Een Protocol voor de productie van Integrase-deficiënte lentivirale vectoren voor CRISPR/Cas9-gemedieerde Gene knock-out in cellen verdelen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.